CN115820740A - 用于治疗ⅱ型粘多糖贮积症的重组腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种携带IDS基因表达框的重组腺相关病毒载体及其在治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的应用。

Description

用于治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的重组腺相关病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种携带IDS基因表达框的重组腺相关病毒载体及其在治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的应用。

背景技术

粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是一类因溶酶体内相关的酸性水解酶缺乏或活性降低使酸性黏多糖(也称糖胺聚糖，glycosaminoglycan，GAG)无法降解或降解不完全，导致GAG及其中间代谢产物在体内堆积引起的严重致残、致死的单基因遗传性代谢病。

根据溶酶体分解酶缺陷及贮积粘多糖种类的不同，目前可将MPS分为7大型，包括：MPSⅠ型(含ⅠH、ⅠS、ⅠH/S三种亚型)，MPSⅡ型(含ⅡA、ⅡB两种亚型)，MPSⅢ型(含ⅢA、ⅢB、ⅢC、ⅢD四种亚型)，MPSⅣ型(含ⅣA、ⅣB两种亚型)，MPSⅥ型(含ⅥA、ⅥB两种亚型)，MPSⅦ型，MPSⅨ型。中国以MPSⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ四型较常见。

Ⅱ型粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidosis typeⅡ，MPSⅡ)也称为Hunter综合征，是粘多糖贮积症中唯一的X染色体连锁隐性遗传疾病，是一种罕见的遗传病，发病率约为0.38/10万～1.09/10万，欧洲国家的发病率通常低于东亚国家，在东亚国家中，MPSⅡ发病率约占所有粘多糖贮积症(MPS)的50％。患者的溶酶体缺乏艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(iduronate 2-sulphatase，I2S)，导致硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)这两种糖胺聚糖(GAGs)的病理积累和大多数器官系统(包括大脑)的功能障碍。

MPSⅡ患者会在大多数器官系统中受到不同程度的影响，疾病表现出显著的异质性。根据MPSⅡ的临床表现分为轻型和重型两种，其中重型约占2/3。共同的临床体征和症状包括尿GAGs(uGAGs)水平发生变化，面部粗糙，骨骼畸形和关节僵硬，生长迟缓导致的身材矮小，呼吸系统和心脏损伤，包括弥漫性瓣膜病，腹股沟和脐疝以及肝脾肿大等。患者也有耳鼻喉表现包括听力丧失、腺扁桃体肥大、频繁的耳和上呼吸道感染、睡眠障碍、阻塞性呼吸暂停和视网膜恶化等。重型患者存在神经系统疾病，主要表现为认知障碍和严重的行为问题。患者通常在出生时表现正常，体征通常在2至4岁开始出现，重型患者的体征通常较早出现，轻型患者体征/症状进展缓慢，没有或较少存在认知问题，并且没有行为障碍。在主要的临床改变中，心肺衰竭通常是死亡的原因，严重形式发生在成年之前，而轻度形式的可以存活到成年后期。

在病因学上，MPSⅡ是由于IDS基因突变引起，所述突变导致溶酶体内I2S酶活性降低或消失，继而导致HS、DS在溶酶体内累积，从而致使细胞和器官损伤，使患者发生进行性细胞和多器官功能障碍。IDS基因，位于Xq28，CDS全长1653bp，该基因编码一个550个氨基酸的多肽，该多肽被加工后形成艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(iduronate 2-sulphatase，I2S)蛋白。成熟形式是单体，大小为76kDa，由两个亚结构域组成(42kDa的重链和14kDa的轻链)。在溶酶体内催化硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)中2-O-磺基-α-L-艾杜糖醛酸残基的C2-硫酸酯键的水解。IDS为管家基因，在全身各脏器广泛表达，其中中枢神经系统中总体表达量较高。

MPSⅡ的治疗一直是姑息性的，专注于体征和症状的治疗。自从分别于1970年代和1990年代发现该疾病的生化和遗传基础以来，已经进行了许多研究，采用了不同的策略，目的是开发针对该疾病的特定疗法。这些努力导致1980年代的造血干细胞移植(HSCT)和2006年的酶替代疗法(ERT)进入临床实践。尽管这些治疗策略(主要是ERT)如今已用作MPS的治疗可选方案，关于其应用的有效性和安全性，还有许多问题尚待解决。

MPSⅡ的ERT治疗目前可以使用两种不同的重组酶：Elaprase，于2006年获得美国食品药品监督管理局的批准；以及艾杜糖硫酸酯酶beta，于2012年获得韩国食品药品监督管理局的批准。两种酶显示出类似的生物化学和物理化学性质，临床前研究显示两者在降低器官GAG水平方面具有相似的分布和功效，但艾杜糖硫酸酯酶beta表现出更高特异性的酶活性，可以更快通过细胞摄取以及降低抗药物抗体的形成。ERT在某些组织中的功效有限，可以解释为治疗酶的生物利用度低，这是由于组织(如骨，软骨和心脏瓣膜)的血管化程度低，以及用于中枢神经系统治疗存在生物屏障(例如血脑屏障)。免疫反应会降低治疗效果。超过50％的患者产生抗IDS的IgG抗体，其中21％至35％的患者产生了中和性IgG抗体。ERT治疗费用昂贵。如ELAPRASE需每周给药一次，每年治疗费用高达30多万美元。

HSCT能够改善疾病的躯体和骨骼症状，对身高和体重的影响与ERT相同。一项研究评估了HSCT的长期效果，显示尿液GAG水平，心脏瓣膜反流，脑磁共振成像(MRI)萎缩，I类和Ⅱ类脑损伤以及日常生活活动(ADL)有所改善。但这些改善仅在脑萎缩和心脏瓣膜反流发生之前接受治疗的患者中观察到。通过一次性给药，HSCT将显著帮助降低ERT每周给药的治疗费用。HSCT费用为70,000至205,000美元，但寻找捐助者的时间和成本高昂，此外受供体细胞类型影响的手术成功率以及并发症包括感染，器官衰竭，移植排斥，GVHD等影响，HSCT有相对较高的死亡率。

AAV由于其稳定性、长期表达和低免疫原性，已经成为MPS基因治疗中最常用的病毒工具。Monica Cardone(Correction of Hunter syndrome in the MPSII mouse modelby AAV2/8-mediated gene delivery.Human Molecular Genetics,2006,Vol.15,No.71225–1236)首次在在MPS II中使用基于AAV载体的基因治疗，使用AAV2/8载体，将其静脉注射给成年MPS II小鼠。治疗后小鼠的酶活性得到完全恢复，血浆、脾脏、肺、心脏、肾脏、大脑和肌肉中的GAG存储被完全清除，骨骼畸形也得以正常化。然而，小鼠在野外测试中表现不佳，行走方式受到严重损害；此外，还表现出神经病理学缺陷。Sandra Motas等(CNS-directed gene therapy for the treatment of neurologic and somaticmucopolysaccharidosis type II(Hunter syndrome),JCI Insight.2016；1(9):e86696.doi:10.1172/jci.insight.86696.)使用携带IDS基因的AAV9病毒载体通过向MPSII小鼠的脑脊液内注射，在治疗4个月后，产生了整个脑脊液中IDS活动的显著增加，并逆转了中枢神经系统的病理。Laoharawee等(Prevention of Neurocognitive Deficiency inMucopolysaccharidosis Type II Mice By CNS-Directed,AAV9-Mediated IduronateSulfatase Gene Transfer,Human Gene Therapy,DOI:10.1089/hum.2016.184)随后的研究也获得了类似的结果，在该研究中采用了脑室内注射，并比较了鞘内注射和静脉注射给药方式。在注射后28周在大多数外围器官中观察到高水平的IDS(比野生型高160倍)，在注射后10个月比野生型高达270倍，但只有低水平(野生型的7％至40％)的IDS出现在大脑的所有区域。

鉴于目前MPSII疾病治疗手段的局限性和高昂的价格，本领域仍需要预防和/或治疗MPSII的备选疗法，尤其是备选的基因疗法，该基因疗法优选能够在体内高效且优选长期地表达功能性IDS蛋白、且表达的功能性IDS可有效扩散至患者的全身，对脑部和外周组织的病变实现有效改善，同时在患者体内具有低的抗药免疫反应性。

发明内容

本发明提供一种基于AAV载体的新型MPSⅡ疾病基因治疗药物，药物包含携带人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)基因表达构建体的AAV载体。在基因表达构建体中，使用本申请人所设计的启动子调控IDS基因的高效表达。本发明药物通过侧脑室(ICV)注射后能够在体内高效表达IDS蛋白，显著提高细胞内IDS蛋白的含量，参与水解溶酶体中过量贮积的粘多糖，使细胞中硫酸乙酰肝素的含量大幅下降，达到并维持正常水平，从而达到治疗MPSⅡ的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种治疗MPSⅡ疾病的基因治疗方法和药物组合物，其特征在于，所述方法和药物组合物基于重组AAV载体，利用AAV载体能高效地将药物效应元件导入体内，实现治疗作用产物蛋白IDS的高效表达。在一个实施方案中，为了实现IDS蛋白的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，选择重组AAV的血清型，优选地，在一个实施方案中，选择可以突破血脑屏障限制的AAV9作为载体。

在一些实施方案中，本发明提供的治疗MPSⅡ疾病的基因治疗方法和药物组合物，其特征在于，基于设计的IDS基因表达构建体，实现IDS蛋白在受试者多种组织(包括，但不限于，脑部和外周组织，例如心脏、肝脏、脾、肺、肾、肌肉、肠道)中的高效表达。

在再一些实施方案中，本发明的治疗MPSⅡ疾病的基因治疗方法和药物组合物，其特征在于，所述重组AAV病毒载体携带的IDS基因表达构建体包含SEQ ID NO:1的CAR-Mut启动子或与其具有至少90％同一性的启动子。采用所述CAR-Mut启动子调控IDS基因转录，使IDS基因能够在多种细胞中高效转录，在受试者中实现全身广泛性表达。

在再一些优选实施方案中，所述表达构建体包含天然人IDS基因序列，优选地还包含在所述IDS基因序列的翻译起始密码子前添加的Kozak序列5’-GCCACC-3’。

在另一些优选实施方案中，本发明提供的MPSⅡ疾病基因治疗方法和药物组合物，其特征在于，在所述表达构建体中，IDS基因3’端添加MicroRNA 142-3p序列降低其在抗原提呈细胞中的表达，以减少药物体内注射后引起的免疫反应。

在再一些优选实施方案中，本发明提供的MPSⅡ疾病基因治疗方法和药物组合物，其特征在于，将药物组合物经侧脑室(ICV)注射。如本申请实施例中所展示，ICV注射包含本发明重组AAV病毒载体的药物组合物至IDS基因缺陷模型小鼠体内后，能在小鼠体内高效持续稳定地表达IDS蛋白，表达产生的IDS蛋白参与细胞内的硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素的水解，降低其在细胞中的积累，并使其维持在正常水平。从而消除细胞中由硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素过多的积累导致的各种疾病症状，达到治疗目的。

在再一些优选实施方案中，本发明提供的MPSⅡ疾病基因治疗方法和药物组合物，其特征还在于，一次给药能够长期持续地使受试者细胞高效表达IDS蛋白，参与水解过多的硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素，使GAG在细胞中维持在正常水平，从而达到长时间的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1：pRDAAV-CMV-EGFP载体结构示意图。由本研究所基于AAV载体pAAV2neo(ZhouQ,et al.2017,“Deletion of the B-B'and C-C'regions of inverted terminalrepeats reduces rAAV productivity but increases transgene expression.”Scientific reports vol.7,1 5432.14 Jul.2017)构建而来。ITR，inverted terminalrepeat，两侧的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。EGFP，增强型绿色荧光报告基因。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。该载体含有多个限制性酶切位点。

图2：pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，两侧的反向末端重复序列。CAR-Mut promoter，人为设计的启动子。EGFP，增强型绿色荧光报告基因。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。

图3：pRDAAV-CAR-Mut-IDS载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，两侧的反向末端重复序列。CAR-Mut promoter，人为设计的启动子。IDS，人艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶基因。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。

图4：pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，两侧的反向末端重复序列。CAR-Mut promoter，人为设计的启动子。IDS，人艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶基因。142-3P，MicroRNA 142-3P序列。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。

图5：pRDAAV-CAR-Mut-IDS与pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P质粒转染HEK-293细胞后IDS蛋白酶活检测结果。空白细胞,未转染的HEK-293细胞。pRDAAV-CAR-Mut-IDS与pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P,分别转染了pRDAAV-CAR-Mut-IDS或pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P质粒的HEK-293细胞。

图6：rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P尾静脉注射成年野生型小鼠后，组织IDS酶活检测结果。High，rAAV9高剂量5×10¹³GC/kg给药的野生型小鼠；low，rAAV9低剂量1×10¹³GC/kg给药的野生型小鼠；wt,注射PBS的野生型小鼠。

图7：rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P侧脑室注射新生小鼠后，组织IDS酶活检测结果。rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，分别注射rAAV9-CAR-Mut-IDS或rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠；MPS模型小鼠，注射PBS的模型小鼠；wt,注射PBS的野生型小鼠。

图8：rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P侧脑室注射新生小鼠后，股四头肌病理检测结果，A为注射PBS的野生型小鼠，B为注射PBS的IDS纯合模型小鼠，C为注射rAAV9-CAR-Mut-IDS的IDS模型小鼠，D为注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠。

图9：rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P侧脑室注射新生小鼠后，组织GAG含量检测结果。Wt,小鼠注射PBS的野生型小鼠。MPS模型鼠，注射PBS的IDS纯合模型小鼠。rAAV9-CAR-Mut-IDS，注射rAAV9-CAR-Mut-IDS的IDS模型小鼠。rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠。

图10：侧脑室注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P、rAAV9-CB7-hIDS和rAAV9-CAG-hIDS新生小鼠后，组织IDS酶活检测结果。Wt，注射PBS的野生型小鼠。MPS模型鼠，注射PBS的IDS纯合模型小鼠。rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠。rAAV9-CB7-IDS，注射rAAV9-CB7-hIDS的模型小鼠。rAAV9-CAG-IDS，注射rAAV9-CAG-hIDS的模型小鼠。

图11：侧脑室注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P、rAAV9-CB7-hIDS和rAAV9-CAG-hIDS新生小鼠后，在自小鼠采集的血清样品中测量的抗IDS抗体滴度。Wt，注射PBS的野生型小鼠。MPS模型鼠，注射PBS的IDS纯合模型小鼠。rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠。rAAV9-CB7-IDS，注射rAAV9-CB7-hIDS的模型小鼠。rAAV9-CAG-IDS，注射rAAV9-CAG-hIDS的模型小鼠。

发明详述

本发明公开了用于预防和/或治疗Ⅱ型粘多糖贮积症(MucopolysaccharidosistypeⅡ，MPSⅡ)受试者的基因治疗构建体、药物组合物和方法，尤其是用于递送IDS的重组AAV载体的构建、制备及应用。

除非下文中另外定义，否则本说明书中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

定义

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。该术语也旨在涵盖在指定数字±1％,±0.5％，或±0.1％范围内的数值。

在本文中，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。

在本文中，表述“第一”、“第二”或“第三”等用于在所述及的要素之间进行区分，并且除非另有说明，这些表述并不指示要求所述要素具有特定的数量或以任何特定顺序或位置存在。

在本文中，表述“和/或”用于表示所列相关项目中的任何一个、或所列相关项目中的多个的任何和所有可能的组合。

术语“艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(iduronate 2-sulphatase)”或“I2S”或“IDS”在本文中可互换使用，指：能在溶酶体中导致糖胺聚糖(GAGs)，硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)，降解的溶酶体酶。

IDS的例子包括但不限于，具有全长野生型(天然)人IDS(如Unipro数据库登录号UniProtKB-P22304所示)的氨基酸序列的酶蛋白、其成熟形式、其变体(例如，具有保守氨基酸置换的变体)、及其片段。登录号P22304下的人IDS全长氨基酸序列中，氨基酸残基aa1-25为信号肽序列，氨基酸残基26-33为前肽序列(propeptide)，氨基酸残基34-550为成熟肽(包括42kDa的重链和14kDa的轻链)。在本文中，可以应用IDS的全长氨基酸序列，也可以使用其变体和片段，只要所述变体或片段保留水解GAG，尤其是硫酸皮肤素(DS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)的活性，并例如提供至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或大约相同、或大于100％的全长野生型(天然)人IDS的酶活性水平。hIDS的功能(活性)可以在适宜的体外测定试验中测量，例如，使用4MU-艾杜糖醛酸酶测定试验，测量待测hIDS酶活性蛋白切割荧光底物4-甲基伞形酮a-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸的能力。参见例如www.RnDSysems.com上的活性测定方案；或者Laoharawee等(Prevention ofNeurocognitive Deficiency in Mucopolysaccharidosis Type II Mice By CNS-Directed,AAV9-Mediated Iduronate Sulfatase Gene Transfer,Human Gene Therapy,DOI:10.1089/hum.2016.184)等中描述的活性测定方案。

在本发明的一个实施方案中，IDS多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或SEQ IDN:10的残基1-550的氨基酸序列；SEQ ID NO:10的残基26-550的氨基酸序列，SEQ ID NO:10的残基34-550的氨基酸序列，或与前述序列之任一具有至少90％，或至少95％，96％，97％，98％，99％或更高同一性的氨基酸序列。人IDS多肽的头25个氨基酸是溶酶体蛋白和分泌蛋白的典型信号肽。IDS可以通过该信号肽靶向溶酶体。因此，在一个实施方案中，本发明IDS多肽包含靶向溶酶体的信号肽，例如来自人IDS多肽的天然信号肽序列。在另一实施方案中，本发明IDS多肽包含来自异源溶酶体靶向蛋白的信号肽。

在本发明的一些实施方案中，编码IDS多肽的多核苷酸序列包含野生型IDS核酸序列。在本发明的再一实施方案中，编码IDS多肽的多核苷酸序列，可以根据需要，进行密码子优化，以用于例如增强所述多核苷酸在体内的表达和/或稳定性。优选地，编码IDS的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。

术语“ETR”或“酶替换治疗”在本文中是指，用于MPSII治疗的一种治疗程序，其中重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性蛋白被施用于有需要的受试者。在一个实施方案中，所述重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性蛋白为Elaprase或艾杜糖硫酸酯酶beta。

如本文中所用，术语“保守性”氨基酸或核苷酸改变是指，导致包含所述氨基酸或核苷酸改变的蛋白质或核酸分子实质性地保持原有功能的中性或近中性氨基酸或核苷酸改变。例如，保守性氨基酸置换是将氨基酸置换或取代成侧链具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。这类保守性修饰的变体相对于多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。本领域技术人员可以通过常规技术手段，例如功能性测定试验，容易地检测一个特定多肽序列或核苷酸序列中的氨基酸或核苷酸改变的保守性。

术语“功能性连接”也称作“有效连接”，意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系中。

术语序列“同一性”用于描述两个氨基酸序列或多核苷酸序列之间的序列结构相似性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，可以将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。在一些实施方案中，宿主细胞是可以用来产生本发明重组AAV载体的任何类型的细胞系统，例如，哺乳动物细胞(例如适用于通过三质粒包装系统生产重组AAV的HEK 293细胞)和昆虫细胞(例如适用于通过杆状病毒包装系统生产重组AAV的sf9细胞)。

术语“调控序列”或“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其诱导、抑制或以其它方式控制与之有效连接的编码核酸序列的蛋白质转录。调控序列可以是例如起始序列、增强子序列、内含子序列和启动子序列等。

描述核酸或蛋白质时所用的术语“外源的”或“异源的”可互换使用，是指核酸或蛋白质不是天然存在于其存在的染色体或宿主细胞的位置。外源核酸序列也指衍生自并插入相同宿主细胞或受试者但以非天然状态存在的序列，例如，所述序列以不同的拷贝数存在，或处于不同调控元件的控制下。

在本文中，“分离的”多核苷酸(例如，分离的DNA或分离的RNA)是指，多核苷酸至少部分地从包含其的天然生物体或病毒的至少一些其他组分中分离出来。在一些实施方案中，“分离的”核酸相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，“分离的”多肽是指多肽至少部分地从包含其的天然生物体或病毒的至少一些其他组分中分离出来。在一些实施方案中，“分离的”多肽相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，“分离”或“纯化”病毒载体是指，病毒载体从包含其的起始材料的至少一些组分中被部分地分离出来。在一些实施方案中，“分离的”病毒载体相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，术语“病毒载体”是指，能够作为目的核酸的运载工具的病毒颗粒(例如AAV病毒颗粒)。通常，病毒载体包含衣壳和包装在其中的病毒基因组(例如，病毒DNA)，待递送的目的核酸插在病毒基因组中。在重组AAV病毒载体的情况下，为了产生可以将目的核酸递送至组织或细胞的重组病毒颗粒，通常仅需要在基因组中保留反向末端重复(ITR)顺式元件，而病毒包装所需的其余序列可以反式提供。因此，在一些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含衣壳和包装在其中的重组病毒基因组，其中所述重组病毒基因组包含或由位于两个AAV ITR序列之间的一个或多个外源核苷酸序列组成。位于重组病毒基因组5’和3’末端的两个ITR序列(即，5’ITR和3’ITR)可以相同或不同。

术语AAV“反向末端重复”(inverted terminal repeat,ITR)在本文中是指，来自AAV病毒基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用。天然AAV病毒的ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。该ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。最早分离到的AAV病毒，AAV2，具有位于基因组两端、长度145bp的呈回文-发卡结构的“反向末端重复序列”(ITR)。之后，在各种血清型的AAV病毒中发现不尽相同的ITR序列，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。基于这些野生型ITR序列的传统重组AAV病毒载体一般为单链AAV载体(ssAAV)，病毒基因组以单链形式包装在AAV衣壳中。与此类ssAAV不同，已经发现，通过改造ITR，删除AAV病毒的一侧ITR序列中的trs序列和任选地D序列，能够使包装得到的重组AAV病毒载体所携带的基因组自我互补，形成双链(Wang Z等人，Gene Ther.2003；10(26):2105-2111；McCarty DM等人，Gene Ther.2003；10(26):2112-2118)。由此包装得到的病毒为双链AAV病毒，即，scAAV(self-complementary AAV)病毒。scAAV病毒载体的包装容量更小，仅为ssAAV病毒载体包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。

在本文中，与AAV相关的该术语ITR涵盖野生型ITR和变体IRT。野生型ITR可以来自任何天然AAV病毒，例如AAV2病毒。野生型ITR中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。野生型ITR序列可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。在本文中，变体ITR是非天然的ITR序列，其可以例如来自任何野生型AAV ITR序列，并相对于野生型ITR包含一个或多个核苷酸的缺失、替代、和/或添加，和/或截短，但仍具有功能性，即，能够用于产生ssAAV病毒载体或scAAV病毒载体。在一些优选实施方案中，两个野生型ITR组合用于产生单链重组AAV病毒载体(ssAAV)。

AAV蛋白VP1,VP2和VP3是衣壳蛋白，其相互作用以形成AAV衣壳。不同血清型的AAV病毒具有不同的组织感染嗜性，可以通过选择重组AAV病毒载体衣壳的来源血清型，将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z等人，Mol Ther.2006；14(3):316-327)。在本发明中，重组AAV病毒载体可以通过选择衣壳的来源血清型，而具有不同的靶向性。在一些实施方案中，重组AAV病毒具有能够引导病毒跨血脑屏障转运的衣壳蛋白。在一个实施方案中，重组AAV病毒载体包含来自AAV9的衣壳。在再一个实施方案中，重组AAV病毒载体包含来自AAV9的衣壳和来自AAV2的ITR。

术语“免疫相关miRNA”是优先在免疫系统细胞，例如抗原提呈细胞中表达的miRNA。在一些实施方案中，免疫相关miRNA是miR-142-3P。不受任何理论的约束，携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对引入的基因治疗药物的免疫反应的概率。

术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给MPSII受试者后，优选在侧脑室施用后，降低受试者的多个受累组织(例如，外周组织如心脏、肝脏、脾、肺、肾、肌肉和小肠，以及脑部)中的溶酶体GAG贮积量。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给MPS II受试者后，优选在侧脑室施用后，改善受试者的脑部中枢神经系统损伤。

在本文中，“预防”包括对疾病或特定疾病的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有MPSII病发生倾向的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在疾病的至少一个症状发生前实施的医院干预。因此，在一个实施方案中，预防包括在具有IDS基因缺陷的受试者中于MPSII病的症状发生前的本发明基因治疗药物的施用，以延缓疾病发展或阻止疾病的出现。

以下对本发明的各个方面进行描述。

I.用于基因治疗的构建体

表达构建体

在一个方面，本发明提供了用于人IDS重组表达的构建体。尽管组成型启动子已经被提出在MPSII的基因治疗中使用，但是，本领域发现一些组成型启动子(例如CMV)并不能驱动期望水平的IDS表达(WO2017181113)。本发明的表达构建体使用本发明人经过深入研究所设计的人工合成的组成型启动子CAR-Mut。通过利用此高效启动子，通过侧脑室注射，本发明的构建体可以有利地实现IDS编码核酸序列在MPSII患者的广泛受累组织或细胞中的表达，降低MPSII患者的多种受累组织中的GAG水平。

因此，在一个实施方案中，本发明提供表达构建体，其包含以转录方向彼此功能性连接的如下元件：

-CAR-Mut启动子，

-编码人IDS的多核苷酸序列，和

-任选地，转录终止子。

在本发明表达构建体的一个实施方案中，CAR-Mut启动子包含或由SEQ ID NO：1的多核苷酸组成，或为其变体。优选地，所述变体与SEQ ID NO.1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性的多核苷酸，且在SEQ ID NO:1的核苷酸568位具有核苷酸C；并且所述变体与SEQ ID NO:1具有等同的启动子活性。本领域技术人员可以采用本领域已知的任何启动子功能性测定试验(例如荧光素酶报告基因表达测定试验)，来确定任何两个启动子是否具有同等启动子活性。在一个实施方案中，在相同的测试条件下，与参考启动子SEQID NO：1相比，如果待测启动子具有相同或基本上相同的活性，例如参考启动子活性±10％、优选地±5％，或更优选±1％的活性，则可以认为待测启动子具有同等启动子活性。

在再一些实施方案中，本发明的表达构建体以转录方向彼此功能性连接的如下元件：

-CAR-Mut启动子，

-任选地，Kozak序列，

-编码人IDS的多核苷酸序列，优选地SEQ ID NO:2的序列，

-至少一个(例如2-4个)免疫相关的miRNA结合位点，尤其是miR-142结合位点，例如包含至少一个(例如一个或两个)SEQ ID NO:7序列的miR-142结合位点，

-任选地，转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列、或其任何变体，更优选包含SEQ ID NO:5或与其具有至少95％同一性的牛生长激素polyA序列。

在一些实施方案中，表达构建体还包括两个ITR序列。例如，从5’末端到3’末端，表达构建体可以包含如下排列的元件：5’ITR-CAR-mut启动子-IDS编码序列-miRNA结合位点-polyA-3’ITR。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR相同。在另一实施方案中，5’ITR和3’ITR不同，且其一(优选3’ITR)为缺少功能性trs位点的ΔITR。在一个实施方案中，表达构建体中的5’ITR和3’ITR相同，均包含或由SEQ ID NO:5序列组成。

本发明的表达构建体在一个实施方案中可以包含位于IDS编码核酸序列的起始密码子上游的Kozak序列，以促进IDS的翻译。用于本发明的Kozak序列可以是定义为GCCRCC的共有序列，其中R是嘌呤(即A或G)，且其中所述序列位于起始密码子紧上游。在一个优选的实施方案中，在本发明表达构建体的核酸序列中，所述Kozak序列具有5’-GCCACC-3’序列。也可以使用其他不同的Kozak序列。可通过序列文库筛选Kozak序列，并且对翻译效率的增强作用可以使用本领域已知的常规方式进行评估。例如，可以构建包含具有不同Kozak序列的报告基因或重组IDS基因的重组核酸，将重组核酸引入宿主细胞，例如BHK细胞中，经一段时间后检测细胞或培养上清液中的报告基因表达水平或IDS酶活性水平，并与具有参考Kozak序列的重组核酸进行比较，以确定所测试的Kozak序列的翻译增强效率。

在一些实施方案中，本发明的表达构建体还包含一个或多个免疫相关的miRNA结合位点，即，miRNA靶序列，位于目的IDS编码核酸序列的3’UTR中。不受任何具体理论的约束，包括miRNA结合位点在表达构建体中允许对目的基因在产生相应miRNA的细胞和组织中的表达进行调节(例如，抑制)。由此，在一个实施方案中，本发明表达构建体包含一个或多个miRNA结合位点，从而可以以细胞类型特异性方式下调IDS的表达。在一个实施方案中，本发明表达构建体包含一个或多个miRNA结合位点，其中所述miRNA在抗原呈递细胞中表达，由此降低了本发明表达构建体在所述抗原呈递细胞中表达IDS的效率。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于IDS编码基因的3’非翻译区(3’UTR)中，例如，编码IDS的核苷酸序列的最后一个密码子和polyA序列之间。

在一些实施方案中，表达构建体包含一个或多个(例如,1,2,3,4,5或更多个)miRNA结合位点，所述miRNA结合位点下调IDS基因从免疫细胞(例如，抗原呈递细胞APC,例如巨噬细胞和树突细胞等)的表达。不受具体理论的约束，此类免疫相关miRNA结合位点在表达构建体中并入可以减少或抑制受试者产生抗药免疫反应。

在一些优选的实施方案中，表达构建体包含一个或多个miR-142结合位点(在本文中也称作miR-142靶序列)，例如SEQ ID NO:7的miR-142-3P靶序列，或其串联重复序列，例如2,3,4,5,6个串联重复,优选地2个串联重组，如SEQ ID NO：3的miR-142-3P靶序列。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点可以降低重组AAV载体在抗原提呈细胞中的表达。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点可以降低重组AAV载体的免疫原性。在一些实施方案中，包含所述miRNA结合位点的重组AAV载体在受试者中引发低的免疫反应。在另一些实施方案中，相对于不含miRNA结合位点的重组AAV载体对照，包含所述miRNA结合位点的重组AAV载体在施用后受试者中引发低的抗药抗体滴度。优选地，所述施用为侧脑室施用。在一个实施方案中，在施用1-6周，例如4周后测量，确定抗IDS抗体血清滴度，优选地，相对于对照，该血清滴度降低大约1至30倍，例如，大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、15倍或20倍。

在一些实施方案中，本发明表达构建体包含至少一个polyA尾位于编码IDS和miRNA结合位点的多核苷酸下游。任何合适的polyA序列均可以使用，包括但不限于hGHpolyA,bGHpolyA,SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、或其任何变体。在一个优选的实施方案中，polyA是bGHpolyA，例如SEQ ID NO:5所示的polyA，或与SEQ ID NO:5具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％的核苷酸序列同一性的polyA多核苷酸序列。

包含在本发明表达构建体中的IDS编码核酸可以是任何编码功能性IDS酶活性的多核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸编码人全长IDS序列例如SEQ ID NO：10的序列，或其片段，例如起始于SEQ ID NO:10的残基1-33之间且终止于残基550、或相应位置的IDS酶片段。优选地，所述IDS包含靶向溶酶体的天然信号肽(即，在SEQ ID NO：10的情况下，氨基酸1-25的信号肽)。或者，所述IDS可以包含来自异源信号肽，例如来自人溶酶体靶向蛋白或分泌蛋白的信号肽。

在一些实施方案中，本发明的表达构建体包含IDS编码核酸序列，其中所述核酸序列编码具有IDS酶活性的多肽，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO：10的序列、或与SEQ IDNO:10的氨基酸26-550的序列、或与SEQ ID NO:10的氨基酸34-550的序列，具有至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述多肽与SEQID NO:10的参照IDS蛋白相比具有大约相同的GAG(尤其是，硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS))水解活性，例如所述多肽的IDS酶活性是参照IDS蛋白酶活性的至少大约95％、大约96％，大约97％、98％、99％或更高。用于测定IDS酶活性的测定试验是本领域已知的。本领域技术人员可以采用任何这样的测定试验确定可以用于本发明表达构建体、重组AAV病毒载体、以及方法和用途中的适宜IDS多肽。

在一个实施方案中，用于本发明表达构建体中的IDS编码核酸包含选自以下的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(ii)与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少80％同一性的序列；和

在一个实施方案中，用于本发明表达构建体中的IDS编码核酸包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列，或由其组成。

重组AAV载体

在一个方面，本发明提供了重组AAV载体。本发明的重组AAV载体尤其可用于治疗MPSII疾病。在一个实施方案中，重组AAV载体包含衣壳和位于衣壳中的核酸，在本文中也称作“重组AAV载体的基因组”。重组AAV载体的基因组包含多个元件，包括但不限于两个反向末端重复(ITR，即，5’-ITR和3’-ITR)，以及位于两个ITR之间的其它元件，包括启动子、异源基因、和polyA尾。优选地，两个ITR之间还可以包含至少一个免疫相关的miRNA结合位点。

在本文中，腺相关病毒(AAV)包括但不限于，任何血清型的AAV，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11型AAV，及具有人工改变的衣壳蛋白的AAV。各种血清型和人工AAV的基因组序列及其天然反向末端重复(ITR)序列、Rep蛋白和衣壳cap蛋白是本领域已知的。这些序列可以在公开数据库例如GenBank或文献中找到。

在一些实施方案中，本发明提供包含衣壳的重组AAV病毒载体，其中所述衣壳由能够跨血脑屏障的衣壳蛋白，例如AAV9衣壳蛋白构成。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒载体具有神经系统靶向性。在另一实施方案中，重组AAV载体在全身给药后能靶向和转导受试者的外周组织和脑组织。在再一实施方案中，以未接受重组AAV载体施用的对照受试者相比，或与受试者接受重组AAV载体施用前相比，重组AAV载体在所述靶向和转导的组织中导致更高的目的外源IDS基因的表达和/或酶活性。

在一些优选实施方案中，本发明的重组AAV载体具有来自AAV9血清型的衣壳。

在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体的两个ITR序列均是全长ITR(例如长度为约125-145bp，并含有功能性的Rep结合位点(RBS)和末端解链位点(trs))。在一些实施方案中，全长功能性ITR被用于生产单链重组AAV载体(ssAAV)。

在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体包含野生型AAV ITR，例如野生型AAV2ITR，例如SEQ ID NO:5所示的ITR序列。在另一些实施方案中，本发明的重组AAV载体包含相对于野生型AAV ITR具有一个或多个修饰，例如核苷酸添加、缺失和/或替代，但仍能实现ssAAV病毒包装和生产的变体ITR。

因此，在一个方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒(AAV)载体，其中所述重组AAV载体在其基因组中包含：

a.5’和3’AAV反向末端重复(ITR)序列，和

b.位于5’和3’ITR之间的表达构建体，其中所述表达构建体包含以转录方向彼此功能性连接的如下元件：

-根据本发明的任何CAR-Mut启动子，尤其是SEQ ID NO：1的启动子，

-Kozak序列，

-编码人α酸性葡萄糖苷酶(IDS)的多核苷酸，尤其是SEQ ID NO:2的启动子，

-至少一个(例如2-8个)免疫相关的miR-142结合位点，例如包含至少一个(例如1个或2个)SEQ ID NO:7序列的miR-142靶序列，尤其是SEQ ID NO:3的miR-142-3P靶序列，

-转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列、或其任何变体。

在一些实施方案中，所述重组AAV载体为ssAAV载体。在一些实施方案中，所述重组AAV载体包含来自AAV9血清型的衣壳蛋白，优选地，所述重组AAV载体是AAV2/9载体。

II.重组AAV载体的制备

现有技术中对AAV载体具有相对成熟的包装系统，这便于规模化生产AAV载体。

目前常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒作为辅助病毒的系统、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)作为辅助病毒的包装系统、以及基于杆状病毒的包装系统。每种包装系统都各具特点，本领域技术人员可以根据需要做出合适的选择。

三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。

Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统(Yuan Z等人，Hum GeneTher.2011；22(5):613-624)，该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。

HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略(伍志坚，吴小兵等，科学通报，1999，44(5)：506-509；Conway JE等人，Gene Ther.1999，6：986-993)。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略(Wustner JT等人，MolTher.2002，6(4)：510-518)。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat，ITR)/外源基因表达框，然后用这两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒(Booth MJ,et al.Gene Ther.2004；11:829-837)。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统(Thomas DL等人，Gene Ther.2009；20:861-870)，使更大规模的AAV病毒生产成为可能。

Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构基因、非结构基因和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两个或一个杆状病毒(Chen H.，Mol Ther.2008，16(5)：924-930；Galibert L.et al.，JInvertebr Pathol.2011；107Suppl:S80-93)以及一个杆状病毒组合一株诱导细胞株策略(Mietzsch M等人，Hum Gene Ther.2014；25:212-222，Mietzsch M等人，Hum GeneTher.2015；26(10):688-697)。

本发明的重组AAV病毒载体可以使用本领域已知的任何合适的方法来生产。在一个实施方案中，本发明重组AAV病毒采用三质粒包装系统进行生产。在另一实施方案中，本发明重组AAV病毒采用杆状病毒包装系统进行生产。

III.药物组合物

再一方面，本发明提供了包含本发明的重组AAV病毒载体的药物组合物。本发明的药物组合物优选地包含可药用赋形剂、稀释剂或载体。本发明的药物组合物可以配制为任何合适的制剂形式。

用于配制的合适可药用赋形剂、稀释剂或载体的实例在本领域中是众所周知的，包括例如，磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳液，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。制剂可以通过常规方法配制，并以合适的剂量向受试者给药。合适配制的组合物的施用可以通过不同的方式来实现，例如。通过静脉内，腹膜内，皮下，肌肉内，局部或皮内给药。具体施用途径尤其取决于药物组合物中包含的载体的类型。剂量方案将由主治医师和其他临床因素决定。如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型，体表面积，年龄，性别，所要施用的特定活性剂，所用的时间和途径，所用药物的种类和阶段。感染或疾病，一般健康状况、以及其他药物的联用。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含第二活性剂。在一些实施方案中，第二活性剂是用于ERT的重组IDS蛋白，例如来自转基因动物奶或生产性哺乳动物细胞系的重组IDS蛋白。

在另一些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含能够降低药物施用时副反应(例如抗药免疫反应)的组分。在一些情况下，所述组分可以是免疫抑制剂。

本发明的药物组合物可以通过任何合适途径给药，包括全身给药和局部给药。在一个优选方案中，本发明药物组合物用于侧脑室给药方式给药。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明重组AAV载体的药物组合物，其中所述药物组合物是侧脑室注射给药制剂，或适用于配制为该注射制剂的冻干稳定制剂。

IV.治疗方法

在另一方面，本发明涉及使用本发明的重组AAV载体或包含其的药物组合物治疗MPS II疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：将本发明的任何重组AAV载体或药物组合物施用给有需要的受试者。所述重组AAV载体或药物组合物可以通过任何适宜的途径施用，包括但不限于，肌内，皮下，脊髓内，脑室内，鞘内，静脉内，膈肌内，胸腔内，腹膜内。优选地，本发明的重组AAV载体或药物组合物通过侧脑室给药方式递送给受试者。在一些实施方案中，所述治疗是治疗性的。在另一些实施方案中，所述治疗是预防性的。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，其中所述哺乳动物尤其是人、灵长类、狗、马、牛，特别是人类受试者。在一些实施方案中，受试者已经之前诊断为患有MPS II。在一个实施方案中，MPSII是重度MPSII或重度亨特综合征。

在涉及治疗MPS II受试者的方法中，在一些实施方案中，治疗包括以下之任一项或多项：(1)阻止或延迟MPSII病的发作；(2)减轻MPSII病的严重程度；(3)减轻或阻止MPSII病的至少一个症状的出现和/或恶化；(4)改善MPSII病相关的神经变性和/或受试者行为；和(5)延长受试者的生存期。可以接受治疗的MPSII病受试者包括新生儿、儿童、青少年和成年MPSII患者。在一些实施方案中，受试者是新生儿MPS II患者，例如3-9个月或。在再一些实施方案中，受试者是小于3周岁或12周岁的MPSII患者；或施用于小于18周岁的MPSII患者。

因此，在一个方面，本发明提供了本发明重组AAV病毒载体用于驱动编码IDS的多核苷酸在哺乳动物细胞(尤其是人细胞)中表达的用途，或在制备用于驱动编码IDS的多核苷酸在哺乳动物细胞或哺乳动物(尤其人)体内一种或多种组织或器官中表达的药物中的用途。

在再一方面，本发明提供了一种用于治疗MPSII受试者的方法，和本发明的重组AAV载体在制备用于治疗MPSII的受试者的药物中的用途。所述治疗包括向所述受试者施用本发明的任何一个或多个重组AAV载体，优选地，通过侧脑室注射给药，施用所述重组AAV载体。

在本发明治疗方法和用途的一些实施方案中，在施用本发明重组AAV载体后，增加了受试者的外周组织(例如，心脏、肝脏、脾、肺、肾、肌肉、和/或小肠)和/或脑中IDS多肽的表达和/或活性。在再一些实施方案中，重组AAV载体施用导致受试者的外周组织(例如，心脏、肝脏、脾、肺、肾、肌肉、和/或小肠)和/或脑中的溶酶体GAG贮积量减少，优选地达到并保持与未患病个体相当的水平，例如，50-120％，优选地大约80-120％，例如大约90％-110％。可以在来自受试者的样品(例如，血液、血清、尿液等体液样品。和/或肝脏、脾等活检组织)中检测GAG水平和/或酶(IDS)活性水平，以确定治疗效果。在一些实施方案中，通过侧脑室给药，在受试者的外周组织中检测到的IDS表达水平可以为正常(未患MPS II和无MPSII相关症状)人IDS水平的大约5％或大约150％，优选地大约50％到大约100％，更优选地80％-100％。在再一实施方案中，通过侧脑室给药，在受试者的脑组织中检测到的IDS表达水平高于正常人IDS水平，例如110-400％，例如，150％以上，200％以上，300％以上。

在优选的实施方案中，在施用本发明重组AAV载体后，在患者体内中不诱导或诱导低的抗IDS免疫反应，例如，在施用后一个月，患者的血清抗IDS抗体滴度低于1:10000，或低于1:5000,或低于1:3200，或更低，例如采用ELISA测定法测量。

因此，本发明也提供了如下方法和本发明重组AAV载体在制备用于如下方法的药物中的用途：

(1)在患有或有风险患有MPSII的受试者中用于预防或减少受试者体内细胞的病理学溶酶体糖原过量贮积的方法；

(2)在患有或有风险患有MPS II的受试者中用于预防或改善因溶酶体糖原过量贮积所致的外周组织和/或脑损伤的方法。

在本发明治疗方法和用途的一些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体与另一治疗药物或治疗程序组合施用。可以与本发明重组AAV载体组合施用的治疗药物或治疗程序可以选自酶替换治疗(ERT)和/或造血干细胞移植(HSCT)治疗。

实施例

本发明公开了一种Ⅱ型粘多糖贮积症基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

材料和方法

材料

pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System(Agilent Technologies，美国)。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。

pAAV-R2C9质粒，按如下方式构建。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies，美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列(GenBankID：AY530579)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV9外壳蛋白。

IDS基因缺陷的模型小鼠：购自美国the jackson laboratory(jax)，No.024744。

C57BL/6N小鼠：购买至北京北京维通利华实验动物技术有限公司。

一般方法

IDS分析

基本按照文献(Prevention of Neurocognitive Deficiency inMucopolysaccharidosis Type II Mice By CNS-Directed,AAV9-Mediated IduronateSulfatase Gene Transfer,Human Gene Therapy,DOI:10.1089/hum.2016.184)中所述进行IDS活性测定。简言之，使用4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸二钠(4-methylumbelliferyl-a-L-iduronide-2-sulphate disodium,4-MU-αIdoA-2S:TorontoResearch Chemical Incorporation,Cat.#M334715)作为底物，在样品(例如组织裂解物)中，在两步测定中，测量IDS酶活性。酶活性表示为nmol/hr/ml血浆，nmol/hr/mg蛋白。

GAG(糖胺聚糖)分析

取等质量的不同组织，提取组织的GAG。使用DMMB分光光度法检测组织中GAG含量。组织中GAG含量记为ug GAG/mg组织。

实施例1质粒载体的构建

为获得包装重组AAV病毒需要的pRDAAV-CAR-Mut-IDS质粒，首先以pRDAAV-CMV-EGFP(图1)为基础，用自主设计得到的CAR-Mut启动子(SEQ ID No.1)替换pRDAV载体中的CMV启动子，得到pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体。接下来，将人工合成的人类IDS(SEQ ID No.2)序列克隆入pRDAV-CAR-Mut-EGFP载体的KpnI和EcoRI酶切位点之间，得到pRDAAV-CAR-Mut-IDS载体。

(1)pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体构建

应用自行设计的CAR-Mut启动子(SEQ ID No.1)和pRDAAV-CMV-EGFP质粒载体进行构建。pRDAAV-CMV-EGFP质粒载体包含：

i)来自AAV2基因组的ITR，序列如SEQ ID NO:4所示；

ii)组成型CMV启动子；

iii)表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的核苷酸序列；

iv)牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号BGH polyA，序列如SEQ ID NO:5所示；

v)来自AAV2基因组的ITR，序列如SEQ ID NO:4所示。

在CAR-Mut启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-CAR-Mut。

用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAR-Mut载体和pRDAAV-CMV-EGFP载体，回收CAR-Mut启动子片段和切去CMV启动子的pRDAAV-CMV-EGFP载体片段(约6.9kb)，两片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)。经筛选、鉴定后得到含有CAR-Mut启动子的AAV质粒载体pRDAAV-CAR-Mut-EGFP(图2)。

(2)pRDAAV-CAR-Mut-IDS载体构建

由金斯瑞生物科技有限公司合成人类IDS基因(GenBank:CCDS14685.1)的cDNA序列，序列信息见SEQ ID No.2，并在合成的IDS基因cDNA序列5’上游加入KpnI酶切位点与Kozak序列5’-GCCACC-3’(SEQ ID NO:6)，在3’下游加入taa终止密码子及EcoRI酶切位点。合成后的序列克隆入pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-IDS载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-IDS载体和pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体，回收IDS片段和去除EGFP报告基因的pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体片段，两片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)，筛选、鉴定后得到pRDAAV-CAR-Mut-IDS载体(图3)。(3)pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P载体构建

由北京擎科新业生物技术有限公司合成含有串联的两个miRNA-142-3p结合位点(SEQ ID NO:3，MicroRNA 142-3P)的oligo引物，退火后得到上游为EcoRI酶切位点，下游为SalI酶切位点的142-3P片段。使用EcoRI和SalI消化pRDAAV-CAR-Mut-IDS载体使其线性化，回收载体骨架与142-3P片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)，筛选、鉴定后得到pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P载体(图4)。

实施例2 pRDAAV-CAR-Mut-IDS与pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P载体的体外表达验证

将生长良好的HEK-293细胞均匀铺于六孔细胞培养板中的9个孔，待每孔的细胞密度达为80％时，利用Lipofectamine2000(Invitrogen,美国)转染pRDAAV-CAR-Mut-IDS与pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P各3孔，余下3孔作为空白对照(转染详细过程参见商品说明书)。待转染24h后，消化后收集细胞，采用反复冻融后离心的方式提取细胞总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit(ThermoFisher,美国)分别测定转染pRDAAV-CAR-Mut-IDS与pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P的HEK细胞及空白细胞的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。

在提取细胞总蛋白后，将上述提取的蛋白分别取15μg用于测定IDS蛋白酶活。结果表明，空白HEK-293细胞的IDS酶活性极低为1.26±0.02nmol/h/mg protein。而转染pRDAAV-CAR-MUT-IDS质粒的HEK-293细胞的IDS酶活性为23.87±0.34nmol/h/mg protein，是空细胞的18.9倍。转染pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P质粒的HEK-293细胞的IDS酶活性为23.56±0.69nmol/h/mg protein，与转染pRDAAV-CAR-Mut-IDS质粒无显著差异(图5)。

上述结果表明，所构建的pRDAAV-CAR-Mut-IDS质粒能够在细胞内高效的表达IDS蛋白，且表达的蛋白具有活性，能够发挥降解底物的作用。添加142-3P后不影响IDS在体外HEK293细胞中的表达。

实施例3 rssAAV-CAR-Mut-IDS及rssAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P的制备及检定

(1)重组AAV病毒的包装

应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。基本按照Chiorini,J A et al.“Biologically active Rep proteins of adeno-associated virus type 2 producedas fusion proteins in Escherichia coli.”Journal of virology vol.68,2(1994):797-804中所述方法进行。简要地，AAV载体质粒(pRDAAV-CAR-Mut-IDS或pRDAAV-CAR-Mut-IDS-142-3P)、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-R2C9)，按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P。

(2)重组AAV病毒的滴度检测

采用点杂交方法测定制备得到的重组AAV病毒(rAAV)的基因组滴度。具体过程如下：

在IDS基因中设计两条引物IDS-F与IDS-R：

IDS-F：5’-CGCGTTTCTTTCCTCACTGG-3’(SEQ ID NO:8)

IDS-R：5’-ACGGAIDSTCATCGGTATGG-3’(SEQ ID NO:9)

以IDS-F与IDS-R为引物利用PCR法特异性地扩增IDS基因得到长度为190bp的DNA探针片段。使用pRDAAV-CAR-Mut-IDS质粒及其2倍比梯度稀释液为标准品，将rAAV样品2倍比梯度稀释为检测样品。将标准品和检测样品点在杂交膜上，用探针对膜进行杂交。操作过程详见分子克隆实验指南(第四版)。使用ImigeJ软件灰度扫描，比较样品点与系列标准点的杂交信号，分析计算rAAV样品滴度。

实施例4 MPSⅡ治疗药物在正常小鼠体内有效性探索实验

6周龄C57 BL/6N野生小鼠共15只，随机分为5组。第1组小鼠每只尾静脉单次注射rAAV9-CAR-Mut-IDS，剂量为1×10¹³GC/kg。第2组小鼠每只尾静脉单次注射rAAV9-CAR-Mut-IDS，剂量为5×10¹³GC/kg。第3组小鼠每只尾静脉单次注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，剂量为1×10¹³GC/kg。第4组小鼠每只尾静脉注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，剂量为5×10¹³GC/kg。第5组小鼠每只尾静脉注射200μL PBS作为对照。注射后1个月处死全部小鼠，解剖分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等，取等质量的不同组织，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit(ThermoFisher,美国)分别测定各组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。所有小鼠的不同组织均取15μg总蛋白用于测定IDS酶活性。

结果如图6所示，注射病毒后的C57 BL/6N野生小鼠，各组织中的IDS蛋白的活性高于未注射病毒的野生型小鼠，尤其是肝脏中的IDS蛋白活性增加显著。表明我们设计的重组AAV作为MPS II(II型粘多糖贮积症)的治疗药物经尾静脉注射进入小鼠体内后，能够有效地表达产生具有活性的IDS蛋白(即，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶,I2S)。添加142-3P后不影响IDS在小鼠组织中的正常表达。

实施例5 MPSⅡ治疗药物在模型小鼠体内有效性评价实验

IDS基因纯合突变的模型小鼠24只(新生)，并随机平均分为3组。其中1组作为阴性对照组，每只侧脑室单次注射5μL PBS；另外两组作为实验组分别侧脑室单次注射rAAV9-CAR-Mut-IDS和rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P，注射剂量为每只5×10¹³GC/kg。另加入1组8只C57BL/6J野生小鼠(新生)作为对照。

IDS酶活性检测

注射后3个月处死全部小鼠，解剖分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等，取等质量的不同组织，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA ProteinAaasy Kit(ThermoFisher,美国)分别测定各组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。所有小鼠的不同组织均取15μg总蛋白用于测定IDS酶活性。

如图7所示，未注射重组病毒的模型小鼠各组织器官中IDS的活性极低，几乎检测不到。经ICV注射病毒后的模型小鼠，其心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠、肌肉、脑组织的IDS酶活性均有显著上升。在各组织中显著或极显著高于未注射病毒的模型小鼠。在多组织中IDS酶活性与野生型小鼠相比基本持平，在脑和心脏中的IDS酶活性甚至超过未注射病毒的野生型小鼠。这表明我们设计的病毒经侧脑室注射模型小鼠体内后，能够在多组织广泛有效地感染细胞并表达产生具有活性的IDS蛋白。携带与不携带miR-142-3p结合位点的两种构建体，表达水平无显著差异。

免疫组织化学

分别取四组小鼠的股四头肌，切合适尺寸，4％多聚甲醛浸泡固定，做好标记送至龙麦达斯有限公司用作病理分析。

结果如图8所示。图8：A为注射PBS的野生型小鼠，B为注射PBS的IDS纯合模型小鼠，C为注射rAAV9-CAR-Mut-IDS的IDS模型小鼠，D为注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠。模型小鼠(图8B)显示出大量炎细胞浸润以及组织的退行性改变。在注射两种重组AAV病毒药物治疗后，模型小鼠(图8C和8D)在肌肉病理状况均有不同程度的改善，包括炎症反应的减少，组织退行性病变的减轻等。重组AAV病毒添加142-3P后(图8D)，观察到更少的炎细胞浸润，提示Micro 142-3P有助于减少炎症反应的产生。

GAG贮积量测定

取等质量的不同组织，提取组织的GAG。使用DMMB分光光度法检测组织中GAG含量。结果见图9。注射病毒的模型小鼠多组织中GAG含量显著低于未注射病毒的模型小鼠，略高于正常小鼠。注射rAAV9-CAR-Mut-IDS相比注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的模型小鼠多组织GAG含量无明显差异。

结果表明，注射病毒后，模型小鼠体内产生的IDS蛋白能够有效的分解组织内贮积的GAG，从而使组织中GAG含量减少，达到治疗的目的。

实施例6 MPSⅡ治疗药物与其他在研药物在模型小鼠体内有效性评价实验

已有报道的MPSⅡ基因治疗药物主要有，Monica Cardone等在MPS II小鼠中采用静脉注射AAV2/8载体进行治疗，Laoharawee等采用脑室内注射rAAV9-CB7-hIDS治疗模型小鼠，以及Sandra Motas等使用脑室内注射rAAV9-CAG-hIDS治疗模型小鼠。Monica Cardone等人的方案与本发明差异较大。因此，主要对与本发明采用相同血清型且给药方式均为脑室内注射的rAAV9-CB7-hIDS及rAAV9-CAG-hIDS进行比较。

应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒(pRDAAV-CB7-IDS或pRDAAV-CAG-IDS)、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-R2C9)按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到rAAV9-CB7-hIDS及rAAV9-CAG-hIDS。方法同实施例3。

IDS基因纯合突变的模型小鼠32只(新生)，并随机平均分为4组。其中1组作为阴性对照组，每只侧脑室注射5μL PBS；另外3组作为实验组分别侧脑室注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P、rAAV9-CB7-hIDS和rAAV9-CAG-hIDS，注射剂量为每只5×10¹³GC/kg。另加入1组8只C57BL/6J野生小鼠(新生)作为对照。

注射后1个月处死全部小鼠，取血液后分离血清，并解剖分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。

分离的血清使用Elisa方法检测IDS抗体滴度。ELISA检测结果见图11。

自解剖分离的每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等，取等质量的不同组织，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit(ThermoFisher,美国)分别测定各组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。所有小鼠的不同组织均取15μg总蛋白用于测定IDS酶活性。结果见图10。

如图10所示，未注射病毒的模型小鼠各组织器官中IDS的活性极低，几乎检测不到。经ICV注射病毒后的模型小鼠，其心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠、肌肉、脑组织的IDS酶活性均有显著上升。在各组织中显著或极显著高于未注射病毒的模型小鼠。提升幅度为AAV9-CAG-hIDS>rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P>rAAV9-CB7-hIDS。

如图11所示在注射药物一个月后，未注射病毒的模型小鼠与野生型小鼠的血清IDS抗体水平极低，滴度约为1：10；注射rAAV9-CAR-Mut-IDS-142-3P的小鼠产生了较低水平的IDS抗体，滴度为1：3200；而注射AAV9-CAG-hIDS及rAAV9-CB7-hIDS的小鼠均产生了高水平的IDS抗体，滴度为1：51200。这一结果显示本发明的的设计可以有效降低药物的免疫原性，在注射后可以有效地降低因机体免疫反应产生的IDS抗体，使治疗过程更加安全。

序列表

SEQ ID No.1：CAR-Mut启动子，下划线加粗体显示568位核苷酸C

SEQ ID No 2：IDS基因序列

5’-atgccgccaccccggaccggccgaggccttctctggctgggtctggttctgagctccgtctgcgtcgccctcggctccgaaacgcaggccaactcgaccacagatgctctgaacgttcttctcatcatcgtggatgacctgcgcccctccctgggctgttatggggataagctggtgaggtccccaaatattgaccaactggcatcccacagcctcctcttccagaatgcctttgcgcagcaagcagtgtgcgccccgagccgcgtttctttcctcactggcaggagacctgacaccacccgcctgtacgacttcaactcctactggagggtgcacgctggaaacttctccaccatcccccagtacttcaaggagaatggctatgtgaccatgtcggtgggaaaagtctttcaccctgggatatcttctaaccataccgatgattctccgtatagctggtcttttccaccttatcatccttcctctgagaagtatgaaaacactaagacatgtcgagggccagatggagaactccatgccaacctgctttgccctgtggatgtgctggatgttcccgagggcaccttgcctgacaaacagagcactgagcaagccatacagttgttggaaaagatgaaaacgtcagccagtcctttcttcctggccgttgggtatcataagccacacatccccttcagataccccaaggaatttcagaagttgtatcccttggagaacatcaccctggcccccgatcccgaggtccctgatggcctaccccctgtggcctacaacccctggatggacatcaggcaacgggaagacgtccaagccttaaacatcagtgtgccgtatggtccaattcctgtggactttcagcggaaaatccgccagagctactttgcctctgtgtcatatttggatacacaggtcggccgcctcttgagtgctttggacgatcttcagctggccaacagcaccatcattgcatttacctcggatcatgggtgggctctaggtgaacatggagaatgggccaaatacagcaattttgatgttgctacccatgttcccctgatattctatgttcctggaaggacggcttcacttccggaggcaggcgagaagcttttcccttacctcgacccttttgattccgcctcacagttgatggagccaggcaggcaatccatggaccttgtggaacttgtgtctctttttcccacgctggctggacttgcaggactgcaggttccacctcgctgccccgttccttcatttcacgttgagctgtgcagagaaggcaagaaccttctgaagcattttcgattccgtgacttggaagaggacccgtacctccctggtaatccccgtgaactgattgcctatagccagtatccccggccttcagacatccctcagtggaactctgacaagccgagtttaaaagatataaagatcatgggctattccatacgcaccatagactataggtatactgtgtgggttggcttcaatcctgatgaatttctagctaacttttctgacatccatgcaggggaactgtattttgtggattctgacccattgcaggatcacaatatgtataatgattcccaaggtggagaccttttccagttgttgatgccttga-3’

SEQ ID No 3：串联MicroRNA 142-3P靶序列

5’-TCCATAAAGTAGGAAACACTACATCCATAAAGTAGGAAACACTACA-3’

SEQ ID NO:4：来自AAV2基因组的ITR序列145bp

5’-TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT-3’

SEQ ID NO:5：牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号BGH polyA

5’-GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTAT-3’

SEQ ID NO:6:Kozak序列

5’-GCCACC-3’

SEQ ID NO:7:单个miR-142-3p靶位点

TCCATAAAGTAGGAAACACTACA

SEQ ID NO:8：重组AAV病毒的基因组滴度检测用引物

IDS-F：5’-CGCGTTTCTTTCCTCACTGG-3’(SEQ ID NO:8)

SEQ ID NO:9:重组AAV病毒的基因组滴度检测用引物

IDS-R：5’-ACGGAGAATCATCGGTATGG-3’(SEQ ID NO:9)

SEQ ID NO:10人IDS酶氨基酸序列(UniProtKB-P22304)，其中aa1-aa25为信号肽；aa26-33为前肽(propeptide)；

Claims (15)

1.一种艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因表达构建体，其包含：

(1)如SEQ ID NO:1所示的启动子序列，或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列，其中所述序列在相应于SEQ ID NO:1的核苷酸568位具有核苷酸C；

(2)编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的核酸，

优选地，所述核酸编码具有选自以下的氨基酸序列的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶：

(a)SEQ ID NO:10的氨基酸1至氨基酸550；

(b)SEQ ID NO:10的氨基酸26至氨基酸550；

(c)SEQ ID NO:10的氨基酸34至氨基酸550；

(d)与前述任一具有至少约90％同一性的氨基酸序列；

更优选地，所述核酸包含选自以下的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(ii)与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少80％同一性的序列；和

(3)至少一个(例如，2－8个)SEQ ID NO:7所示的人miR-142-3p靶序列，例如，具有2个串联的人miR-142-3p靶序列，例如，SEQ ID NO:3所示的人miR-142-3p靶序列。

2.根据权利要求1所述的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因表达构建体，其还包含选自以下之一或多项：

(1)Kozak序列，

(2)转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列，更优选牛生长激素polyA序列。

3.一种重组AAV病毒载体，其特征在于，包含权利要求1－2中任一项所述的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因表达构建体。

4.一种重组AAV病毒载体，其中所述重组AAV载体在其基因组中包含：

a.5’和3’AAV反向末端重复(ITR)序列，和

b.位于5’和3’ITR之间的权利要求1或2的表达构建体，

优选地，其中所述表达构建体包含以转录方向彼此功能性连接的如下元件：

-如SEQ ID NO:1所示的启动子序列，

-Kozak序列，

-编码人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的多核苷酸，

-SEQ ID NO:3所示的人miR-142-3p靶序列，

-转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、和牛生长激素polyA序列，更优选地牛生长激素polyA序列。

5.权利要求4的重组AAV病毒载体，其是ssAAV病毒载体或scAAV病毒载体，优选是ssAAV病毒载体。

6.权利要求4或5的重组AAV病毒载体，其中所述5’和3’ITR为野生型AAV2 ITR序列。

7.权利要求4-6任一项的重组AAV病毒载体，其中所述重组AAV载体具有AAV9血清型衣壳，优选地，所述重组AAV载体具有AAV9衣壳和AAV2 ITR。

8.一种药物组合物，其包含权利要求4-7任一项的重组AAV病毒和药物可接受载体，

优选地，所述药物组合物适用于静脉施用或侧脑室(ICV)施用，优选地，所述药物组合物配制为用于侧脑室注射施用所述重组AAV病毒载体。

9.权利要求8的药物组合物，其中所述重组AAV病毒载体滴度为至少1.0E13 GC/ml。

10.权利要求8的药物组合物，其中所述药物组合物配制为用于将所述重组AAV病毒载体施用于新生儿MPSII患者；或施用于小于5周岁或12周岁的MPSII患者；或施用于小于16周岁的MPSII患者，或成年MPSII患者，优选地，所述患者为具有CNS累及的MPSII患者。

11.一种治疗粘多糖贮积症II型(MPSII)的方法，包括向有需要的受试者施用权利要求4-7的重组AAV病毒载体或权利要求8-10的药物组合物，优选地，所述施用为侧脑室施用。

12.权利要求11的方法，其中所述重组AAV病毒载体在施用后导致在受试者的细胞或体内一种或多种组织或器官中功能性hIDS水平的增加，且优选地GAG水平降低，

优选地，所述药物组合物用于在受试者的心脏、肝脏、脾、肺、肾、肌肉、肠道和脑中表达hIDS，

优选地，所述药物组合物全身或局部给药，例如静脉内(i.v.)给药、CFS给药、ICV给药，优选地侧脑室注射给药。

13.根据权利要求11的方法，其中所述方法导致受试者外周组织中和/或脑中的功能性hIDS水平的增加。

14.根据权利要求11-12的方法，其中所述方法导致受试者外周组织中和/或脑中糖胺聚糖(GAG)水平，尤其是硫酸乙酰肝素(HS)水平降低，优选地，所述药物组合物一次给药，持续降低受试者体内的组织GAG浓度，使其维持在正常水平。

15.权利要求11的方法，其中重组AAV载体施用后，如ELISA测定，来自受试者的血清样品的抗IDS抗体滴度低于大约1:6000,大约1:3200,或大约1:2000。

Images