ES2605305T3

ES2605305T3 - Vectores de AAV que se dirigen al SNC y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2605305T3
Application number: ES11772784.2T
Authority: ES
Inventors: Guangping Gao; Hongwei Zhang; Hongyan Wang; Zuoshang Xu
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2017-03-13
Anticipated expiration: 2031-04-22
Also published as: CA2833908A1; EP2826860B1; JP2016127831A; US10731178B2; EP3540055A1; CA2833908C; CA3049237A1; JP2019089787A; US20190194689A1; JP6941632B2; US9102949B2; JP2016145189A; CA3066596A1; US20190276848A1; JP2021138702A; JP6879988B2; US20180148738A9; ES2698203T3; US20230332179A1; WO2011133890A8

Abstract

Un rAAV que comprende (i) una proteína de la cápside que comprende la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 9 y (ii) un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con un transgén para su uso en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica (ELA); en el que el rAAV va a administrarse a tejido del sistema nervioso central (SNC) de un sujeto por administración intratecal, y opcionalmente también se administra por administración intracerebral.

Description

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(baja) o 1:10 (alta). 0X: ningún sitio de unión de miARN; 1X: un sitio de unión de miARN; 3X: tres sitios de unión de miARN. Las células se fijaron y se tiñeron histoquímicamente con X-gal 48 horas después de la transfección y se contaron las células azules. Se comparó el porcentaje de células positivas para nLacZ en cada transfección con la transfección del plásmido de control (prAAVCBnLacZ). CB, β-actina de pollo; miR, microARN; nLacZ, transgén indicador de β-galactosidasa; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados.

La Figura 13 representa una evaluación in vivo del silenciamiento de transgén mediado por miARN endógeno en una transducción de rAAV9. (a-c) Se inyectaron ratones C588L/6 macho adultos por vía intravenosa con 5 x 1013 copias de genoma por kg (GC/kg) cada uno de rAAV9CBnLacZ (ningún sitio de unión), (a) rAAVCB9nLacZmiR-122BS (un sitio de unión de miR-122) y rAAV9C8nlacZ-(miR-122BS)3 (tres sitios de unión de miR-122), (b) BS rAAV9CBnLacZ-miR-1 (un sitio de unión de miR-1) y rAAV9CBnLacZ-(miR-1BS)3 (tres sitios de unión de miR-1), (c) rAAV9CBnLacZmiR-1BS-miR-122BS (1X cada sitio de unión) y rAAV9CBnLacZ-(miR-1BS)3-(miR-122BS)3 (tres sitios de unión de miR-1 y tres de miR-122). Se sacrificaron los animales 4 semanas después de la administración del vector, y se recogieron tejidos apropiados para el crioseccionamiento y tinción histoquímica con X-gal. miR, microARN; nLacZ, gen indicador de β-galactosidasa; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados, y (d) cuantificación de las actividades de β-galactosidasa en tejido de hígado de animales que recibieron vectores de rAAVnLacZ con y sin sitios de unión de miARN.

La Figura 14 representa un análisis de los niveles de expresión de miARN relacionado, ARNm, y proteína de genes diana de miARN endógeno en ratones transducidos con rAAV9CBnLacZ con o sin sitios de unión de miARN. Se preparó ARN o proteína celular total a partir de (a-c) hígado o (d) corazón. (a) Detección por transferencia Northern de miARN. ARN nuclear pequeño de U6 proporcionó el control de carga. (b) PCR cuantitativa de transcripción inversa que mide ARNm de ciclina G1. Los datos se presentan como niveles relativos de ARNm de ciclina G1 normalizados a β-actina. (c,d) Análisis de transferencia Western de niveles de proteína de dianas endógenas de miR-122 y miR-1. Se analizó proteína celular preparada a partir de (c) hígado o (d) corazón para ciclina G1 y calmodulina. (e) Niveles de colesterol en suero. Se recogieron muestras de suero de ratones que recibieron rAAV9 con o sin sitios de unión de miARN después de 4 semanas y se midieron para colesterol total, lipoproteína de alta densidad (HDL) y lipoproteína de baja densidad (LDL). miR, microARN; nLacZ, transgén indicador de βgalactosidasa; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados.

La Figura 15 representa una caracterización molecular de ARNms de transgén con o sin sitios de unión de miARN.

(a) Se presentan localizaciones de las sondas y cebadores, las secuencias de miR-122 maduro y su sitio de unión perfectamente complementario en el ARNm de transgén. (b) Se analizó ARN celular total de hígado tanto por PCR por transcripción inversa convencional (RT-PCR) usando cebadores que abarcan una región entre el extremo 3' de nLacZ y el extremo 5' de la señal de poli(A) (c) o por RT-PCR cuantitativa; los datos se presentan como niveles relativos de nLacZ de ARNm normalizado a β-actina. (d) Para el análisis de transferencia Northern de ARNm de nLacZ, 18S ARN sirvió de control de carga, y las transferencias se hibridaron con tanto un ADN de transgén (e) como sonda de ARN. (f) Además, se analizó por 5' RACE el ARNm que llevaba poli(A) del hígado de un animal que recibió rAAV que contenía tres sitios de unión de miR-1 y tres de miR-122; el producto de PCR se resolvió en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. miR, microARN; nLacZ, gen indicador de β-galactosidasa; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados.

La Figura 16 representa un alineamiento de secuencias que abarcan los sitios de unión de miARN y regiones de señales de poli(A) recuperadas por 5 RACE. Se aisló ARNm que contenía poli(A) de (a) hígado y (b) corazón de un animal inyectado con rAAV9CBnLacZ-(miR-1BS)3-(miR-122BS)3. Se secuenciaron veintiún clones derivados de hígado y veintidós derivados de corazón. Los supuestos sitios de escisión en cada clon se identifican por flechas; se informan las frecuencias de escisión específica de sitio dirigida por miARN para cada sitio de unión de miARN; los triángulos indican a las posiciones de los sitios de escisión dirigidos a miARN esperados (a,b). miARN, microARN, nLacZ, gen indicador de β-galactosidasa; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados.

La Figura 17 representa una transferencia génica de EGFP dirigida al SNC reprimida por miARN endógeno por rAAV9 administrado por vía sistémica. Se inyectaron ratones C57BL/6 macho de diez semanas de edad por vía intravenosa con scAAV9CBEGFP o scAAV9CBnLacZ(miR-1BS)3-(miR-122BS)3 a una dosis de 2 x 1014 copias de genoma por kg (GC/ kg) de peso corporal. Se sacrificaron los animales 3 semanas después para la fijación del cuerpo entero por perfusión transcardíaca. (a) Se recogieron cerebro, médula espinal, hígado, corazón y músculo para el crioseccionamiento, tinción inmunofluorescente para EGFP (cerebro y médula espinal cervical), y microscopía de fluorescencia para detectar EGFP. Se extrajeron ADN y ARN celular total del cerebro, hígado, corazón y músculo para medir la cantidad de genoma de vector persistente por qPCR y ARNm de EGFP por qRT-PCR. (b) Para cada tejido, se comparó la abundancia relativa del ARNm de EGFP que contenía sitios de unión de miARN con la del ARNm de EGFP que carecía de sitios de unión de miARN. Para cada muestra, se normalizó la abundancia de ARNm a la cantidad de genoma de vector detectada en el tejido. EGFP, proteína verde fluorescente potenciada; miARN, microARN; nLacZ, gen indicador de β-galactosidasa; qRT-PCR, PCR cuantitativa por transcripción inversa; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados.

La Figura 18 representa un modelo molecular para la expresión de rAAV regulada por miARN endógeno. miARN, microARN; rAAV, virus recombinantes adeno-asociados.

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La Figura 19 representa una cuantificación de los niveles de intensidad de GFP en el cerebro y médula espinal de ratones neonatales transducidos con diversos vectores de AAV. Se inyectaron 4×1011 copias de genoma (GCs) de diez vectores de AAV diferentes en crías P1 neonatales mediante la vena superficial. Los ratones se sacrificaron 21 días después de la inyección. Se extrajeron los tejidos cerebrales y se prepararon criosecciones de 40 µm de espesor. Las secciones se tiñeron contra el anticuerpo anti-EGFP. Se analizaron las imágenes y se calcularon los valores de intensidad/píxel de todos los serotipos de AAV en diversas regiones en el cerebro y médula espinal (A) usando el software Nikon NIS elements AR versión 3.2. También se presentaron intensidades promedio del cerebro y las regiones de la médula espinal para los diferentes rAAVs (B). Se fijó la región de interés (ROI) de cada estructura anatómica para todos los vectores para garantizar la comparación paralela.

La Figura 20 representa una expresión de EGFP fuerte y extendida en el cerebro de ratón neonatal después de la inyección intravenosa de rAAVs. Se inyectaron 4×1011 copias de genoma (GCs) de rAAVs 7, 9, rh.10, rh.39 y rh.43 en crías P1 neonatales mediante la vena superficial. Los ratones se sacrificaron 21 días después de la inyección. Se extrajeron los tejidos cerebrales y se prepararon criosecciones de 40 µm de espesor. Las secciones se tiñeron contra anticuerpo anti-EGFP. Las barras representan 100 µm. Las regiones mostradas son: bulbo olfativo, estriado, hipocampo, corteza, hipotálamo, cerebelo y bulbo raquídeo.

La Figura 21 representa la expresión de EGFP en médula espinal de ratón neonatal después de la inyección intravenosa de rAAVs. Se inyectaron 4×1011 GCs de rAAVs 7, 9, rh.10, rh.39 y rh.43 en crías P1 neonatales mediante la vena superficial. Los ratones se sacrificaron 21 días después de la inyección. Se extrajeron los tejidos de la médula espinal y se prepararon criosecciones de 40 µm de espesor. Las secciones de las regiones cervical, torácica y lumbar se tiñeron contra anticuerpos anti-EGFP. Las barras representan 100 µm.

La Figura 22 representa la expresión de EGFP en ganglios de la raíz dorsal transducidos por rAAVs 1, 2, 6, 6.2, 7, 9, rh.10 y rh.39 administrados por vía intravascular. Las crías neonatales recibieron 4×1011 GCs de rAAVs en P1 y se sacrificaron 21 días después de la inyección. Se procesaron criosecciones de cuarenta µm de espesor para la tinción inmunohistoquímica doble para EGFP (verde) y neuronas (NeuN, rojo). Las barras representan 75 µm.

La Figura 23 representa el análisis de microscopio confocal de los tipos transducidos de células en el SNC del ratón después de la administración sistémica de rAAVs a neonatos P1. Las secciones de cerebro y de médula espinal de 40 µm de espesor de los animales tratados con diferentes rAAVs se co-tiñeron contra anticuerpos anti-EGFP y marcadores específicos del tipo de célula. Se usó anti-NeuN para teñir células neuronales; se usó anti-GFAP para teñir astrocitos; se usó anti-calbindina para teñir células de Purkinje; se usó anti-ChAT para teñir neuronas motoras; se usó anti-DARPP para teñir neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Se examinaron todos los rAAVs, pero para cada tipo de célula, solo se mostró aquí una imagen representativa.

La Figura 24 representa una transducción de las estructuras ventriculares del cerebro por rAAVs administrados por vía intravascular. La crías neonatales recibieron 4×1011 GCs de rAAVs en P1 y se sacrificaron 21 días después de la inyección. Los plexos coroideos en diferentes ventrículos se preservaron todos bien durante el proceso del tejido. Se tiñeron criosecciones de cuarenta µm de espesor contra anticuerpos anti-EGFP. Las barras representan 100 µm.

La Figura 25 representa un análisis de pureza e integridad morfológica de vectores de rAAV. A. Se usó en este estudio análisis de SDS-PAGE teñido con plata de vectores de rAAVCBEGFP purificados con gradiente de CsCl. Se cargaron aproximadamente 1,5 x 1010 partículas de virus cada una de rAAVs 1, 2, 5, 6, 6.2, 7, 9, rh10, rh39 y rh43 en el carril correspondiente. B. Microscopía electrónica de transmisión de viriones de AAV recombinante teñidos negativos. Se diseminaron viriones de rAAV en una película de soporte Formvar recubierta de carbono recién preparada y se tiñeron con 1 % de acetato de uranilo para la microscopía de transmisión. Las imágenes de partículas de virus de lotes de vectores representativos se tomaron a 92.000X y se presentaron.

La Figura 26 representa una transducción de ganglios de la raíz dorsal de ratones neonatales por rAAVs 1, 6, 6.2 y rh43 administrados por vía sistémica. Las crías neonatales que recibieron 4×1011 GCs de rAAVs en P1 se sacrificaron 21 días después de la inyección. Se tiñeron criosecciones de cuarenta µm de espesor contra anticuerpos anti-EGFP. Las barras representan 75 µm.

La Figura 27 representa una transducción de los vasos capilares del cerebro por rAAVs administrados por vía intravascular. Las crías neonatales que recibieron 4×1011 GCs de rAAVs en P1 se sacrificaron 21 días después de la inyección. Se tiñeron criosecciones de cuarenta µm de espesor de los cerebros contra: (a) anticuerpos anti-EGFP (AAV1, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV9, AAVrh.10, AAVrh.39 y AAVrh.43); (b) anticuerpos anti-EGFP y anti-CD34 (rh.10 solo). Las barras representan 100 µm.

La Figura 28 representa una evaluación de la microgliosis en cerebro de ratón después de la administración sistémica de rAAVs a neonatos P1. Las secciones de cerebro de 40 µm de espesor de los animales tratados con diferentes rAAVs se co-tiñeron contra anticuerpos anti-EGFP y anti-IBa-1. Solo se mostró el resultado de la tinción de rAAVrh.10.

La Figura 29 representa la expresión de EGFP nativa en el SNC de ratones después de la administración sistémica de rAAVs a neonatos P1. Las crías neonatales que recibieron 4×1011 GCs de rAAVs en P1 se sacrificaron 21 días

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después de la inyección. Se montaron criosecciones de cuarenta µm de espesor y se observaron bajo microscopio sin inmunotinción. Se indicaron los tiempos de exposición para cada imagen.

La Figura 30 representa resultados que muestran los efectos de la terapia génica basada en rAAV en el tratamiento de la enfermedad de Canavan. La Figura 30A muestra que el tratamiento corrigió la marcha y función motora de los ratones CD. La Figura 30B muestra que el tratamiento mitigó la retinopatía y restauró la visión en ratones CD. La Figura 30C muestra que los niveles de NAA en los ratones CD tratados se parecen a aquellos en los ratones normales. La Figura 30D indica que la actividad de APSA se detecta en los cerebros de ratones CD. La Figura 30E indica que la expresión de APSA se detecta en los cerebros de ratones CD.

La Figura 31A representa que la vacuolación en tanto cerebro como médula espinal de los ratones tratados es más irregular y variable con vacuolas de tamaño generalmente más pequeñas y que algunas áreas de la corteza cerebral casi no muestran vacuolación. La Figura 31B muestra la expresión de APSA en la corteza cerebral in situ.

La Figura 32 representa los resultados de un análisis cuantitativo de vacuolación en diversas regiones del cerebro. La Figura 32A muestra que el bulbo olfativo tuvo una espectacular mitigación en la degeneración de materia blanca después de la terapia génica y que las grandes vacuolas fueron esencialmente eliminadas en otros tejidos. La Figura 32B muestra los resultados de un análisis similar en secciones de médula espinal.

La Figura 33 representa los resultados de una evaluación histopatológica de riñones en los ratones CD. La Figura 33A muestra que el epitelio tubular renal del riñón se atenuó de forma difusa y presentó agrandamiento de las luces tubulares en ratones CD no tratados. La Figura 33B muestra que el ratón CD tratado tuvo glomérulos normales. Las Figuras 33C y 33D representan los resultados de un análisis de dos vectores candidatos de partida, rAAV9 y rh.10, respectivamente, para la eficiencia de transducción de riñón después de la administración IV.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

El virus adeno-asociado (AAV) es un virus pequeño (26 nm) no envuelto defectuoso en la replicación que depende de la presencia de un segundo virus, tal como adenovirus o virus del herpes, para su crecimiento en células. No se conoce que el AAV produzca enfermedad e induce una respuesta inmunitaria muy leve. El AAV puede infectar tanto células en división como no en división y puede incorporar su genoma en el de la célula huésped. Se describen métodos de administración de un transgén a un tejido del SNC en un sujeto usando transferencia génica basada en AAV recombinante. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan métodos y composiciones para tratar trastornos relacionados con el SNC en el presente documento. Aspectos adicionales de la divulgación en el presente documento se basan en el descubrimiento de rAAVs que logran una amplia distribución en todo el tejido del SNC. En algunos casos, los rAAVs se diseminan en todo el tejido del SNC tras la administración directa en el líquido cefalorraquídeo (LCR), por ejemplo, mediante inyección intratecal y/o intracerebral. En otros casos, los rAAVs cruzan la barrera hematoencefálica y logran una amplia distribución en todo el tejido del SNC de un sujeto tras la administración intravenosa. Tales rAAVs son útiles para el tratamiento de trastornos relacionados con el SNC, que incluyen, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Canavan (CD).

Métodos y composiciones para elegir como diana tejido del SNC

En el presente documento se desvelan métodos de administración de un transgén a tejido del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto en el presente documento. Los métodos normalmente implican administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un rAAV que comprende un vector de ácido nucleico para expresar un transgén en el sujeto. Una "cantidad eficaz" de un rAAV es una cantidad suficiente para infectar un número suficiente de células de un tejido diana en un sujeto. Una cantidad eficaz de un rAAV puede ser una cantidad suficiente para tener un beneficio terapéutico en un sujeto, por ejemplo, para prolongar la esperanza de vida de un sujeto, para mejorar en el sujeto uno o más síntomas de enfermedad, por ejemplo, un síntoma de ELA, un síntoma de enfermedad de Canavan, etc. En algunos casos, una cantidad eficaz de un rAAV puede ser una cantidad suficiente para producir un modelo de animal transgénico somático estable. La cantidad eficaz dependerá de una variedad de factores tales como, por ejemplo, la especie, edad, peso, salud del sujeto, y el tejido del SNC que va a ser elegido como diana, y puede así variar entre sujeto y tejido. Una cantidad eficaz también puede depender del modo de administración. Por ejemplo, el elegir como diana un tejido del SNC por inyección intravascular puede requerir dosis diferentes (por ejemplo, más altas), en algunos casos, que el elegir como diana tejido del SNC por inyección intratecal o intracerebral. En algunos casos, se administran múltiples dosis de un rAAV. Una cantidad eficaz puede también depender del rAAV usado. Por ejemplo, dosificaciones para elegir como diana un tejido del SNC pueden depender del serotipo (por ejemplo, la proteína de la cápside) del rAAV. Por ejemplo, el rAAV puede tener una proteína de la cápside de un serotipo de AAV seleccionado del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh.10, rh.39, rh.43 y CSp3. En ciertos casos, la cantidad eficaz de rAAV es 1010, 1011, 1012, 1013 o 1014 copias de genoma por kg. En ciertos casos, la cantidad eficaz de rAAV es 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 o 1015 copias de genoma por sujeto.

Un método de administración de un transgén a tejido del SNC en un sujeto puede comprender administrar un rAAV por una vía única o por múltiples vías. Por ejemplo, el administrar un transgén a tejido del SNC en un sujeto puede comprender administrar al sujeto, por administración intravenosa, una cantidad eficaz de un rAAV que cruza la barrera hematoencefálica. El administrar un transgén a tejido del SNC en un sujeto puede comprender administrar al

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sujeto una cantidad eficaz de un rAAV por administración intratecal o administración intracerebral, por ejemplo, por inyección intraventricular. Un método de administración de un transgén a tejido del SNC en un sujeto puede comprender co-administrar una cantidad eficaz de un rAAV por dos vías de administración diferentes, por ejemplo, por administración intratecal y por administración intracerebral. La co-administración puede realizarse a aproximadamente el mismo momento, o momentos diferentes.

El tejido del SNC que es elegido como diana puede seleccionarse de, por ejemplo, corteza, hipocampo, tálamo, hipotálamo, cerebelo, tronco encefálico, médula espinal cervical, médula espinal torácica y médula espinal lumbar. La vía de administración para elegir como diana tejido del SNC normalmente depende del serotipo de AAV. Por ejemplo, en ciertos casos donde el serotipo de AAV está seleccionado de AAV1, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh.10, rh.39, rh.43 y CSp3, la vía de administración puede ser inyección intravascular. En algunos casos, por ejemplo, donde el serotipo de AAV está seleccionado de AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh.10, rh.39, rh.43 y CSp3, la vía de administración puede ser inyección intratecal y/o intracerebral.

Administración intravascular

Como se usa en el presente documento, el término "administración intravascular" se refiere a la administración de un agente, por ejemplo, una composición que comprende un rAAV, en la vasculatura de un sujeto, que incluye los aparatos circulatorios venoso y arterial del sujeto. Normalmente, los rAAVs que cruzan la barrera hematoencefálica pueden administrarse por administración intravascular para elegir como diana tejido del SNC. En algunos casos, la administración intravascular (por ejemplo, intravenosa) facilita el uso de volúmenes más grandes que otras formas de administración (por ejemplo, intratecal, intracerebral). Así, pueden administrarse grandes dosis de rAAVs (por ejemplo, hasta 1015 GC/sujeto) de una vez por administración intravascular (por ejemplo, intravenosa). Los métodos de administración intravascular son muy conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo, uso de una aguja hipodérmica, cánula periférica, línea venosa central, etc.

Administración intratecal y/o intracerebral

Como se usa en el presente documento, el término "administración intratecal" se refiere a la administración de un agente, por ejemplo, una composición que comprende un rAAV, en el canal espinal. Por ejemplo, la administración intratecal puede comprender la inyección en la región cervical del canal espinal, en la región torácica del canal espinal, o en la región lumbar del canal espinal. Normalmente, la administración intratecal se realiza inyectando un agente, por ejemplo, una composición que comprende un rAAV, en la cavidad subaracnoideo (espacio subaracnoideo) del canal espinal, que es la región entre la membrana aracnoidea y piamadre del canal espinal. El espacio subaracnoideo es ocupado por tejido esponjoso que consiste en trabéculas (filamentos delicados de tejido conjuntivo que se extienden desde la materia aracnoidea y se juntan en la piamadre) y canales de intercomunicación en los que está contenido el líquido cefalorraquídeo. En algunos casos, la administración intratecal no es administración en la vasculatura espinal.

Como se usa en el presente documento, el término "administración intracerebral" se refiere a la administración de un agente en y/o alrededor del cerebro. La administración intracerebral incluye, pero no se limita a, administración de un agente en el cerebro, bulbo raquídeo, protuberancia, cerebelo, cavidad intracraneal y meninges que rodea el cerebro. La administración intracerebral puede incluir administración en la duramadre, materia aracnoidea y piamadre del cerebro. La administración intracerebral puede incluir, en algunos casos, administración de un agente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) del espacio subaracnoideo que rodea el cerebro. La administración intracerebral puede incluir, en algunos casos, la administración de un agente en los ventrículos del cerebro, por ejemplo, el ventrículo lateral derecho, el ventrículo lateral izquierdo, el tercer ventrículo, el cuarto ventrículo. En algunos casos, la administración intracerebral no es administración en la vasculatura del cerebro.

La administración intracerebral puede implicar la inyección directa en y/o alrededor del cerebro. En algunos casos, la administración intracerebral implica inyección usando procedimientos estereotáxicos. Los procedimientos estereotáxicos son muy conocidos en la materia y normalmente implican el uso de un ordenador y un dispositivo de barrido tridimensional que se usan juntos para guiar la inyección a una región intracerebral particular, por ejemplo, una región ventricular. También puede usarse bombas de micro-inyección (por ejemplo, de World Precision Instruments). En algunos casos, se usa una bomba de microinyección para administrar una composición que comprende un rAAV. En algunos casos, la velocidad de infusión de la composición está en un intervalo de 1 µl / minuto a 100 µl / minuto. Como será apreciado por el experto, las velocidades de infusión dependerán de una variedad de factores, que incluyen, por ejemplo, especie de sujeto, edad del sujeto, peso/tamaño del sujeto, serotipo del AAV, dosificación requerida, región intracerebral elegida como diana, etc. Así, un experto puede considerar otras velocidades de infusión que son apropiados en ciertas circunstancias.

Métodos y composiciones para tratar trastornos relacionados con el SNC

En el presente documento también se desvelan métodos y composiciones para tratar trastornos relacionados con el SNC en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un "trastorno relacionado con el SNC" es una enfermedad o afección del sistema nervioso central. Un trastorno relacionado con el SNC puede afectar a la médula espinal (por ejemplo, un mielopatía), cerebro (por ejemplo, un encefalopatía) o tejidos que rodean el cerebro

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en el que el rAAV comprende un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con una región que codifica ASPA (por ejemplo, una región que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 14 o 16). Un método de tratamiento de la enfermedad de Canavan en un sujeto en necesidad del mismo puede comprender administrar una cantidad eficaz de un rAAV a tejido del SNC del sujeto por administración intratecal, en el que el rAAV comprende un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con una región que codifica ASPA. En algunos casos, los métodos de tratamiento de CD implican administrar, a tejido del SNC del sujeto, una cantidad eficaz de un rAAV que comprende una proteína de la cápside distinta de una proteína de la cápside de AAV serotipo 2 (por ejemplo, distinta de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2) y un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con una región que codifica ASPA. En otro ejemplo, un método de tratamiento de la enfermedad de Canavan en un sujeto en necesidad del mismo comprende administrar una cantidad eficaz de un rAAV a tejido del SNC del sujeto por una vía distinta de administración intracerebral, en el que el rAAV comprende un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con una región que codifica ASPA. En algunos casos, la ASPA expresada en tejido del SNC tras la administración del rAAV produce una disminución en la actividad de aspartoacilasa y rotura de N-acetil aspartato en el tejido del SNC. Así, en algunos casos, en el presente documento se desvela un vector de AAV recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 14 o

16. En algunos casos, en el presente documento se desvela un AAV recombinante que alberga un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con una región que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 14 o 16. En algunos casos, en el presente documento se desvela un AAV recombinante que alberga un ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido con una región que codifica una proteína que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 13 o 15. El AAV recombinante puede tener una proteína de la cápside que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 12. El AAV recombinante puede tener una proteína de la cápside que comprende una secuencia como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3 a 12.

AAVs recombinantes

Se desvelan AAVs aislados. Como se usa en el presente documento con respecto a los AAVs, el término "aislado" se refiere a un AAV que ha sido aislado de su entorno natural (por ejemplo, de una célula huésped, tejido, o sujeto) o producido artificialmente. Los AAVs aislados pueden producirse usando métodos recombinantes. Tales AAVs se denominan en el presente documento "AAVs recombinantes". Los AAVs recombinantes (rAAVs) tienen preferentemente capacidades de direccionamiento específico de tejido, de forma que un transgén del rAAV se administrará específicamente a uno o más tejido(s) predeterminados). La cápside del AAV es un elemento importante en la determinación de estas estos capacidades de direccionamiento específico de tejido. Así, puede seleccionarse un rAAV que tiene una cápside apropiada para el tejido que se elige como diana. En algunos casos, el rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NOs 1 a 12, o una proteína que tiene homología sustancial con las mismas.

Son muy conocidos en la técnica métodos de obtención de AAVs recombinantes que tienen una proteína de la cápside deseada (véase, por ejemplo, el documento US 2003/0138772). Proteínas de la cápside de AAVs que pueden usarse en los rAAVs desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, las desveladas en G. Gao, et al., J. Virol, 78(12):6381-6388 (Junio de 2004); G. Gao, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (13 de mayo de 2003); documentos US 2003-0138772, US 2007/0036760, US 2009/0197338, y solicitud provisional de EE.UU. número de serie 61/182.084, presentada el 28 de mayo de 2009. Normalmente, los métodos implican cultivar una célula huésped que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de la cápside de AAV (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una secuencia como se expone en una cualquiera de SEQ ID NOs 1-12) o fragmento de la misma; un gen rep funcional; un vector de AAV recombinante compuesto de repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y funciones auxiliares suficientes para permitir la encapsidación del vector de AAV recombinante en las proteínas de la cápside de AAV.

Los componentes que van a cultivarse en la célula huésped para encapsidar un vector de rAAV en una cápside de AAV pueden ser desvelados en el presente documento para la célula huésped en trans. Alternativamente, uno cualquiera o más de los componentes requeridos (por ejemplo, vector de AAV recombinante, secuencias de rep, secuencias de cap y/o funciones auxiliares) pueden ser desvelados en el presente documento por una célula huésped estable que ha sido manipulada para contener uno o más de los componentes requeridos usando métodos conocidos para aquellos expertos en la materia. Lo más adecuadamente, una célula huésped estable tal contendrá el (los) componente(s) requerido(s) bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el (los) componente(s) requerido(s) puede(n) estar bajo el control de un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados se desvelan en el presente documento, en la discusión de elementos reguladores adecuados para su uso con el transgén. En otra alternativa adicional, una célula huésped estable seleccionada puede contener componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otros componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, puede generarse una célula huésped estable que se deriva de células 293 (que contienen E1 las funciones auxiliares bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contienen las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Pueden generarse todavía otras células huésped estables por un experto en la materia.

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nucleico para controlar el inicio de la ARN polimerasa y la expresión del gen. El término "vector o construcción de expresión" significa cualquier tipo de construcción genética que contiene un ácido nucleico en la que parte o toda la secuencia codificante del ácido nucleico es capaz de ser transcrita. En algunos casos, la expresión incluye la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, para generar un producto de polipéptido biológicamente activo o inhibidor de ARN (por ejemplo, ARNhp, miARN) a partir de un gen transcrito.

Los anteriores métodos para encapsidar vectores recombinantes en cápsides de AAV deseadas para producir los rAAVs no pretenden ser limitantes y otros métodos adecuados serán evidentes para el experto.

Vectores de AAV recombinante

Los "vectores de AAV recombinante (rAAV)" normalmente están compuestos de, como mínimo, un transgén y sus secuencias reguladoras, y repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV en 5' y 3'. Es este vector de AAV recombinante el que está encapsidado en una proteína de la cápside y se administra a una célula diana seleccionada. En algunos casos, el transgén es una secuencia de ácidos nucleicos, heteróloga a las secuencias del vector, que codifica un polipéptido, proteína, molécula de ARN funcional (por ejemplo, miARN, inhibidor de miARN) u otro producto génico de interés. La secuencia codificante de ácidos nucleicos está operativamente unida a componentes reguladores de un modo que permite la transcripción, traducción y/o expresión transgénica en una célula de un tejido diana.

Las secuencias de AAV del vector normalmente comprenden las secuencias de la repetición terminal invertida de 5' y 3' de acción en trans (véase, por ejemplo, B. J. Carter, en "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). Las secuencias de ITR tienen aproximadamente 145 pb de longitud. Preferentemente, se usan sustancialmente las secuencias enteras que codifican las ITRs en la molécula, aunque es permisible algún grado de modificación menor de estas secuencias. La capacidad para modificar estas secuencias de ITR está dentro de la experiencia de la materia (véanse, por ejemplo, textos tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); y K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)). Un ejemplo de una molécula tal empleada en el presente documento es un plásmido "de acción en cis" que contiene el transgén, en el que la secuencia transgénica seleccionada y elementos reguladores asociados están flanqueados por las secuencias de ITR de 5' y 3' de AAV. Las secuencias de ITR de AAV pueden obtenerse de cualquier AAV conocido, que incluyen los tipos de AAV de mamífero actualmente identificados.

Además de los principales elementos identificados anteriormente para el vector de AAV recombinante, el vector también incluye elementos de control convencionales que están operativamente unidos al transgén de un modo que permita su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector plasmídico o infectada con el virus producido en el presente documento. Como se usa en el presente documento, secuencias "operativamente unidas" incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficiencia de traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Se conocen en la técnica un gran número de secuencias de control de la expresión, que incluyen promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido, y pueden utilizarse.

Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, secuencia codificante) y secuencias reguladoras están operativamente unidas cuando están covalentemente unidas de tal forma que pongan la expresión o transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias de ácidos nucleicos se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están operativamente unidas si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras de 5' produce la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) produce la introducción de una mutación por desplazamiento del marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente que va a traducirse en una proteína. Así, una región promotora se uniría operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de forma que el transcrito resultante pudiera traducirse en la proteína deseada o polipéptido. Similarmente, dos o más regiones codificantes están operativamente unidas cuando están unidas de tal forma que su transcripción de un promotor común produzca la expresión de dos o más proteínas que han sido traducidas en marco. En algunos casos, las secuencias codificantes operativamente unidas dan una proteína de fusión. En algunos casos, las secuencias codificantes operativamente unidas dan un ARN funcional (por ejemplo, ARNhp, miARN).

Para proteínas que codifican ácidos nucleicos, una secuencia de poliadenilación generalmente se inserta tras las secuencias transgénicas y antes de la secuencia de ITR de 3' de AAV. Una construcción de rAAV útil en el presente documento también puede contener un intrón, deseablemente localizado entre la secuencia promotora/potenciadora y el transgén. Una posible secuencia de intrón se deriva del SV-40, y se denomina la secuencia de intrón T de SV

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En algunos casos, las composiciones de rAAV se formulan para reducir la agregación de partículas de AAV en la composición, particularmente donde están presentes concentraciones de rAAV altas (por ejemplo, ∼1013 GC/ml o más). Métodos de reducción de la agregación de rAAVs son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, adición de tensioactivos, ajuste del pH, ajuste de la concentración de sales, etc. (véase, por ejemplo, Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178)

La formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y disoluciones de vehículo es muy conocida para aquellos expertos en la materia, ya que es el desarrollo de pautas de dosificación y de tratamiento adecuadas para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de pautas de tratamiento. Normalmente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente el 0,1 % del principio activo o más, aunque el porcentaje del (de los) principio(s) activo(s) puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 1 o el 2 % y aproximadamente el 70 % o el 80 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de principio activo en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal forma que se obtenga una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, estabilidad en almacén del producto, además de otras consideraciones farmacológicas, serán contempladas por un experto en la materia de la preparación de tales formulaciones farmacéuticas, y como tal, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y pautas de tratamiento.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones de almacenamiento y uso habituales, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. En muchos casos, la forma es estéril y fluida hasta el punto de que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede provocarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración de una disolución acuosa inyectable, por ejemplo, la disolución puede ser adecuadamente tamponada, si fuera necesario, y el diluyente líquido convertirse primero en isotónico con solución salina suficiente o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, puede disolverse una dosificación en 1 ml de disolución isotónica de NaCl y tanto añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis como inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 15701580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación, dependiendo de la afección del huésped. Las personas responsables de la administración determinarán, en cualquier caso, las dosis apropiadas para el huésped individual.

Se preparan disoluciones inyectables estériles incorporando el rAAV activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros componentes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones de rAAV desveladas en el presente documento también pueden formularse en una forma neutra

o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de un modo compatible con la formulación de dosificación y en cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tal como disoluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco, y similares.

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se evaluó en diferentes regiones de la médula espinal de ratones neonatales y adultos (los resultados para los estudios neonatales se muestran en la Figura 3).

Se observó la transducción de tejidos no del SNC, tales como el corazón y músculo esquelético (por ejemplo, para AAV9, AAV8 y CSp3). En algunos casos, esto puede conducir a algunos efectos secundarios no deseables. Para tratar esta cuestión, los sitios de unión de miARN se incorporaron en 3' UTR del casete del transgén y se logró el desdireccionamiento altamente específico y eficaz de la transducción de AAV de tejidos no del SNC. Para inhibir la expresión en el hígado, se usaron unión (uniones) de miARN para mR-122. Para inhibir la expresión en músculo esquelético y corazón, se usaron unión (uniones) de miARN para mR-1.

Tabla 1: TROPISMOS DEL SNC DE AAV

AAV1 AAV2 AAV5 AAV6 AAV6.2 AAV7 AAV8 AAV9 rh.10 rh.39 rh.43 CSp3

Adulto: Corteza + + + ++ ++ +++ ++ + - +

Hipocampo: + + + ++ ++ +++ ++ + - +

Tálamo: + + + ++ ++ ++++ +++ ++ + +

Hipotálamo: + ++ + +++ ++ ++ +++ +++ + ++

Cerebelo: + ++ + ++ +++ +++ ++++ + + +

Tronco encefálico: + ++ + ++ ++ ++++ +++ ++ - +

Cervical: +++ + + +++ +++ ++++ +++ +++ - +

Torácica: +++ + + +++ +++ ++++ +++ ++ - +

Lumbar: +++ + + +++ +++ ++++++ +++ ++ - +

Neonatal: Corteza ++ + - ++ + + +++ ++ ++ ++ ++ ++

Hipocampo: + + - - - +++ ++ + + ++ ++ +

Tálamo: + + - - + ++ + + + ++ + +

Hipotálamo: ++ - - + + ++++++ ++++++ + + ++++++ +++ -

Cerebelo: ++ - - + - + + + + ++ + +

Tronco encefálico: ++ - - + - ++ + + + +++++ +++ +++

Cervical: - - - + ++ ++ +++ ++ +++++ ++++ +++ ++

Torácica: + - - + ++ +++ ++ ++ ++ ++++ +++ +

Lumbar: + - - + ++ ++ + + ++ +++ +++ +

10 Grado de tropismo de tejido (-sin tropismo; ++++++ alto tropismo) Basado en los datos en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo 2: Construcción y evaluación de un vector AAVrh.10 recombinante para tratar CD

La enfermedad de Canavan (CD) es un trastorno neurodegenerativo heredado producido por mutaciones en el gen aspartoacilasa (ASPA), que conduce a la acumulación de ácido N-acetil-aspártico (NAA) en oligodendrocitos con degeneración esponjosa resultante de materia blanca en el cerebro. Un estudio clínico inicial en la terapia génica de

15 ASPA basada en rAAV2 para CD logró éxito muy limitado. Se cree, sin desear ceñirse a teoría alguna, que una terapia génica de CD eficaz transducirá oligodendrocitos en todo el SNC.

Se construye un vector de rAAV que comprende un promotor operativamente unido con una región que codifica la proteína ASPA (SEQ ID NO: 13 o 15) como vector de terapia génica para CD. La construcción emplea CAG (promotor de β-actina de pollo con potenciador del CMV) para conducir la expresión de ASPA que tiene una 20 secuencia codificante como se expone en SEQ ID NO: 14 o 16. El vector de rAAV se encapsida en partículas de rAAV usando el método de transfección triple. Para evaluar su eficacia, se examina rAAV-ASPA en un modelo de ratón inactivado en ASPA de CD para su capacidad para eliminar o atenuar el fenotipo tipo CD de ratones inactivados en ASPA homocigóticos (Matalon R et al. The Journal of Gene Medicine, Volumen 2 Edición 3, Páginas 165 -175). Los ratones inactivados en ASPA homocigóticos presentan alteración neurológica, macrocefalia, 25 enfermedad generalizada de la materia blanca, actividad de ASPA deficiente y altos niveles de NAA en orina. La imagen por resonancia magnética (MRI) y espectroscopía (MRS) del cerebro de los ratones homocigóticos muestran

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cambios en la materia blanca característicos de la enfermedad de Canavan y elevados niveles de NAA. Sirven de controles ratones inactivados en ASPA heterocigóticos, que no tienen fenotipo abierto al nacer.

Ejemplo 3: Eficacia terapéutica y evaluación de la seguridad de un vector de AAV para tratar CD

El modelo de ratón de CD es una cepa KO del gen ASPA derivado de C57BL/6. Los ratones KO homocigóticos presentan defectos bioquímicos y neurológicos similares a aquellos observados en pacientes con CD. Ratones CD proporcionan un modelo animal para evaluar la terapia génica y otros terapéuticos para el tratamiento de CD. Se usan ratones CD para estudiar la eficacia y seguridad de las novedosas estrategias de terapia génica para el tratamiento de CD.

Diseño del experimento

Para examinar la eficacia terapéutica y seguridad, se investigan vectores de scAAV (por ejemplo, AAV7, AAV8, CSp3 y AAV9) que llevan un casete de expresión de ASPA optimizado en un ensayo de terapia génica preclínica de CD. Los vectores incluyen sitios(s) de unión de miARN para inhibir la expresión de ASPA en tejidos no del SNC. Se tratan tanto animales postnatales de día -1 como adultos de 3 meses de edad con cada vector a dos dosis, 1 y 3 x 1014 GC/kg por administración intravenosa. Para los ratones CD neonatales, dos camadas de animales reciben cada vector a cada dosis mediante inyecciones de la vena temporal, para el sacrificio de una camada cada una en los momentos de tiempo de 1 y 3 meses. Para los ratones adultos CD de 3 meses de edad, se tratan 12 animales macho con cada vector a cada dosis mediante inyección en las venas de la cola. Seis de los animales tratados se sacrificaron 1 y 3 meses después. En experimentos adicionales, tanto los animales postnatales día -1 como adultos de 3 meses de edad se tratan con vectores a una dosis en un intervalo de 1011 a 1012 GC/sujeto por administración intraventricular directa.

Mediciones funcionales y neurológicas durante la fase viva del estudio

1). Metabolismo de NAA. Se recogen muestras de orina de los animales tratados, de control no tratados y no mutantes en los días 14, 30, 45, 60, 75 y 90. Las muestras se analizan por HPLC para determinar los niveles de NAA.

2). Acumulación de NAA y retención de agua inducida por NAA en el cerebro. Se realizan estudios de obtención de imágenes neurológicas basadas en MRI/MRS en los animales vivos en todos los grupos de estudio 1, 2 y 3 meses después del tratamiento con vector para medir integrales de picos espectrales para creatina/fosfocreatina y NAA, además de áreas hiperintensas anormales en el cerebro.

3). Pruebas de la función hepática. Se recogen muestras de suero de los animales en todos los grupos de estudio en los días 14, 30, 60 y 90 para medir los niveles de alanina transaminasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) como indicadores de la toxicidad hepática relacionada con el vector.

4). Pruebas neurológicas. Temblores, caminar con las patas separadas a un ritmo lento y tembloroso, y ataxia están entre las características neurológicas importantes de los ratones CD. 1, 2 y 3 meses después del tratamiento de terapia génica, los animales en todos los grupos de estudio se someten a un análisis de patrones de marcha por tinción de sus patas con tinta de color y entonces se registran sus patrones de marcha como huellas dactilares sobre papel blanco. Los animales también se prueban y se puntúan en una prueba de barra giratoria para su capacidad para mantener el equilibrio.

Análisis enzimáticos e histopatológicos en los puntos finales del estudio

1). Actividades de ASPA en el cerebro y tejidos no del SNC. Se analizan la expresión de ASPA específica e inespecífica recogiendo tejidos de cerebro, hígado, corazón y pancreáticos en el momento del sacrificio para medir las actividades de ASPA en los homogeneizados de tejido respectivos.

2). Materia blanca del cerebro y patologías hepáticas. Para examinar la posible mejora en la patología de la materia blanca del cerebro y la toxicidad hepática relacionada con el vector resultante de la terapia génica, se recogen tejidos de cerebro e hígado y se fijan, se incorporan en parafina y se seccionan, y se tiñen con hematoxilina y eosina. El examen histopatológico se realiza por un patólogo.

Ejemplo 4: Administración de genes terapéuticos a las células del SNC por AAVrh.10

Se desarrolló un cribado de diferentes serotipos de AAV para identificar candidatos para una transferencia génica terapéutica al SNC. Se construyó un vector de AAV recombinante que expresaba EGFP. El vector de rAAV se encapsidó en cuatro AAVs diferentes: AAV1, 8, 9 y 10. Se inyectaron ratones adultos con los AAVs en el LCR en la posición lumbar. AAV1, 8 y 9 transdujeron células solo en la proximidad del sitio de inyección en la región lumbar de la médula espinal tras la administración de ∼4,8 x 1010 partículas. Sorprendentemente, AAVrh.10 transdujo células en la materia gris a lo largo de toda la médula espinal y el tronco encefálico tras el mismo protocolo de inyección y dosificación que AAV1, AAV8 y AAV9 (Fig. 4A). Recientemente, se ha mostrado que AAV9 cruza la barrera hematoencefálica (BBB) y transduce células de la médula espinal después de la inyección intravenosa. Se observó

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se bloquearon con tampón de bloqueo (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de incubación con tanto anti-GAPDH (Millipore, Billerica, MA), anti-ciclina G1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o anti-calmodulina (Millipore) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS que contenía 0,1 % (vol/vol) de Tween-20, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios

5 conjugados con LI-COR IRDye durante 1 hora a temperatura ambiente, y entonces los anticuerpos se detectaron usando Odyssey Imager (LI-COR).

Ensayo de β-galactosidasa. Se extrajeron proteínas con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación y se cuantificaron como se ha descrito anteriormente. Se usaron cincuenta microgramos de proteína para cada ensayo de β-galactosidasa usando el sistema Galacto-Star (Applied Biosystems), según las instrucciones del fabricante.

10 5' RACE. Se realizó 5' RACE como se ha descrito. Se usaron el cebador Outer de 5' RACE y el cebador específico del gen nLacZ bGHpolyAR (Tabla 4) para la primera ronda de PCR anidada. Se usaron el cebador Inner de 5' RACE y el cebador específico del gen nLacZ nLacZpolyR, que se localiza cerca del codón de terminación de ADNc de nLacZ, para la segunda ronda de PCR anidada (Tabla 4). Los productos de PCR se clonaron en TOPO en pCR-4.0 (Invitrogen) y se secuenciaron.

15 Análisis estadístico. Todos los resultados se informan como media ± DE y se compararon entre grupos usando la prueba de la t de Student bilateral.

Tabla 3 Resumen de escisión de ARNm de transgén guiada por microARN en hígado y corazón de ratón

Sitio de escisión

Escisión de miR BS: Posición Entre 10 y 11 nt Entre 17 y 18 nt Entre 18 y 19 nt Sitio al azar

Hígado 1 Copia de miR-122 BS (21 clones): 1 17/21 81 % ND ND 19 %

3 Copias de miR-122 BS (11 clones): 1 ND 100 % ND ND 0 %

2: 4/11

3: 7/11

3 Copias de cada uno de miR-1 y miR-122 miR-1 3x BS: 1 ND ND ND ND 0 %

BS en un único vector (21 clones): 2 ND

3: ND

miR-122 3x BS: 1 1/21 95 % ND ND 5 %

2: 10/21

3: 9/21

Corazón 1 Copia de miR-1 BS (12 clones): 1 12/12 100 % ND ND 0 %

3 Copias de miR-1 BS (21 clones): 1 ND 80 % 4/21 20 % ND 0 %

2: 16/21 ND

3: 1/21 ND

3 Copias de cada uno de miR-1 y miR-122 miR-122 3x BS: 1 ND ND ND 1/22 14 % 4 %

BS en un vector único (22 clones): 2 ND 1/22

3: ND ND

miR-1 3x BS: 1 1/22 73 % ND 9 % ND 0 %

2: 7/22 1/22

3: 8/22 1/22

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Tabla 4. Cebadores y sondas de oligonucleótidos usados en el Ejemplo 8.

Oligonucleótidos: Secuencia SEQ ID NO

(miR-1)1 sentido: SEQ ID NO: 32

(miR-1)1 antisentido: SEQ ID NO: 33

(miR-122)1 sentido: SEQ ID NO: 34

(miR-133)1 antisentido: SEQ ID NO: 35

(miR-1)3 sentido: SEQ ID NO: 36

(miR-1)3 antisentido: SEQ ID NO: 37

(miR-122)3 sentido: SEQ ID NO: 38

(miR-122)3 antisentido: SEQ ID NO: 39

(miR-1)1 -(miR-122)1 sentido: SEQ ID NO: 40

(miR-1)1 -(miR-122)1 antisentido: SEQ ID NO: 41

Fragmento (miR-1)3 -(miR-122)3 sintetizado: SEQ ID NO: 42

Pri-miR-122F: ATCGGGCCCGACTGCAGTTTCAGCGTTTG SEQ ID NO: 43

Pri-miR-122R: CGCGGGCCCGACTTTACATTACACACAAT SEQ ID NO: 44

Pri-miR-1F: CGCGGGCCCGACTGATGTGTGAGAGAGAC SEQ ID NO: 45

Pri-miR-1R: CGCGGGCCCGACTTTCGGCCTCCCGAGGC SEQ ID NO: 46

NLacZ5¢F(5¢F): TGAAGCTGAAGCCTGTGATG SEQ ID NO: 47

nLacZ 5¢R(5¢R): GAGCACCTGACAGCATTGAA SEQ ID NO: 48

nLacZ3¢F(3¢F): CTCAGCAACAGCTCATGGAA SEQ ID NO: 49

nLacZ3¢R(3¢R): TTACTTCTGGCACCACACCA SEQ ID NO: 50

nLacZpolyF(A+F): TGGTGTGGTGCCAGAAGTAA SEQ ID NO: 51

nLacZpolyR(A+R): CAACAGATGGCTGGCAACTA SEQ ID NO: 52

bGHpolyAR(bGH+AR): TGGGAGTGGCACCTTCCA SEQ ID NO: 53

EGFP-F: CGACCACTACCAGCAGAACA SEQ ID NO: 54

EGFP-R: CTTGTACAGCTCGTCCATGC SEQ ID NO: 55

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Tabla 5. Características de transducción de serotipos de AAV tras las inyecciones intravasculares en cerebro de ratón neonatal

Bulbo olfativo: Estriado Hipocampo Corteza Tálamo Hipotálamo Cerebelo Bulbo raquídeo Cervical Torácica Lumbar Plexo coroideo

Puntuación: n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n Puntuación n

AAV1: + 3 ++ 3 ++ 3 ++ 3 + 3 +++ 3 +++ 3 +++ 3 +++ 3 +++ 3 + 3 +++ 3

AAV2: - 3 - 3 + 3 + 3 + 3 + 3 + 3 + 3 + 3 - 3 - 3 ++ 3

AAV5: - 3 - 3 - 3 + 3 - 3 + 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3

AAV6: + 3 + 3 ++ 3 ++ 3 + 3 +++ 2 ++ 3 ++ 3 ++ 3 + 3 + 3 +++ 3

++: 1

AAV6.2: - 3 +++ 2 ++ 3 ++ 3 + 3 ++++ 3 ++ 3 ++ 3 ++ 3 ++ 3 + 3 ++++ 3

++: 1

AAV7: +++ 1 +++ 3 +++ 2 ++ 3 + 3 ++++ 3 +++ 1 ++ 3 ++ 3 + 3 + 3 ++++ 3

++: 2 ++ 1 ++ 2

AAV9: +++ 2 +++ 3 ++ 3 +++ 1 + 3 ++++ 1 +++ 1 ++ 3 ++++ 1 ++ 3 + 3 ++++ 3

++: 1 ++ 2 +++ 2 ++ 2 +++ 2

rh10: +++ 1 ++++ 1 +++ 3 +++ 2 ++ 2 ++++ 3 +++ 1 +++ 3 ++++ 1 ++ 3 + 3 ++++ 3

++: 2 ++ 2 ++ 1 + 1 ++ 2 +++ 2

rh39: +++ 1 ++++ 2 +++ 3 +++ 1 + 3 ++++ 3 +++ 1 ++++ 1 ++++ 1 +++ 3 + 3 ++++ 3

++: 2 +++ 1 ++ 2 ++ 2 +++ 2 +++ 2

rh43: ++ 3 +++ 3 +++ 3 +++ 3 + 3 ++++ 1 ++ 3 ++++ 1 ++++ 2 +++ 3 + 3 ++++ 3

+++: 2 +++ 2 +++ 1

Ejemplo 10: Evaluación de un tratamiento basado en rAAV en un modelo de enfermedad de Canavan

Puntuación: (-) Sin transducción, (+) muy pocas células positivas, (++) algunas células positivas, (+++) muchas células positivas y (++++) la región está casi saturada con células positivas para EGFP. El número de animales (n) 5 con la puntuación particular se da a la derecha de la puntuación.

Introducción al ejemplo

La CD es un leucodistrofia infantil rara y mortal producida por mutaciones recesivas autosómicas en el gen aspartoacilasa (ASPA) [como se ha establecido por el trabajo de graduado de G.G. (12)]. La deficiencia de ASPA en

10 pacientes con CD conduce a ácido N-Acetil-aspártico (NAA) elevado en orina (un distintivo de CD) y degeneración esponjosa de la materia blanca en todo el SNC, produciendo retardo psicomotor grave y muerte temprana. Un modelo de ratón con ASPA-/-imita la neuropatología y manifestaciones clínicas observadas en pacientes con CD, es decir, degeneración esponjosa de materia blanca, déficits motores, retrasos del desarrollo y muerte temprana (en el plazo de 3 semanas después del nacimiento).

15 En este estudio, se usaron rAAVs administrables por i.v. para dirigirse al SNC globalmente para tratar degeneración WM difusa en ratones CD. Inyecciones i.v. individuales del vector de ASPA a los ratones CD neonatales corrigieron el defecto metabólico, la disfunción psicomotora y otros fenotipos de enfermedad, y prolongaron la supervivencia. Aunque los ratones CD no tratados empezaron a mostrar retraso del crecimiento, disfunción psicomotora en la 2ª semanas después del nacimiento y murieron uniformemente poco después del destete, los ratones tratados

20 empezaron a ganar peso 2 semanas después de la inyección de vector y casi alcanzaron a sus compañeros de camada heterocigóticos en el plazo de 7-8 semanas. A diferencia de los ratones CD, la movilidad de los animales tratados fue similar a la de los compañeros de camada no mutantes. Los datos de la prueba de la barra giratoria en los ratones tratados no mostraron diferencias significativas en el tiempo de latencia entre los ratones CD tratados y sus compañeros de camada no mutantes de la misma edad, que indica que la terapia génica corrigió la ataxia, un

25 síntoma neuromuscular típico de CD. La caracterización bioquímica indicó reducción de los niveles de NAA en las muestras de orina y la restauración de la actividad de ASPA en sus tejidos de cerebro y riñón. La mitigación de los fenotipos bioquímicos y clínicos se correlacionó bien con la histopatología globalmente mejorada en no solo el cerebro, médula espinal, sino también en tejidos periféricos tales como el riñón, que indica que CD no es solo un trastorno del SNC.

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Claims

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