JP2024506860A - ニーマンピック病ａ型を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）をコードするポリヌクレオチド配列、及びこれらのコード配列を含む発現カセットが、本明細書で提供される。また、ベクター、例えば、１つ以上の制御性配列と作動可能に連結された操作ＳＭＰＤ１コード配列を含むベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターも提供される。更に、これらの発現カセット及びｒＡＡＶを含む組成物、並びにニーマンピック病Ａ型の治療のためのこれらの組成物の使用方法が提供される。【選択図】なし

Description

ニーマンピック病は、体内の脂質及びコレステロールの分解、輸送、及び使用である脂質代謝に関連する遺伝性病態である。この病態を有する人々では、異常な脂質代謝により、有害な量の脂質が脾臓、肝臓、肺、骨髄、及び脳に蓄積する。ニーマンピック病Ａ型及びＢ型は、ＳＭＰＤ１遺伝子における異なる一連の変異によって引き起こされる。この遺伝子は、酸性スフィンゴミエリナーゼと呼ばれる酵素をコードする。この酵素は、異なる種類の分子を分解して再利用する細胞内の区画であるリソソームに存在する。酸スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンと呼ばれる脂肪（脂質）をセラミドと呼ばれる別のタイプの脂質に変換する役割を果たす。ＳＭＰＤ１の変異は、酸性スフィンゴミエリナーゼの不足をもたらし、その結果、スフィンゴミエリンの分解が低減し、この脂肪が細胞内に蓄積する。この脂肪の蓄積は、細胞の機能不全を引き起こし、最終的には死に至る。時間の経過とともに、細胞損失は、ニーマンピック病Ａ型及びＢ型を有する人々の脳、肺、脾臓、及び肝臓を含む組織並びに器官の機能を損なう。

ニーマンピック病Ａ型は、乳児期に発症し、肝臓及び脾臓の腫大（肝脾腫大）、体重の増加及び期待される速度での成長の失敗（成長障害）、並びに神経系の進行性の悪化を特徴とする。神経系の関与により、ニーマンピック病Ａ型は、神経学的型としても知られている。ニーマンピック病Ａ型の乳児は、通常、生後３ヶ月までに肝臓及び脾臓の肥大（肝脾腫大）を発症し、体重を増やすことができず、期待される速度で成長することができない（成長障害）。罹患した小児は、１歳頃まで正常に発達し、その後、精神能力及び運動の進行性の喪失（精神運動退縮）を経験する。ニーマンピック病Ａ型を有する小児はまた、再発性肺感染症を引き起こし、最終的に呼吸不全につながり得る広範囲の肺損傷（間質性肺疾患）を発症する。罹患した全ての子供は、チェリーレッドスポットと呼ばれる目の異常を有し、これは眼科検査で特定することができる。ニーマンピック病Ａ型（ＮＰＡ）を有する小児は、一般に、小児期を過ぎると生存することができない。現時点で、この病態に対する有効な治療法は存在しない。

当該技術分野において、ＮＰＡ病を有する患者の安全かつ効果的な治療のための組成物及び方法に対する必要性が存在する。

一態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、その中にベクターゲノムがパッケージングされているＡＡＶｈｕ６８カプシドを含み、ベクターゲノムは、ヒトスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ｈＳＭＰＤ１）コード配列と、細胞内でのヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｈＳＭＰＤ１）の発現を指示する制御性配列と、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。

ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｈＳＭＰＤ１）の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されたｈＳＭＰＤ１をコードする操作核酸配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、ｈＳＭＰＤ１コード配列は、配列番号２２、又は配列番号２のｈＳＭＰＤ１をコードする、配列番号２２と少なくとも９０％同一のコード配列（配列番号２３にも再現される）、配列番号３、又は配列番号２のｈＳＭＰＤ１をコードする、配列番号３と少なくとも９０％同一のコード配列（配列番号２３にも再現される）である。特定の実施形態では、ｈＳＭＰＤ１コード配列は、配列番号２（又は２３）の番号を参照して、ヒト配列の３６位にＡｌａ及び／又は５０６位にＧを有するｈＳＭＤ１をコードする。特定の実施形態では、ｈＳＭＰＤ
１タンパク質は、配列番号２（又は２３）又は配列番号３の配列を有する。他の実施形態では、ｈＳＭＰＤ１タンパク質は、配列番号２（配列番号２３）又は配列番号３のアミノ酸４７～６３１を含むｈＳＭＰＤ１タンパク質と融合された外因性リーダー配列を含む。制御性配列は、ＵｂＣ又はＣＢ７プロモーターを含み得、ＳＶ４０後期又はウサギベータグロビンポリアデニル化部位を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターゲノムは、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈＳＭＰＤ１コード配列、及びウサギベータグロビン配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号２１、１９、１０、若しくは８の配列を含むか、又は配列番号２０、１８、１１、若しくは９の配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターゲノムは、ＵｂＣプロモーター、ｈＳＭＰＤ１コード配列、及びＳＶ４０後期ポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターゲノムは、全長ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を更に含む。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。

特定の実施形態では、製剤緩衝液と、本明細書に記載のｒＡＡＶの集団と、を含む、薬学的組成物が提供される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質との併用療法に好適である。特定の実施形態では、薬学的組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注射を介した送達のために製剤化される。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ及び組成物は、体重減少又は悪液質を緩和し、運動機能の損失を緩和し、認知機能の損失を緩和し、生存期間を延長することによってニーマンピックＡの治療及び／又はその症状を改善するのに使用するために提供される。

本発明の他の態様及び利点は、以下の発明の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。

Ｓｍｐｄ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの複数の系統にわたって肝臓及び脳に蓄積されたスフィンゴミエリンの量を示す棒グラフを提供する。系統Ａ、系統Ｂ、及び系統ＣからのＫＯマウスは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、肝臓（図１Ａ）及び脳（図１Ｂ）に蓄積された有意な量のスフィンゴミエリンを示した。 フィリピンの陽性染色によって示される脳内のコレステロール蓄積を示す。（Ａ）Ｓｍｐｄ１ ＷＴマウスは、脳内にコレステロールの存在を示さなかったが、Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスは、脳内に蓄積された豊富な量のコレステロールを示した（図２Ｂ）。この量は、ＩＣＶ遺伝子療法を受けたＳｍｐｄ１ ＫＯマウスにおいて低減した（図２Ｃ）。図２Ｄは、ＷＴ、ＫＯ、及びＫＯ＋ＩＣＶ ＡＡＶマウスについて定量化されたフィリピンの陽性染色を示す。 ＷＴ、ＫＯ、及びＫＯ＋ＡＡＶ処置マウスにおけるロータロッドパフォーマンス中の転倒するまでの潜時を示すグラフである。ＰＢＳを受けたＳｍｐｄ１ ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、時間の経過とともに転倒するまでの潜時の着実な減少を示した。Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスはＡＡＶを受けた。ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１又はＡＡＶ．Ｕｂｃ．ｈＳＭＰＤ１遺伝子療法は、Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスに示される行動障害においてレスキュー表現型を示した。ＣＢ７プロモーターとＵｂｃプロモーターとの間に差はなかった。 未処理の野生型（ＷＴ）マウス及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射したノックアウトマウスと比較した、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＳＭＰＤ１及びＡＡＶ．ＵｂＣｈＳＭＰＤ１についての小葉当たりの平均プルキンエニューロン（ＰＮ）密度を示す。 脳におけるコレステロール蓄積、並びに肝臓、脾臓、及び肺におけるマクロファージの組織化学的染色を示す。列２では、Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、脳内に豊富な量のコレステロール、並びに肝臓、脾臓、及び肺内に脂質で満たされたマクロファージを示した（列１）。列３及び４では、それぞれ、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１又はＡＡＶ．Ｕｂｃ．ｈＳＭＰＤ１遺伝子療法ＩＣＶを受けたＳｍｐｄ１ ＫＯマウスは、脳内のコレステロール蓄積の低減、並びに肝臓、脾臓、及び肺における脂質で満たされたマクロファージの欠如又は減少を示した。 ＳＭＰＤノックアウトマウスの肺胞におけるマクロファージを示す。 処置マウスからの肺胞（肺組織中）における脂質を含んだ肥大したマクロファージの不在を示し、ＣＮＳ及び末梢疾患の矯正を示唆する。

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、並びに機能性ｈＳＭＰＤ１の発現のための他の組成物及び方法を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、宿主細胞、他の組成物、及び機能性ｈＳＭＰＤ１又はｈＳＭＰＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列のいずれかを含む組成物の産生するための方法を含む。更に別の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ＮＰＡ疾患の治療のために、対象に機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする核酸配列を送達するための、核酸配列、発現カセット、ベクターゲノム、ベクター、組換えウイルス、他の組成物及び方法を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく方法は、それを必要とする対象においてｈＳｍｐｄ１の発現を提供することによって、ｈＳＭＰＤ１の所望の機能を回復し、ｈＳＭＰＤ１欠損症（ＮＰＡ疾患）に関連する症状を緩和するのに役立つ、新たな治療選択肢を提供する。

本明細書で使用される場合、「治療レベル」という用語は、健康な対照の少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、１００％超のＳＭＰＤ１（ＡＳＭａｓｅ）酵素活性を意味する。

ｈＳＭＰＤ１酵素活性を測定するための好適なアッセイは、当業者に公知である。追加的に又は代替的に、ＳＭＰＤ１酵素のＡＡＶ媒介送達の機能は、細胞、例えば、脳、肺、脾臓、及び／又は肝臓における脂質蓄積の低減を測定することによって評価され得る。いくつかの実施形態では、このような治療レベルのｈＳｍｐｄ１は、ＮＰＡ疾患関連症状の軽減、ＮＰＡ疾患関連疾患バイオマーカーの改善、特定のＮＰＡ疾患関連症状の逆転、及び／若しくはＮＰＡ疾患関連症状の進行の予防、又はそれらの任意の組み合わせをもたらし得る。本明細書で提供されるベクター及び組成物による治療は、行動学的な救済（矯正）、脳内のコレステロール蓄積の低減、並びに／又は肝臓、脾臓、及び肺における脂質で満たされたマクロファージの減少若しくは欠如のうちの１つ以上を提供し得る。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象におけるＮＰＡ疾患及び／又はｈＳＭＰＤ１（ＡＳＭａｓｅ）欠損を指す。

本明細書で使用される場合、「ニーマンピックＡ症状」又は「ＮＰＡ」、「症状」とは、ＮＰＡ疾患を有する患者及びＮＰＡ疾患の動物モデルで見られる症状を指す。かかる症状としては、体重減少又は悪液質、運動機能の損失、脂質蓄積（例えば、脾臓、肝臓、肺、骨髄、及び／若しくは脳における）、脾臓肥大、肝臓肥大、神経系の進行性の悪化、認知機能の損失、並びに早期死亡が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に提供されるベクターは、有効量の当該導入遺伝子を含むウイルスベクターを哺乳動物の肝臓組織に投与した後、有効量の酸性スフィンゴミエリナーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターを哺乳動物のＣＮＳに投与するのに非常に
好適である。別の実施形態では、ウイルスベクターが送達されるＣＮＳの領域は、脳である。

更なる態様では、有効量の酸性スフィンゴミエリナーゼポリペプチド（例えば、ｈＳＭＰＤ１）をコードする導入遺伝子を含むＡＡＶウイルスベクターを哺乳動物の肝臓組織に投与し、続いて、有効量の酸性スフィンゴミエリナーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを哺乳動物のＣＮＳに送達し、それによって哺乳動物におけるＮＰＡを治療することによって、ＮＰＡに罹患する哺乳動物におけるニーマンピック病Ａ型（ＮＰＡ）を治療するための方法が提供される。別の実施形態では、ウイルスベクターが送達されるＣＮＳの領域は、脳である。

１．ヒト酸性スフィンゴミエリンホスホジエステル１（ｈＳｍｐｄ１）
ＳＭＰＤ１遺伝子は、酵素活性を有し、酸性スフィンゴミエリナーゼ（又はＡＳＭａｓｅ）としても知られているＳＭＰＤ１タンパク質をコードする。本明細書で使用される「機能性ＳＭＰＤ１タンパク質」又は「機能性ＡＳＭａｓｅ」（ヒトＳＭＰＤ１又はｈＳＭＰＤ１とも呼ばれる）は、脂肪が細胞内に蓄積しないように、脂質スフィンゴミエリンをセラミドに変換することができる。ＳＭＰＤ１酵素機能の損失は、ニーマンピック病Ａ型を有する人々における脳、肺、脾臓、及び肝臓を含む、組織及び器官の細胞損失並びに機能障害と関連する。

本明細書で使用される場合、「機能性ｈＳｍｐｄ１」という用語は、ＮＰＡを有しない患者からの天然（野生型）ｈＳＭＰＤ１の生物学的活性レベルの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はほぼ同じ、又は１００％超を提供するＳＭＰＤ１酵素を指す。

ｈＳＭＰＤ１は、例えば、全長タンパク質（シグナルペプチド及び成熟タンパク質を含む）、成熟タンパク質、本明細書に記載の短い天然シグナルペプチド（例えば、６２９個のアミノ酸）を有する成熟タンパク質、全長天然シグナルペプチド（例えば、６３１個のアミノ酸）を有する成熟タンパク質、外因性シグナルペプチドを有する成熟タンパク質、又は機能的断片であり得る。

本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」は、新たに合成されるタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチドを指す。シグナルペプチド、及びいくつかの事例において、かかるペプチドをコードする核酸配列は、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、トランジットペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドと呼ばれることもある。

本明細書に記載されるように、ｈＳＭＰＤ１は、天然シグナルペプチド（すなわち、配列番号２又は配列番号３０のアミノ酸１～４６）、又は代替的に、外因性シグナルペプチドを含み得る。配列番号２のｈＳＭＰＤ１の番号付けを参照すると、シグナルペプチド（配列番号２又は配列番号３０の約アミノ酸１位～４６位）が存在し、成熟タンパク質は配列番号２（又は配列番号３１）の約アミノ酸４７～約６２９を含む。配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号２３にも再現されている。

特定の実施形態では、ｈＳＭＰＤ１は、外因性源タンパク質からのシグナルペプチドを含む。特定のＮＰＡはより長いシグナルペプチドと会合しているため、選択されるシグナルペプチドは、一般に、本明細書の構築物に提供されるのと同じ長さであるように選択される（例えば、約４６個のアミノ酸であるが、より短い、例えば、約１０～約２５個のアミノ酸の長さであるように選択され得る）。特定の実施形態では、かかる外因性シグナル
ペプチドは、好ましくは、ヒト起源のものであり、例えば、ＩＬ－２シグナルペプチドを含み得る。他のシグナル／リーダーペプチドは、とりわけ、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、インスリン、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ、又はフィブロネクチン分泌シグナルペプチドに天然に認められ得る。また、例えば、ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。かかるキメラｈＳｍｐｄ１は、天然シグナルペプチド全体の代わりに外来性リーダーを有し得る。任意選択的に、ｈＳｍｐｄ１酵素のＮ末端切断は、シグナルペプチドの一部のみ（例えば、約２～約２５個のアミノ酸、又はその間の値のアミノ酸の欠失）、シグナルペプチド全体、又はシグナルペプチドよりも長い断片（例えば、最大約アミノ酸４６まで）を欠いていてもよい。任意選択的に、かかる酵素は、約５、１０、１５、又は２０個のアミノ酸長のＣ末端切断を含有し得る。

特定の実施形態では、機能性ｈＳＭＰＤ１は、配列番号２の配列（アミノ酸１～６２９）と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のタンパク質をコードする配列を有するものが選択され得る。配列番号２３は、配列番号２と同じアミノ酸配列を有するが、異なるコード配列を有する。特定の実施形態では、配列番号２又は２３の成熟タンパク質（アミノ酸４７～６２９）と少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一のタンパク質をコードするｈＳＭＰＤ１配列が提供される。例えば、特定の実施形態では、ｈＳＭＰＤ１タンパク質は、配列番号２又は２３の番号付けに関して、３６位にＡｌａ置換及び／又は５０６位にＲ置換を有する。

特定の実施形態では、機能性ｈＳＭＰＤ１は、配列番号３の配列（アミノ酸１～６２９）と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のタンパク質をコードする配列を有するものが選択され得る。特定の実施形態では、配列番号３の成熟タンパク質（アミノ酸４７～６２９）と少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一のタンパク質をコードするｈＳＭＰＤ１配列が提供される。例えば、特定の実施形態では、ｈＳＭＰＤ１タンパク質は、配列番号３の番号付けに関して、３６位にＶａｌ、及び／又は５０６位にＲ置換を有する。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置き換え」又は「保存的アミノ酸置換」は、当業者によって知られている、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する異なるアミノ酸へのアミノ酸の変更、置き換え、又は置換を指す。また、例えば、ＦＲＥＮＣＨ ｅｔ ａｌ．Ｗｈａｔ ｉｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ？Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｈ １９８３，Ｖｏｌｕｍｅ１９，Ｉｓｓｕｅ２，ｐｐ１７１－１７５ａｎｄ ＹＡＭＰＯＬＳＫＹ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５
Ａｕｇ；１７０（４）：１４５９－１４７２を参照されたく、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

一態様では、機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、核酸配列、例えば、それを含む発現カセット及びベクターが本明細書に提供される。一実施形態では、核酸配列は、配列番号４の操作ｈＳＭＰＤ１配列であり、これは、配列番号２又は２３の番号付けを参照して、３６位にＡを有するｈＳＭＤＰ１をコードし、３６位にＡｌａ（Ａ）及び５０６位にＧｌｙ（Ｇ）を有する６２９個のアミノ酸のｈＳＭＰＤ１タンパク質（短いリーダー配列を有する）である。具体的には、核酸配列は、配列番号４の操作ｈＳＭＰＤ１配列と少なくとも約８０％同一であり、これは、配列番号２の番号付けを参照して、３６位にＡｌａを有する機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、天然シグナルペプチドを有する６２９個のアミノ酸のｈＳＭＰＤ１タンパク質
である。他の実施形態では、コードされるタンパク質は、より長い天然シグナルペプチドを有する６３１個のタンパク質である。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、５０６位にＡｒｇ（Ｒ）を有する。

別の一態様では、機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、核酸配列、例えば、それを含む発現カセット及びベクターが本明細書に提供される。一実施形態では、核酸配列は、配列番号２２の操作ｈＳＭＰＤ１配列（ｈＭＰＤＤ１．ＣｏＶ２又はＣｏＶ２）であり、これは、配列番号２及び２３の番号付けを参照して、３６位にＡを有するｈＳＭＰＤ１をコードし、３６位にＡｌａ（Ａ）及び５０６位にＧｌｙ（Ｇ）を有する６２９個のアミノ酸のｈＳＭＰＤ１タンパク質（短いリーダー配列を有する）である。具体的には、ｈＳＰＭＰＤ１．ＣｏＶ２核酸配列は、配列番号２２の操作されたｈＳＭＰＤ１配列と少なくとも約８０％同一であり、これは、配列番号２及び２３の番号付けを参照して、３６位にＡｌａを有する機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、天然シグナルペプチドを有する６２９個のアミノ酸のｈＳＭＰＤ１タンパク質である。他の実施形態では、コードされるタンパク質は、より長い天然シグナルペプチドを有する６３１個のタンパク質である。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、５０６位にＡｒｇ（Ｒ）を有する。

一態様では、機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする核酸配列、例えば、それを含む発現カセット及びベクターが本明細書に提供される。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５の操作ｈＳＭＰＤ１配列であり、これは、配列番号３の番号付けを参照して、３６位にＶを有するｈＳＭＰＤ１をコードし、３６位にＶａｌ（Ｖ）及び５０６位にＧｌｙ（Ｇ）を有する６２９個のアミノ酸のｈＳＭＰＤ１タンパク質（短いリーダー配列を有する）である。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号５の操作ｈＳＭＰＤ１配列と少なくとも約８０％同一であり、これは、配列番号３の番号付けを参照して、３６位にＡｌａを有する機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、天然シグナルペプチドを有する６２９個のアミノ酸のｈＳＭＰＤ１タンパク質である。他の実施形態では、コードされるタンパク質は、より長い天然シグナルペプチドを有する６３１個のタンパク質である。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、５０６位にＡｒｇ（登録商標）を有する。

本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、並びに上述の合成形態及び混合ポリマーを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかの種類のヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸オリゴマー）の修飾形態を指す。この用語はまた、一本鎖形態及び二本鎖形態のＤＮＡも含む。当業者は、これらの核酸分子の機能性バリアントが本明細書に記載されていることを理解するであろう。機能性バリアントは、標準的な遺伝子コードを使用して直接的に翻訳され、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列である。

特定の実施形態では、本明細書に記載の機能性ｈＳｍｐｄ１をコードする核酸分子、及び他の構築物は、発現カセット及びベクターゲノムを生成するのに有用であり、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現のために操作され得る。方法は既知であり、以前に記載されている（例えば、ＷＯ９６／０９３７８）。野生型配列と比較して少なくとも１つの好ましくないコドンが、より好ましいコドンによって置き換えられる場合、配列は、操作されたものとみなされる。本明細書において、好ましくないコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも生物において使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンは、好ましくないコドンよりも生物において使用される頻度が高いコドンである。特定の生物のコドン使用頻度は、コドン頻度表、例えば、ｋａｚｕｓａ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎのコドン頻度表に見出すことができる。好ましくは
、１つより多くの好ましくないコドン、好ましくは、大部分又は全ての好ましくないコドンは、より好ましいコドンによって置き換えられる。好ましくは、生物において最も頻繁に使用されるコドンは、操作された配列で使用される。好ましいコドンによる置き換えは、一般に、より高い発現をもたらす。また、遺伝子コードの縮重の結果として、多数の異なる核酸分子が同じポリペプチドをコードすることができることも当業者によって理解されるであろう。また、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、核酸分子によってコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行ってもよいことも理解される。したがって、別途指定されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いに縮重態様であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。核酸配列は、日常的な分子生物学技術を使用してクローニングするか、又はＤＮＡ合成によってデノボで生成することができ、これは、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野で事業を有するサービス企業（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって日常的な手順を使用して実施することができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸、発現カセット、ベクターゲノムは、操作配列であるｈＳＭＰＤ１コード配列を含む。特定の実施形態では、操作配列は、対象における産生、転写、発現、又は安全性を改善するのに有用である。特定の実施形態では、操作配列は、得られる治療用組成物又は治療の有効性を増加させるのに有用である。更なる実施形態では、操作配列は、発現される機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質の有効性を増加させるのに有用であり、機能性ｈＳＭＰＤ１を送達する治療試薬の用量を下げることも可能にし得る。特定の実施形態では、操作ｈＳＭＰＤ１コード配列は、野生型ｈＳＭＰＤ１コード配列と比較して、改善された翻訳割合を特徴とする。

有効性は、嗜眠行動の改善、歩行異常の減少又は安定化、ＣＮＳ／呼吸器／心臓への関与を含む様々な好適な方法によって決定され得る。例えば、運動協調を評価するために、動物にロータロッドパフォーマンス試験を実施し得る。脳切片上のフィリピン免疫染色は、コレステロール堆積を検出するために使用され得る。特定の実施形態では、有効性は、蓄積されたコレステロールの量の減少によって決定される。有効性を測定するための他のアッセイは、スフィンゴミエリン定量（肝臓／脳／脾臓）及びキチナーゼアッセイ（疾患重症度のバイオマーカー）を含み得る。

特定の実施形態では、本明細書で提供される対象は、ＳＮＡＰ病理学を介して、及び／又はバイオマーカーの使用を介して、ＤＲＧ病理学についてモニタリングされる。例えば、２０２１年１１月１５日に出願された米国特許出願第６３／２７９，５６１号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。

「操作」とは、本明細書に記載の機能性ｈＳＭＰＤ１酵素をコードする核酸配列が組み立てられ、任意の好適な遺伝子要素、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置され、それらは、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、又はパッケージング宿主細胞中でウイルスベクターを生成するために、及び／又は対象の宿主細胞への送達のために、その上に担持されるｈＳｍｐｄ１配列を宿主細胞へと導入することを意味する。特定の実施形態では、遺伝子要素は、ベクターである。一実施形態では、遺伝子要素は、プラスミドである。かかる操作された構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

核酸配列の文脈において、「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一パーセント」という用語は、対応のために整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、構築物の全長、遺伝子コード配列の全長、又は少なくとも約５００～１０００個のヌクレオチドの断片にわたるものであってもよい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドを有する、より小さな断片間の同一性も望ましい場合がある。

同一性パーセントは、タンパク質、ポリペプチド、約１００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、若しくはそのペプチド断片、又は対応する核酸配列コード配列の全長にわたるアミノ酸配列について容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８個の長さのアミノ酸であり得、最大約５０個のアミノ酸であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列又は「アラインメント」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。

同一性は、配列のアラインメントを調製することによって、当該技術分野で既知の又は市販の様々なアルゴリズム及び／又はコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）によって決定され得る。アラインメントは、公的又は商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの配列アラインメントプログラムが、アミノ酸配列に利用可能である。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。代替的に、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又はアラインメントを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

２．発現カセット
特定の実施形態では、機能性ｈＳｍｐｄ１をコードする操作核酸配列と、その発現を指示する制御性配列とを有する、発現カセットが本明細書で提供される。更なる実施形態では、機能性ｈＳｍｐｄ１をコードする本明細書に記載の操作核酸配列と、その発現を指示する制御性配列とを有する、発現カセット。

本明細書で使用される場合、「発現」又は「遺伝子発現」という用語は、遺伝子からの情報が、機能性な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、又は核酸ポリマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＰＮＡなど）であり得る。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指示又
は調節する、それと操作可能に連結された制御性配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」配列は、核酸配列と連続又は非連続である制御性配列及びトランス又はシス核酸配列で作用する制御性配列の両方を含む。かかる制御性配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の要素の中で、遺伝子配列の上流（５’～）の制御性配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのうちの１つ以上、及びエンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’～）の制御性配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含有し得る。特定の実施形態では、制御性配列は、遺伝子産物の核酸配列と操作可能に連結され、制御性配列は、介在する核酸配列、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）によって、遺伝子産物の核酸配列から分離される。特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の遺伝子産物の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、モノシストロン性又はバイシストロン性発現カセットであり得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。

典型的には、かかる発現カセットは、ウイルスベクターを生成するために使用することができ、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御性配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含有し得る。

特定の実施形態では、発現カセットは、機能性ｈＳＭＰＤ１（そのバリアント及び断片を含む）及びプロモーターのコード配列を含む核酸ポリマーを指す。更なる実施形態では、発現カセットは、プロモーターに加えて、１つ以上の制御性配列を含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、ベクターゲノムである。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、ベクターにパッケージングされる。特定の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを含むプラスミドが提供される。

本明細書で使用される場合、「制御性配列」又は「発現制御性配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などの核酸配列を指し、それらが作動可能に連結されるタンパク質コード核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、さもなければ制御する。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、ｈＳｍｐｄ１をコードする核酸配列と隣接する発現制御性配列、並びに／又はその転写及び発現を制御するためにトランスで若しくは離れて作用する発現制御性配列の両方を指す。

「異種」という用語は、タンパク質、又はプラスミド、発現カセット、若しくはベクターにおける核酸と関連して使用される場合、タンパク質又は核酸は、当該タンパク質又は核酸が天然には互いに同じ関係で認められない別の配列若しくはサブ配列で存在することを示す。

特定の実施形態では、提供される発現カセットは、ニワトリβ－アクチンプロモーターであるプロモーターを含む。様々なニワトリベータ－アクチンプロモーターが単独で、又は様々なエンハンサー要素（例えば、ＣＢ７（ＣＢ７ハイブリッドプロモーターとも呼ばれる）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ ＩＥ）エンハンサー要素、ＣＡＧプロモーターを有するニワトリベータ－アクチンプロモーターであり、プロモーター、ニワトリベータアクチンの第１のエクソン及び第１のイントロン、ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む）若しくはＣＢｈプロモーターと組み合わせて記載されている［ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（
９）：１１４３－１１５３］。特定の実施形態では、発現カセットは、ユビキチンプロモーター、ＵｂＣであるプロモーターを含む。

他の実施形態では、好適なプロモーターとしては、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ１ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ
ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９
Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ， Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。

組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓及び他の組織（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６）、骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４）、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞受容体鎖）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどの神経プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５）、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）などについて周知である。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである。代替的に、調節可能なプロモーターが選択されてもよい。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであり得るか、又は異なり得る。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／
ｂｉｋエンハンサー又はＣＭＶエンハンサー（例えば、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー）を含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される。なお更なる実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータ－アクチンイントロン、ヒトβ－グロブリンイントロン、ＳＶ４０イントロン、及び／又は市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロン（すなわち、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン）を更に含む。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されるものなどが含まれる。

提供される発現カセットは、ウッドチャック（ＷＰＲＥ）、ヒト（ＨＰＲＥ）、ジリス（ＧＰＲＥ）、若しくはホッキョクジリス（ＡＧＳＰＲＥ）の肝炎ウイルス由来の転写後調節要素などの１つ以上の発現エンハンサー、又は合成転写後調節要素を含み得る。これらの発現増強要素は、３’ＵＴＲ中に配置された場合に特に有利であり、ｍＲＮＡの安定性及び／又はタンパク質収率を有意に増加させることができる。特定の実施形態では、提供される発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）又はそのバリアントである制御性配列を含む。好適なＷＰＲＥ配列は、本明細書に記載のベクターゲノムに提供され、当該技術分野で既知である（例えば、参照により組み込まれる、米国特許第６，１３６，５９７号、同第６，２８７，８１４号、及び同第７，４１９，８２９号に記載されるものなど）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る修飾ＷＰＲＥ配列である［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる］。

更に、提供される発現カセットは、好適なポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロビンポリＡ（ウサギベータグロビンポリＡ又はＲＢＧポリＡとも呼ばれる）である。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。別の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモンポリＡである。代替的に、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ５０ポリＡ、又は合成ポリＡが含まれる。

特定の実施形態では、発現カセットは、非翻訳領域に１つ以上のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ又はマイクロＲＮＡとも称される）標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子発現が望ましくない、及び／又は導入遺伝子発現のレベルの低減が望ましい細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節におけるｈＳＭＰＤ１の発現を特異的に低減するｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、並びに／又は発現カセットの３’及び５’ＵＴＲの両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ＤＲＧ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、同じか又は異なり得る少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列及び少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデムリ反復の第１の開始は、ｈＳｍｐｄ１コード配列の５’又は３’末端から２０個のヌクレオチド以内にある。特定の実施形態では、少なくとも２つのＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＳＭＰＤ１コード配列の５’又は３’末端から少なくとも１００個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡタンデム反復は、２００～１２００個のヌクレオチドの長さを含む。例示的なＤＲＧ標的化配列（例えば、ｍｉＲ１８２）は、配列番号２４に提供され、４ｘタンデム反復は配列番号２８に提供される。特定の実施形態では、ｍｉＲ標的の包含は、ｍｉＲ標的配列を欠く発現カセットと比較して、１つ以上の標的組織における治療用導入遺伝子の発現又は有効性を修飾しない。特定の実施形態では、ｍｉＲは、ｍｉＲ１８３である。２０１９年１２月２０日に出願され、２０２０年６月２５日に
ＷＯ２０２／１３２４５５として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号、２０２１年５月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０３２００３号（２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９４号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５６２号、及び２０２０年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号に対する優先権を主張し、これらの全ては参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたく、ここで、ＷＯ２０２１／２３１５７９として公開され、２０２１年１１月１８日に公開された。

例示的な発現カセットの例は、以下の実施例に提供され、例えば、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター（ＣＭＶ ＩＥエンハンサー及びＣＢプロモーターを含む）、ニワトリベータアクチンイントロン、ｈＳＭＰＤ１．Ｖ３６Ａ．ｃｏ（配列番号４）、及びウサギベータグロビンポリＡ（配列番号８）を含む、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ（ＴＹ）．ＲＢＧが含まれる。別の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン、配列番号２２のｈＳＭＰＤ１ｃｏｖ２コード配列）、及びウサギベータグロビンポリＡ［ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏｖ２．ＲＢＧ（配列番号２１）］を含む。更に別の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン、配列番号２２のｈＳＭＰＤ１ｃｏｖ２コード配列、４ｘｍｉＲ［配列番号２８、配列番号２４の４つのコピーを含む］、及びウサギベータグロビンポリＡ［ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏＶ２．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ（配列番号１９）］を含む。

これら及び記載される発現カセットにおける組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されることが意図されることを理解されたい。

３．送達ベクターの産生
一態様では、機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする核酸配列を含むベクターが本明細書に提供される。特定の実施形態では、ベクターは、ｈＳｍｐｄ１コード配列の送達のための本明細書に記載の発現カセットを含む。

本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例には、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ベクターは、核酸分子であり、機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする操作核酸がその中に挿入され得、次いで、適切な標的細胞に導入することができる。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。例えば、薬剤耐性遺伝子をコードするベクターは、多くの場合、ベクターを含む細胞を、含まない細胞から選択することができる手段を有する。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特徴付け、又は定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。

特定の実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、本明細書に記載される発現カセット（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲートを含む、様々な組成物及びナノ粒子と組み合わされ得、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）及び本明細書に記載されるような他の構築物を含む。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０
１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、ｈＳＭＰＤ１をコードする核酸配列を含有する発現カセットが、ウイルスカプシド若しくはエンベロープの中にパッケージングされ、ウイルスカプシド若しくはエンベロープ内にパッケージングされたいずれのウイルスゲノム配列も、複製欠損である（すなわち、標的細胞に感染する能力を保持するが、後代ビリオンを生成することはできない）、合成又は人工のウイルス粒子を指す、「複製欠陥ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するｈＳＭＰＤ１をコードする核酸配列のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じ得ないので、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレンチウイルスである。

特定の実施形態では、ｈＳＭＰＤ１コード配列を含む核酸を有する宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のｈＳＭＰＤ１コード配列を有するプラスミドを含む。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）であり得、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入される、外因性ＤＮＡ又は異種ＤＮＡを含有する。宿主細胞の例としては、単離された細胞、細胞培養、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系細胞、ニューロン、グリア細胞、又は幹細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＳＭＰＤ１の産生のための発現カセットを含み、それによってタンパク質が単離又は精製のためにインビトロで十分な量で産生される。特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＳＭＰＤ１をコードする発現カセット（例えば、その機能的断片を含む）を含む。本明細書で提供される場合、ｈＳＭＰＤ１ポリペプチドは、治療剤（すなわち、酵素補充療法）として対象に投与される薬学的組成物中に含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能性ｈＳｍｐｄ１の発現が所望される任意の細胞を指す。特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、ＮＰＡ疾患の治療を受けている対象の細胞を指すことが意図される。標的細胞の例としては、肝臓細胞、腎臓細胞、平滑筋細胞、及びニューロンが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ベクターは、エクスビボで標的細胞に送達される。特定の実施形態では、ベクターは、インビボで標的細胞に送達される。

本明細書に記載のベクター中の組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

４．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶが本明細書で提供される。ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、本明細書に記載される機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする核酸配列と、標的細胞中でｈＳＭＰＤ１の発現を指示する制御性配列と、ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ３’ＩＴＲに隣接する本明細書で提供される発現カセットを含む。このようなｒＡＡＶは、ＮＰＡ疾患の治療における使用に好適である。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ．ｈＳｍｐｄ１」は、ｈＳＭＰＤ１コード配列を含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶを指す。「ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＭＰＤ１」は、ＡＡＶｈｕ６８カプシド及びｈＳＭＰＤ１コード配列を含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶを指す。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ベクター内にパッケージングされる核酸配列を指す。一実施形態では、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターを形成するｒＡＡＶカプシド内にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、利便性のため、及び規制当局の承認を促進させるために使用され得る、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、外部Ａ要素が欠失している、１３０塩基対の短縮ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。理論に拘束されたくはないが、短縮されたＩＴＲは、内部（Ａ’）要素を鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻されると考えられる。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、制御性配列、ｈＳＭＰＤ１コード配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮されたバージョンについて記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

特定の実施形態では、５’ＩＴＲ、プロモーター、ニワトリベータ－アクチンイントロン、ｈＳＭＰＤ１コード配列、ポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、５’ＩＴＲ、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター、ニワトリベータ－アクチンイントロン、ｈＳＭＰＤ１コード配列、ウサギグロビンポリＡ配列を含むベクターゲノム、及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、５’ＩＴＲ、ＴＢＧプロモーター、ニワトリベータ－アクチンイントロン、ｈＳＭＰＤ１コード配列、ＷＰＲＥ、ウシ成長ホルモンポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、５’ＩＴＲ、ＵｂＣプロモーター、ｈＳＭＰＤ１コード配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。

特定の実施形態では、配列番号２２のｈＳＭＰＤ１コード配列、又は配列番号２及び２３の機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号２２と少なくとも８０％同一
、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９９～１００％同一の配列を含む、ベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、配列番号４のｈＳＭＰＤ１コード配列、又は機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号４と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９９～１００％同一の配列を含む、ベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、配列番号５のｈＳＭＰＤ１コード配列、又は機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号５と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、若しくは少なくとも９９～１００％同一の配列を含む、ベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、配列番号８、１０、又は１４の発現カセットを含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、配列番号９、１１、１４、又は１５のベクターゲノムを含むｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、配列番号１８のベクターゲノムを含むｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、配列番号２０のベクターゲノムを含むｒＡＡＶが提供される。

例示的なベクターゲノムの例は、以下の実施例に提供され、例えば、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター（ＣＭＶ ＩＥエンハンサー及びＣＢプロモーターを含む）、ニワトリベータアクチンイントロン、ｈＳＭＰＤ１．Ｖ３６Ａ．ｃｏ（配列番号４）、及びウサギベータグロビンポリＡ（配列番号８）を含むＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ（ＴＹ）．ＲＢＧ．ＩＴＲが含まれ、５’末端では５’ＡＡＶ ＩＴＲのスペーサー配列が隣接し、その３’末端ではスペーサー配列及び３’ＩＴＲが隣接する。例えば、配列番号９を参照されたく、任意選択で、全長５’及び３’ＩＴＲを更に含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン、配列番号２２）のｈＳＭＰＤ１ｃｏｖ２コード配列、及びウサギベータグロビンポリＡを含む［ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏｖ２．ＲＢＧ．ＩＴＲ（配列番号２０）］。配列番号２０は、配列番号２１の発現カセットを含み、５’末端では５’ＡＡＶ
ＩＴＲ、スペーサー配列、その３’末端ではスペーサー配列及び３’ＩＴＲが隣接する。更に別の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、スペーサー配列、配列番号１９の発現カセット（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏＶ２．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ）、スペーサー配列、及び３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、例えば、ｒＡＡＶカプシド（ウイルス粒子）にパッケージされる場合、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは全長配列である。配列番号１９の発現カセットは、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン、配列番号２２のｈＳＭＰＤ１ｃｏｖ２コード配列、４ｘｍｉＲ［配列番号２８、配列番号２４の４つのコピーを含む］、及びウサギベータグロビンポリＡ［ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏＶ２．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ（配列番号１９）］を含む。

特定の実施形態では、これらのｒＡＡＶ．ｈＳＭＰＤ１を含む薬学的組成物が提供される。特定の実施形態では、これらのｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１カプシドのコードされる（推定）アミノ酸配列は、配列番号１７に再現される。ｈｕ６８カプシドを有するｒＡＡＶの産生に有用なＡＡＶｈｕ６８コード配列は、配列番号１７及び配列番号２９に提供される（ＡＡＶｈｕ６８Ｍ１９１）。例えば、２０２１年１０月１８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０５５４３６号及びＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」及び「人工ＡＡＶ」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、非天然に存在するプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、同じ
ＡＡＶの非隣接部分である異なる選択されたＡＡＶからか、非ＡＡＶウイルス供給源からか、又は非ウイルス供給源から得ることができる異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、擬似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法が挙げられる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者には利用可能であり、かつ／又は本明細書に記載の組成物及び方法の観点において利用可能であるアデノ随伴ウイルス、並びに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上述のＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及び米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）も参照されたい。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載し、参照により援用される。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離又は操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、種々の標的組織及び動物モデルにおける効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｈｕ６８として一般に同定されているＡＡＶ、既知の若しくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、又は未だ発見されていないＡＡＶ若しくはバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。ＡＡＶ９カプシドには、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一であるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが含まれる。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するｒＡＡＶは、例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字との組み合わせによって指定される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、各々「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題され、２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４及びＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８６１も
参照されたい。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して、「バリアント」という用語は、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味し、保存的アミノ酸置換を有するＡＡＶ配列、及びアミノ酸配列又は核酸配列にわたって少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％以上の配列同一性を共有するＡＡＶ配列を含む。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載の、又は既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／又は当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドの同一性パーセントを決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ得る。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９バリアント」は、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されるものを含む。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、天然及び操作されたクレードＦアデノ随伴ウイルスの中から選択される。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。参照により本明細書に組み込まれる、米国公開特許出願第２０２０／００５６１５９号を参照されたい。ＡＡＶｈｕ６８は、系統群Ｆ内にある。ＡＡＶｈｕ６８（配列番号２１）は、ｖｐ１の位置６７及び１５７の２つのコードされたアミノ酸によって、別の系統群ＦのウイルスであるＡＡＶ９とは異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３２）は、６７位にＡｌａ及び１５７位にＡｌａを有する。しかしながら、他の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、異なるクレード、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、若しくはＥから、又はこれらのクレードのいずれかからも外れたＡＡＶ供給源から選択される。

ｒＡＡＶｈｕ６８は、ＡＡＶｈｕ６８のカプシド及びベクターゲノムからなる。一実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８を含む組成物は、ｖｐ１タンパク質の異種集団、ｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体を含む。本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号１６（及び配列番号２９、ＡＡＶｈｕ６８Ｍ１９１）は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）をコードする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１７の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含む。これらの亜集団は、最低限でも、ある特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号１７のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。これら及び他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから、参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質よりも
少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、全てのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質の更なる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含有し得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、更に、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質が、配列番号１７の１から７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１６（又は配列番号２９）から産生されるｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号１７の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号１６（又は配列番号２９）と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質；配列番号１７（又は配列番号３２）の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１６若しくは配列番号２９（又は配列番号３３若しくは３４）の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号１７（又は配列番号３２）の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする、配列番号１６又は配列番号２９（又は配列番号３３若しくは３４）の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、並びに／又は配列番号１７（又は配列番号３５）の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１６（又は配列番号３５）の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号１７（又は配列番号３５）の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする、配列番号１６又は配列番号２９（又は配列番号３６若しくは３７）の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団であって、ｖｐ１タンパク質が、６７位にグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／又は１５７位にバリン（Ｖａｌ）を含むｖｐ１タンパク質の異種集団、任意選択で、１５７位にバリン（Ｖａｌ）を含むｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１７のアミノ酸配列の残基番号付けに基づいて、ｖｐ１タンパク質の５７位に位置するアスパラギン－グリシン対の少なくとも６５％のアスパラギン（Ｎ）、及びｖｐ１、ｖ２、及びｖｐ３タンパク質の３２９位、４５２位、及び／又は５１２位のアスパラギン－グリシン対の少なくとも７０％のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化されている、少なくとも１つの亜集団を含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。

本明細書で使用される場合、「コードされるアミノ酸配列」は、アミノ酸に翻訳される参照核酸配列の既知のＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「クレード（ｃｌａｄｅ）」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００複製のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用して決定される、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、並びにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別の系統群に含まれるか、又はこれらのクレード外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８）を参照されたい。これは、系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を同定する。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

ＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離又は操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、又は入手することができる。代替的に、ＡＡＶ配列は、文献又は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースで利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することを可能にする。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶである。「自己相補性ＡＡＶ」又はｓｃＡＡＶは、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の片割れが会合して、即時の複製及び転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するであろう。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ８，Ｎｕｍｂｅｒ１６，Ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ヌクレアーゼ耐性である。かかるヌクレアーゼは、単一のヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼの混合物であり得、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼ耐性ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドが完全に組み立てられたことを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップ中の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知である技術を使用して
生成することができる。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能性ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載の発現カセットと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするように機能する適切なヘルパーと、を含む宿主細胞を培養することを含む。また、本明細書で提供されるのは、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能性ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするように機能する適切なヘルパーと、を含有する宿主細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。

当業者に利用可能なｒＡＡＶを産生する他の方法を利用してもよい。好適な方法としては、限定されないが、バキュロウイルス発現系又は酵母を介した産生が挙げられ得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２、ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４、Ｌｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、及びＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓ
ｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。

高塩濃度での２ステップアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物産生物を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０により詳細が記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子をゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、このときＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９中間体は、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０の紫外吸光度で溶離液をモニタリングしながら塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９には最適未満であるが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶ９全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に達するときに溶離される画分から収集される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下での、かなりのパーセンテージの残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質は、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。

ｒＡＡＶの特徴評価又は定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子のパーセンテージを得る。一般に、空のカプシド及びパッケージされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、治療されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。次いで、抗ＡＡＶカプシド抗体は、変性カプシドタンパク質、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）を使用する。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放
射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料をとって、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って使用して、銀染色を実施してもよく、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。

一態様では、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料がプロテイナーゼＫバッファーで希釈され、プロテイナーゼＫで治療され、続いて熱不活性化されることを除き、標準的なアッセイと同様である。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫバッファーで希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテイナーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に又は代替え的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

また、カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３の比を決定する方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、及びＲｏｓｅ ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、ＮＰＡ疾患の１つ以上の症状を軽減するか、ｈＳｍｐｄ１の所望の機能を回復するか、又は疾患のバイオマーカーを改善する目的のための、組成物及び／又は方法を指す。いくつかの実施形態では、「治療」又は「治療すること」という用語は、本明細書に示される目的のために、本明細書に記載される１つ以上の組成物を対象に投与することを包含すると定義される。したがって、「治療」は、所与の対象において、ＮＰＡ疾患の発症若しくは進行を低減すること、疾患を予防すること、疾患の症状の重症度を低減すること、その進行を遅延させること、疾患の症状を除去すること、疾患の進行を遅らせること、又は療法の有効性を増加させること、のうちの１つ以上を含み得る。

本明細書に記載のｒＡＡＶにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

５．薬学的組成物又は製剤
特定の実施形態では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるベクター（例えばｒＡＡＶ）を含む薬学的組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、機能性ｈＳｍｐｄ１タンパク質との共投与に好適である。一実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物が提供される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なお更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、非ウイルス又はウイルスベクター系におけるｈＳｍｐｄ１コード配列を含む発現カセットを含む。これとしては、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質又は脂質様粒子、キトサンに基づく製剤、及び当該技術分野で既知であり、例えば、上に引用されるＲａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒによって記載されている）他のものが挙げられ得る。かかる非ウイルスベクター系は、例えば、プラスミド若しくは非ウイルス遺伝要素、又はタンパク質系のベクターを含み得る。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は別の組換えパルボウイルスなどの任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、それを必要とする患者にｈＳｍｐｄ１を送達するための組換えＡＡＶである。

一実施形態では、薬学的組成物は、ｈＳｍｐｄ１コード配列を含む発現カセットを含むベクターと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注射を介した送達に好適な製剤緩衝液とを含む。一実施形態では、ｈＳｍｐｄ１コード配列を含む発現カセットは、組換えＡＡＶにパッケージングされている。

一実施形態では、薬学的組成物は、酵素補充療法（ＥＲＴ）として対象に送達するため
の機能性ｈＳｍｐｄ１ポリペプチド又はその機能性断片を含む。このような薬学的組成物は通常、静脈内投与されるがいくつかの状況において、皮内、筋肉内、又は経口投与も可能である。組成物は、ＮＰＡ疾患に罹患しているか、又はそのリスクがある個体の予防的治療のために投与することができる。治療適用のために、薬学的組成物は、確立された疾患に罹患している患者に、蓄積した代謝産物の濃度を低減させ、かつ／又は代謝産物の更なる蓄積を防止若しくは阻止するのに十分な量で投与される。リソソーム酵素欠乏症のリスクがある個体について、薬学的組成物は、代謝産物の蓄積を防止又は阻害するのに十分な量で予防的に投与される。本明細書に記載のｈＳｍｐｄ１タンパク質を含む薬学的組成物は、治療有効量で投与される。概して、治療有効量は、対象における医学的状態の重症度、並びに対象の年齢、一般的状態、及び性別に応じて変化し得る。投薬量は、医師によって決定され得、観察された治療の効果に適するように、必要に応じて調整することができる。一態様では、単位用量のｈＳｍｐｄ１タンパク質又はその機能的断片を含むように製剤化されたＥＲＴのための薬学的組成物が本明細書に提供される。

特定の実施形態では、製剤は、水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、防腐剤、賦形剤、及び／又は緩衝液を更に含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、又はハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ）：Ｎａ１５０、Ｋ３．０、Ｃａ１．４、Ｍｇ０．８、Ｐ１．０、Ｃｌ１５５を有する人工ＣＳＦ）である。緩衝生理食塩水、界面活性剤、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムに相当するイオン強度まで調整された生理学的に適合する塩若しくは塩の混合物、又は同等のイオン濃度まで調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものを含む、様々な好適な溶液が既知である。

好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～８、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達では、この範囲内のｐＨが望ましいものであり得、一方、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましいものであり得る。しかしながら、他の送達経路では、最も広い範囲内の他のｐＨ、及びこれらの部分範囲が選択され得る。

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］（ポロキサマー１８８としても知られる）など、末端が一級ヒドロキシル基の二官能ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの）に続いて、３桁の数字を用いて命名され、初めの２桁の数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩
化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達では、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）であり、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達では、商業的に入手可能な希釈剤が懸濁化剤として、又は別の懸濁化剤及び他の任意選択的な賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。

特定の実施形態では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含有してもよい。好適な浸透促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡが含まれ得る。

一実施形態では、本明細書に記載の緩衝溶液中にｒＡＡＶを含有する凍結された組成物が凍結された形態で提供される。任意に、１つ以上の界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、安定化剤、又は防腐剤が、この組成物中に存在する。好適には、使用のために、組成物は解凍され、好適な希釈剤、例えば、滅菌食塩水又は緩衝化食塩水を用いて所望の用量に滴定される。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクター（例えばｒＡＡＶ）と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどが挙げられる。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが使用され得る。具体的には、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、若しくはナノ粒子、又は同等物のいずれかにカプセル化された送達のために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の当該ベクターが、薬学的組成物に含まれる。担体の選択は、本発明の制限ではない。防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されると、アレルギー又は同様の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投薬量若しくは総量、又は単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。

更に、複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は分数を含む、（体重７０ｋｇの平均対象を治療する）約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含有する投与量単位で製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、
又は９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なお更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、１グラムの脳質量当たり約１×１０^９ＧＣ～１グラムの脳質量当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。

特定の実施形態では、組成物は、任意の好適な経路による送達のために、好適な水性懸濁媒体（例えば、緩衝生理食塩水）中に製剤化され得る。本明細書で提供される組成物は、高用量のウイルスベクターの全身送達に有用である。ｒＡＡＶの場合、高用量は、少なくとも１×１０^１３ＧＣ、又は少なくとも１×１０^１４ＧＣであり得る。しかしながら、改善された安全性のために、本明細書に提供されるｍｉＲＮＡ配列は、他のより低い用量で送達される発現カセット及び／又はベクターゲノムに含まれ得る。

任意の好適な経路又は異なる経路の組み合わせによって、本明細書に記載の水性懸濁液又は薬学的組成物を必要とする対象にそれを送達するように設計される。一実施形態では、薬学的組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、又は大槽内注射を介した送達のために製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、静脈内（ＩＶ）注射によって、それを必要とする対象に送達するために設計される。代替的に、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋内、及び他の非経口経路）が選択され得る。特定の実施形態では、組成物は、本質的に同時に２つの異なる経路によって送達される。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔内への注射を介した、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内穿刺、後頭下／大槽内穿
刺、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰髄穿刺によって、クモ膜下腔空間全体にわたって拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。嚢内送達は、ベクター拡散を増加させ、かつ／又は投与によって引き起こされる毒性及び炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注射若しくは永久的に配置されたチューブを介した薬物の投与経路を指す。

本明細書に記載の薬学的組成物中の組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されることを意図していることを理解されたい。

６．治療方法
本明細書で提供されるように、治療有効量のｈＳｍｐｄ１コード配列を含む核酸配列又は発現カセットを送達することを含む、ＮＰＡ疾患のための方法が本明細書で提供される。具体的には、方法は、治療有効量のｒＡＡＶ．ｈＳｍｐｄ１、又は本明細書に記載のｈＳｍｐｄ１ポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に送達することによって、ＮＰＡ疾患の症状を予防、治療、及び／又は緩和することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットを含む組成物は、それを必要とする対象に投与される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｒＡＡＶを介して送達される。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」とは、ＮＰＡ疾患の１つ以上を緩和又は治療するために十分なｈＳｍｐｄ１の量を送達する組成物の量を指す。「治療」は、ＮＰＡ疾患の症状の悪化の予防、及び可能であればそれらの症状のうちの１つ以上の逆転を含み得る。ヒト患者についての「治療有効量」は、動物モデルに基づいて予測されてもよい。Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１４）；２２ １２，２０１８－２０２７、Ａ．Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍａｒｃｈ ２０１５，２６（１）：２７－３７（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

特定の実施形態では、治療には、ＮＰＡの１つ以上の症状を予防、治療、及び／又は緩和することを含む。

特定の実施形態では、治療は、ｒＡＡＶ系遺伝子治療を介して、患者の欠損ＳＭＰＤ１を置き換えるか、又は補充することを含む。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターから発現される場合、脳、脾臓、肝臓、又は他の組織若しくは体液において検出される正常レベルの少なくとも約５％の発現レベルは、治療効果を提供し得る。しかしながら、より高い発現レベルが成し遂げられ得る。かかる発現レベルは、正常な機能性ヒトＳＭＰＤ１レベルの約５％～約１００％であり得る。特定の実施形態では、正常な発現レベルより高いレベルが、血清、又は別の生体液若しくは組織で検出され得る。

提供される組成物及びその濃度の送達のために好適な容量は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択されてもよく、成人にはより高体積が選択される。典型的には、新生児のために、好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの容量が選択され得る。１０代前半及び１０代のために、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。更に他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容量での髄腔内投与を受け得、これが選択されるか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受け得る。他の好適な容量及び投薬量が、決定され得る。投薬量は、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために調整され、かかる投薬量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて変動し得る。

特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、１グラムの脳質量当たり約１×１０^９ＧＣ～１グラムの脳質量当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。

特定の実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノムにおいて、範囲内の全ての整数又は小数及びエンドポイントを含む、脳質量の１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量の１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量の１グラム当たり１×１０^１０ＧＣ～脳質量の１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１３ＧＣ
／ｇ、約５．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０ｘ１０^１４ＧＣ／ｇ脳質量である。

特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、免疫抑制剤を組み合わせて投与される。現在、そのような併用療法のための免疫抑制剤としては、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン若しくはラパログ）、及び細胞分裂阻害剤（アルキル化剤を含む）、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに対して活性のある物質が含まれるが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－アルファ）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日前、又はそれ以前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の共投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上は、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶは、酵素補充療法（例えば、ＳＭＰＤ１（ＡＳＭａｓｅとしても知られる）酵素補充）、シャペロン療法、基質低減療法などの療法（併用療法）と組み合わせて、及び／又は注入関連反応の可能性を低減する抗ヒスタミン薬若しくは他の薬剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、併用療法は、機能性ｈＳｍｐｄ１タンパク質である。投与は、外来患者への経口投与又は静脈内注入によるものであり得、毎日、隔日、毎週、隔週（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ体重）、毎月、又は隔月投与に好適な用量を含み得る。併用療法の適切な治療有効投薬量は、治療する臨床医によって選択され、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、及びおよそ２０ｍｇ／ｋｇ～およそ５０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、好適な治療用量は、例えば、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、又は５００ｍｇ／ｋｇから選択される。

特定の実施形態では、新生児（３ヶ月齢又はそれより若い）は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、３ヶ月齢～９ヶ月齢である乳児は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、９ヶ月齢～３６ヶ月齢の子供は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、３歳～１２歳の子供は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、１２歳～１８歳の子供は、本明細書に記載の方法に従って治療される。特定の実施形態では、１８歳以上の成人が、本明細書に記載の方法に従って治療される。

一実施形態では、ＮＰＡ疾患を有する患者は、少なくとも約３ヶ月齢～１２ヶ月齢未満の男児又は女児である。別の実施形態では、ＮＰＡ疾患を有する患者は、男性又は女性であり、少なくとも約６歳～最大１８歳である。他の実施形態では、対象は、より高齢又はより若くてもよく、男性であっても女性であってもよい。

特定の実施形態では、体重減少又は悪液質を緩和し、運動機能の損失を緩和し、認知機能の損失を緩和し、生存期間を延長することによってニーマンピックＡの治療及び／又はその症状を改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載のｒＡＡＶの使用が本明
細書に提供される。

７．デバイス及びキット
一態様では、本明細書に提供されるベクターは、例えば、ＷＯ２０１７／１３６５００（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法及び／又はデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的に、他のデバイス及び方法が選択され得る。要約すると、方法は、脊椎針を患者の大槽内に前進するステップと、１本の可撓性チューブを脊椎針の近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結するステップと、当該前進ステップ及び連結ステップ後、チューブを患者の脳脊髄液で自吸させた後で、一定量の等張溶液を含む第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結するステップと、その後、一定量の薬学的組成物を含む第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結するステップと、を含む。第１及び第２容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物は脊椎針を通して患者に注入され、薬学的組成物の注入後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、薬学的組成物を患者にフラッシュするために脊椎針中に注入される。この方法及びこのデバイスは、各々任意選択的に、本明細書で提供される組成物の髄腔内送達のために使用され得る。代替的に、他の方法及びデバイスが、かかる髄腔内送達のために使用され得る。

特定の実施形態では、製剤（任意選択的に凍結された）中に懸濁された濃縮されたベクターと、任意選択的な希釈緩衝液と、静脈内、髄腔内、脳室内、又は嚢内の投与のために必要とされるデバイス及び構成要素とを含む、キットが提供される。一実施形態では、キットは、注入を可能にするために、十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮されたベクターの約１：１～１：５希釈、又はそれ以上の希釈を可能にし得る。そのようなキットは、併用療法が利用される追加の非ベクターベースの活性成分、及び／又は抗ヒスタミン剤、免疫調節剤などを含み得る。他の実施形態では、より多量若しくはより少量の緩衝液又は滅菌水が含まれ、治療を行う医師により、用量滴定及び他の調整が可能になる。更に他の実施形態では、キットには、デバイスの１つ以上の構成要素が含まれる。好適な希釈緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はグリセロール／ＰＢＳが利用可能である。

本明細書に記載のキットにおける組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されることを意図していることを理解されたい。

本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、任意の細胞、生体液、又は組織を指す。本発明で使用するための好適な試料としては、全血、白血球、線維芽細胞、血清、尿、血漿、唾液、骨髄、脳脊髄液、羊水、及び皮膚細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。そのような試料は、生理食塩水、緩衝液、又は生理学的に許容される希釈剤で更に希釈され得る。代替的に、このような試料は、従来の手段によって濃縮される。

これらの発明の説明に関して、本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、本発明の方法で有用であることが意図される。加えて、本方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用されている多くの用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」は、臨床研究に使用される男性又は女性のヒト、及び動物モデルを指す。特定の実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ＮＰＡ疾患と診断されたヒトである。更なる実施形態では、これらの方法及び組成物のヒト対象は、出生前、新生児、乳児、幼児、未就学児、小学生、十代、若年成人、又は成人である。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の構成要素又は方法ステップを包含することを意味する用語である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は、他の構成要素又は方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語、及び実施形態又は発明の性質を実質的に変化させる任意の構成要素又は方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する記述を含むことを理解されたい。本明細書における様々な実施形態は、「含む」という言語を用いて示されるが、様々な状況下で、関連する実施形態はまた、「からなる」又は「本質的にからなる」という言語を用いて記載されることも理解されたい。

一実施形態を説明する際の「一実施形態」、「別の実施形態」、又は「特定の実施形態」への言及は、別段の明示的な指定がない限り、参照される実施形態が別の実施形態（例えば、参照される実施形態の前に説明される実施形態）と相互に排他的であることを意味するものではない。

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「発現カセット（ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、１つ以上の発現カセットを表すと理解されることに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ
ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラス又はマイナス１０％の変動を意味する。

本明細書に記載のデバイスにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明が説明される。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。

実施例１：ＮＰＣの治療のためのｒＡＡＶ．ｈＳＭＰＤ１
ベクターゲノムを含むシスプラスミドを、配列番号４のｈＳＭＰＤ１Ｖ３６Ａコード配列、又は配列番号５の３６位にＶを有するｈＳＭＰＤ１をクローニングすることによって生成した。ベクターゲノムは、ベクターゲノムの５’末端の最末端に短縮されたＡＡＶ２（１３０ｂｐ）５’ＩＴＲ、発現カセット、及びベクターゲノムの３’末端の最末端に短縮されたＡＡＶ２（１３０ｂｐ）３’ＩＴＲを有するように設計した。ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、コード配列、及びウサギベータグロビンポリＡ（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ．ＲＢＧ、配列番号８又は配列番号９）を含む発現カセットを使用して、配列番号１１又は配列番号１１のベクターゲノムを有するｒＡＡＶを生成した。ＵｂＣ
プロモーター、コード配列、及びＳＶ４０ポリＡ配列（ＵｂＣ．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ．ＳＶ４０、配列番号１４）を含む発現カセットを使用して、配列番号１５のベクターゲノムを有するｒＡＡＶを生成した。組換えＡＡＶ９ウイルス粒子は、上記のシスプラスミド、ＡＡ２ ｒｅｐ機能及びＡＡＶカプシドコード配列を含むトランスプラスミド、及びヘルパープラスミドのうちの１つを有するパッケージング２９３宿主細胞のトリプルトランスフェクションによって産生される。

得られたｒＡＡＶ．ｈＳＭＰＤ１を、実施例２の比較研究で使用した。

実施例２：ＮＰＡの治療のための脳室内（ＩＣＶ）注入を介したＡＡＶ．ｈＳＭＰＤ１の送達
Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスモデルを、マウスＳｍｐｄ１遺伝子（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）のエクソン２の欠失を通して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって生成した。得られた動物は、ＮＰＡ疾患の優れたモデルである。公開されたモデルと同様に、マウスは、嗜眠性であり、歩行異常を有し、ＣＮＳ／呼吸器／心臓病変の関与があり、未処置の動物は、標的組織内に有意な蓄積物質を示す。

１ヶ月齢のＳｍｐｄ１ ＫＯマウスは、６×１０^１０個のＡＡＶのゲノムコピーを受けた。ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１又はＡＡＶ．Ｕｂｃ．ｈＳＭＰＤ１はＩＣＶ注射を介した。コンパニオン対照マウスはＰＢＳを受けた。マウスを毎日観察し、毎週体重を測定した。運動協調を評価するために、マウスは、毎月ロータロッドパフォーマンス試験を実施した。ＰＢＳを受けたＳｍｐｄ１ ＫＯマウスは、時間の経過とともに転倒するまでの潜時の減少を示した。この行動障害は、ＡＡＶの送達によって救済された。ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１又はＡＡＶ．Ｕｂｃ．ｈＳＭＰＤ１をＳｍｐｄ１ ＫＯマウスに投与した。マウスを、注入の５．３ヶ月後に安楽死させた。脳、肝臓、脾臓、及び肺組織を採取し、固定して、組織学的分析のために処理した。コレステロール蓄積を検出するためのフィリピンによる脳切片上の免疫染色は、Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスにおける豊富な量のコレステロールを明らかにした。蓄積されたコレステロールの量は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１又はＡＡＶ．Ｕｂｃ．ｈＳＭＰＤ１を受けたＳｍｐｄ１ ＫＯマウスでは大幅に低減された。脂質で満たされたマクロファージの存在を検出するために、肝臓、脾臓、及び肺組織上でオイルレッド染色を行った。脂質で満たされたマクロファージの存在は、Ｓｍｐｄ１ ＫＯマウスに由来する３つの組織全てにおいて見られた。脂質で満たされたマクロファージ減少又は欠如は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１又はＡＡＶ．Ｕｂｃ．ｈＳＭＰＤ１を受けたＳｍｐｄ１ ＫＯマウスにおいて顕著であった。有効性の他の尺度は、スフィンゴミエリン定量（肝臓／脳／脾臓）及びキチナーゼアッセイ（疾患重症度のバイオマーカー）を含み得る。

これらの結果を図４Ａ～４Ｃに示す。

実施例３：非ヒト霊長類におけるＤＲＧ脱標的化配列を伴う及び伴わないＡＡＶ．ＣＢ７６．ｈＳＭＰＤ１の送達
更なる操作配列である配列番号２２を生成し（配列番号２及び２３をコードする）、更なる組換えＡＡＶベクターの生成に使用するために選択した。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１ｃｏＶ２ベクターを、４×ｍｉＲ１８２標的（結合配列）を伴うか又は伴わずに調製した。シスプラスミドを、ＡＡＶ２－５’ＩＴＲ、４コピー（４×）ｍｉＲ１８２標的（結合部位）（配列番号２４）を伴うか又は伴わない、ｈＳＭＰＤ１ｃｏＶ２コード配列（配列番号２２）を含む発現、及びＡＡＶ２－５’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含むように設計した。シスプラスミドを、２９３細胞内でのそれらの発現を指示する配列の制御下で、ｒｅｐをコードするトランスプラスミド、ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするトランスプラスミド、従来のトリプルトランスフェクション産
生法を使用してベクターゲノムを複製しｈｕ６８カプシドにパッケージングするためのアデノウイルスヘルパー配列を含むシスプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３パッケージング宿主細胞に共トランスフェクトした。得られたウイルス粒子を、本明細書ではＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ（ｍｉＲ結合部位を伴わない）又はＡＡＶ．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ．ｍｉＲ－ＴＳ（４ｘｍｉＲ１８２結合部位を伴う）と呼ぶ。ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤｃｏＶ２．ＲＢＧの発現カセットは配列番号２１に提供され、ＣＢ７プロモーター要素（配列番号２６）、ｈＣＭＰＤ１ｃｏＶ２コード配列（配列番号２２）、及びウサギグロビンポリＡ（配列番号７）を含む。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤｃｏＶ２．ＲＧＢ．ＩＴＲのベクターゲノムは配列番号２０に提供される。ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤｃｏＶ２．ｍｉＲ－ＴＳの発現カセットは配列番号１８に提供され、ＣＢ７プロモーター要素（配列番号２６）、ｈＣＭＰＤ１ｃｏＶ２コード配列（配列番号２２）、４ｘｍｉＲ１８２結合部位（配列番号２８）、及びウサギグロビンポリＡ（配列番号７）を含む。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＰＤｃｏＶ２．ｍｉＲ－ＴＳのベクターゲノムは配列番号１８を含む。

アカゲザルに、３ｘ１０^１３ＧＣ ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ又はＡＡＶ．ＣＢ７．ｈＳＭＰＤ１ｃｏ．ｍｉＲ－ＴＳをＩＣＭ注射した。動物を毎日観察し、神経伝導検査を介して、ＳＮＡＰ振幅及びバイオマーカーの検出によってＤＲＧ病理をモニターした。注射の２ヶ月後、動物を剖検し、生体内分布、ＡＳＭＤ発現、及びＤＲＧ病理について評価した。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。

２０２１年２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１４４，１０３号、２０２２年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６３／２８６，９３９号と同様に、本明細書に引用される全ての特許及び非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、本明細書に参照され、２０２２年１月２１日に生成された添付の配列表、２１－９６２７ＰＣＴ＿ＮＰＡ＿ＳＴ２５（７８ｋｂ）に表される配列番号は、参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (25)

1. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、ＡＡＶカプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｈＳＭＰＤ１）の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結された前記ｈＳＭＰＤ１をコードする操作核酸配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、前記ｈＳＭＰＤ１コード配列が、配列番号２２、若しくは機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号２２と少なくとも９９％同一のコード配列、配列番号５、若しくは機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号５と少なくとも９０％同一のコード配列、又は配列番号４、若しくは機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号４と少なくとも９０％同一のコード配列である、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
2. 前記ｈＳＭＰＤ１コード配列が、配列番号２の番号を参照して３６位にＡｌａ又はＶａｌを有する前記ｈＳＭＤ１タンパク質をコードする、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記ｈＳＭＰＤ１タンパク質が、配列番号２、配列番号２３、配列番号３、又は配列番号１の配列を有する、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記ｈＳＭＰＤ１タンパク質が、配列番号２（又は配列番号３１）、配列番号２３、配列番号３、又は配列番号１のアミノ酸４７～６３１を含むｈＳＭＰＤ１タンパク質と融合された外因性リーダー配列を含む、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記制御性配列が、ＵｂＣ又はＣＢ７プロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記制御性配列が、ＳＶ４０後期又はウサギベータグロビンポリアデニル化部位を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、ＣＢ７ハイブリッドプロモーター、イントロン、前記ｈＳＭＰＤ１コード配列、及びウサギベータグロビン配列、並びに任意選択で、４つ以上のｍｉＲ１８２又はｍｉＲ１８３結合部位を含む発現カセットを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ベクターゲノムが、配列番号２１、配列番号１９、配列番号１０、又は配列番号８の配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
9. 前記ベクターゲノムが、配列番号２０、配列番号１８、配列番号９、又は配列番号１１の配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
10. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、ＵｂＣプロモーター、前記ｈＳＭＰＤ１コード配列、及びＳＶ４０後期ポリアデニル化配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
11. 前記ベクターゲノムが、配列番号１４又は１５の配列を含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
12. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、全長ＡＡＶ２逆位末端反復配列を更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１～１２のいずれか一
    項に記載のｒＡＡＶ。
14. 製剤緩衝液中に請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの集団を含む、薬学的組成物。
15. ３６位にＡｌａを有する前記ｈＳＭＰＤ１をコードする前記ｒＡＡＶ、３６位にＶａｌを有するｈＳＭＰＤ１をコードする前記ｒＡＡＶ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の薬学的組成物。
16. 機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質を共投与するのに好適である、請求項１４又は１５に記載の薬学的組成物。
17. 脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注射を介した送達のために製剤化される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
18. 体重減少又は悪液質を緩和し、運動機能の損失を緩和し、認知機能の損失を緩和し、生存期間を延長することによってニーマンピックＡの治療及び／又はその症状を改善するのに使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 体重減少又は悪液質を緩和し、運動機能の損失を緩和し、認知機能の損失を緩和し、生存期間を延長することによってニーマンピックＡの治療及び／又はその症状を改善することにおける、請求項１～１３のいずれか一項記載のｒＡＡＶ、又は請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
20. 体重減少又は悪液質を緩和し、運動機能の損失を緩和し、認知機能の損失を緩和し、生存期間を延長することによってニーマンピックＡの治療及び／又はその症状を改善するための薬剤の調製における、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの使用。
21. 核酸分子であって、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｈＳＭＰＤ１）の発現を制御する配列と作動可能に連結された前記ｈＳＭＰＤ１をコードする操作核酸配列を含み、前記ｈＳＭＰＤ１コード配列が、配列番号２２、若しくは機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする、配列番号２２と少なくとも９０％同一のコード配列、配列番号４、若しくは機能性ｈＳＭＰＤ１をコードする、配列番号４と少なくとも９０％同一のコード配列、又は配列番号５、若しくは機能性ｈＳＭＰＤ１タンパク質をコードする、配列番号５と少なくとも９０％同一のコード配列である、核酸分子。
22. 請求項２１に記載の核酸分子を含む、ウイルス又は非ウイルスベクター。
23. 請求項２１に記載の核酸分子を含む、プラスミド。
24. ｒＡＡＶにパッケージングするためのベクターゲノムを含み、ベクター遺伝子が、操作核酸配列、制御性配列を含み、前記ベクターゲノムの５’末端の最末端及び３’末端の最末端に、それぞれ、５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含む、請求項２３に記載のプラスミド。
25. 請求項２２又は２４に記載のプラスミドと、それらの発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐコード配列及びＡＡＶ ｃａｐコード配列と、前記ベクターゲノムの前記ＡＡＶカプシドへの複製及びパッケージングを可能にするヘルパー機能と、を含む、パッケージング宿主細胞。

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