JP4693244B2 - 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（技術分野）
発明の背景
アデノ−随伴ウイルス（AAV）は複製欠損性パルボウイルスであり、そのゲノムは約4.6kgの長さであり、145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ITRs）を含む。２つのオープンリーディングフレイムが一連のrepおよびcapポリペプチドをコードする。repポリペプチド(rep78、rep68、rep62およびrep40）はAAVゲノムの複製、レスキュー(rescue)および組込みに関与する。capタンパク質（VP1、VP2およびVP3）は、ビリオン キャプシドを形成する。5'および3'末端でrepおよびcapオープンリーディングフレイムを挟むのは、145bpの逆方向末端反復配列（ITRs）であり、その最初の125bpはY-またはT-形の二重構造を形成することができる。AAVベクターの開発に重要なことは、全repおよびcapドメインが切り出され、そして治療用またはレポーター導入遺伝子と交換できることである［B.J.Carter、「パルボウイルスのハンドブック」で、P.Tijsser編集、CRC出版、155〜168頁(1990)］。ITRsはAAVゲノムの複製、レスキュー、パッケージングおよび組込みに必要な最小配列を表すことが示された。
【０００２】
この非病原性のヒト ウイルスがヒトの細胞に感染した時、ウイルスゲノムは染色体19に組み込まれ、細胞の潜伏感染をもたらす。感染性ウイルスの生産およびウイルスの複製は、細胞をアデノウイルス（Ad）またはヘルペスウイルスのような溶菌性のヘルパーウイルスと混合感染(coinfected)しない限り起こらない。ヘルパーウイルスの感染で、AAVプロウルスはレスキューされ、そして増幅し、そしてAAVおよびヘルパーウイルスの両方が生産される。親のssDNSを感染することは、rep遺伝的様式で二重鎖複製形(RF)DNAへと広げられる。レスキューされたAAVゲノムは、形成されたタンパク質キャプシド（直径約20nmの正二十面体）にパッケージングされ、そして細胞の溶菌後に＋または-ssDNAゲノムのいずれかをパッケージングした感染性のビリオンとして放出される。
【０００３】
AAVは、外来DNA（例えば導入遺伝子）を細胞に運ぶためのベクターとして魅力的となる独自の特徴を有し、そして様々な群が疾患状態の処置にAAVを使用する可能性について研究された。本出願で使用するように、用語「導入遺伝子」は動物に送達されることが望まれるDNAを意味し、このDNAは非-AAV DNAである。しかし所望の導入遺伝子の状態でDNAを速達するために、形質導入ベクターとしてAAVを確立することに対する進展は、種々の理由から遅れた。
【０００４】
DNAの送達にAAVを使用するための１つの障害は、組換え体ゲノムのカプシド化（encapsidation）および感染性ビリオンの生産に関する高度に効率的なスキームがなかったことであった。R.Kotin,Hum.Gene Ther.,5:793-801(1994)を参照にされたい。この問題に取り組む１つの方法は、組換えAAV（rAAV）（これは送達すべきDNAを有するが、repおよびcap遺伝子を欠いている）を宿主細胞にトランスフェクションし、続いて野生型（wt）AAV（これはrepおよびcap遺伝子を供給する）およびアデノウイルス（これはrAAV生産に必要であると言われてきた少なくとも４つのアデノウイルス遺伝子；E1、E2、E4およびVAIを供給する）での混合感染が関与する［例えばCarter、同上、を参照にされたい］。しかしこの方法では混合感染が強制的であり、そして非-相同的組換えから生じる許容できない高レベルのwtAAVおよび生産されたrAAVへのwtAAVの混入を導く。他のウイルスまたはプラスミドの混入は、rAAVの精製を必要とする。混入wt AAVまたはヘルパーアデノウイルスの不存在下で細胞をrAAVとインキューベーションすると、わずかな組換え体の遺伝子発現しか生じない。
【０００５】
遺伝子療法のために形質導入AAVビリオンを製造するための広く認識されている手段には、２つの異なる相補する(complementing)プラスミドを用いたコ−トランスフェクション（co-transfection）が必要である。このようなプラスミドの１つは、２つのシスに作用するAAV ITRsの間に挟まれた治療用またはレポーター導入遺伝子を含む。子孫の組換え体ゲノムのレスキューおよびその後のパッケージングに必要なAAV成分は、repおよびcapタンパク質のウイルスオープンリーディングフレイムをコードする第２プラスミドによりトランスで提供される。この系では、Adヘルパー機能はwtアデノウイルスにより、またはHEK293細胞により供給される失ったE1遺伝子を持つ複製−欠損性アデノウイルスにより提供される。この方法の他の変更はすでに記載されている。例えば、米国特許第5,658,785号明細書（これはrAAVゲノムで、およびAAV repおよびcap遺伝子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、および宿主細胞をヘルパーウイルスで感染することによる生産法に関する）を参照にされたい。
【０００６】
米国特許第5,658,776号明細書は、AAVp5プロモーターがヘテロロガスなプロモーターにより置き換えられたAAVベクターをパッケージングするためのパッケージング系および方法に関する。あるいは米国特許第5,622,856号明細書は、ホモロガスなp5プロモーターがrep遺伝子の位置3'に移動し、場合によってはFRT配列でrep/cap遺伝子および再配置p5プロモーターを挟むAAVベクター生産用の構築物または方法に関する。
【０００７】
当該技術にはすでに記載された方法に存在する非効率、混入および精製の問題無しに、体細胞遺伝子療法用のベクターとして使用するためのAAVおよび組換えAAVウイルスの効率的な生産を可能とするさらなる組成物および方法の必要性が存在する。
発明の要約
本発明は、所望の導入遺伝子DNAを含むrAAVの効率的生産を可能とする。特に本発明は、rAAV生産中に混入する再集成されたwtAAVを生産する事なく、rAAVの生産を可能とする組成物および方法の両方を提供する。
【０００８】
１つの観点では、本発明は組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）ベクター、および選択細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とするために十分なアデノウイルス配列を含む、複製できる（replication-competent）ハイブリッドアデノウイルス／AAVウイルスを提供する。１つの態様では、ハイブリッドウイルスはハイブリッドウイルスがE4 ORF6機能に必要な配列を含むように、野生型アデノウイルスE3領域に機能的欠失を、かつ／またはE4領域に非−必須アデノウイルス配列の欠失を含む。
【０００９】
別の観点では、本発明は（ａ）複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス5'シス-要素；（ｂ）組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）ベクター；（ｃ）E3領域からのアデノウイルス配列の欠失；（ｄ）E1aおよびE1b遺伝子産物の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスE1aおよびアデノウイルスE1bをコードする核酸配列、ここで該E1aおよびE1b核酸配列はE3領域の部位に位置する；（ｅ）複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス3'シス-要素を含む、アデノウイルス／AAVハイブリッドウイルスを提供する。
【００１０】
別の観点では、混入するヘルパーウイルスまたは野生型ウイルスの不存在下で、組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）の生産法、この方法は複製できるrAd/AAVならびにAAV rep配列およびAAV cap配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る宿主細胞を培養する工程を含んで成る。適当にはこの方法はさらに、感染後のrAd/AAVハイブリッドの複製を制御する工程が含まれ、これによりrAAVの複製を強化する。好適な態様では、本発明の方法は複製できるrAd/AAVがパッケージングされるrAAV構築物およびすべての必要なアデノウイルス配列を提供し、使用するヘルパーウイルスが無く、しかも混入するwtウイルスに対する相同的組換えを可能とする十分なアデノウイルス配列が宿主細胞中に無いので、精製工程が簡略化される。
【００１１】
本発明の他の観点および利点は、以下の本発明の好適な態様の詳細な説明にさらに記載する。
発明の詳細な説明
I．E1 を発現するアデノウイルス /AAV ハイブリッドウイルス
本発明は、組換えアデノウイルス/AAV(rAd/AAV)ハイブリッドウイルスを提供し、ここでアデノウイルスはrAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物、および選択した宿主細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とする十分なアデノウイルス配列を含むように操作されている。好適な態様では、すべての必要なアデノウイルス遺伝子が、rAd/AAVハイブリッドウイルスにより提供され、これは野生型E3からアデノウイルス配列を失っていてよく、そしてアデノウイルス配列の非機能的欠失を含んでもよく、例えばハイブリッドウイルスはE4 ORF6機能を発現するために必要な配列を除くすべてのアデノウイルスのE4コード配列を失ってもよい。rAAV構築物はアデノウイルスのE3またはE1領域のいずれかに挿入され得る。場合によりE1遺伝子産物をコードする配列は、野生型E3領域に挿入され、そして発現される。別の態様では、本発明はE1遺伝子産物を発現しているが、宿主細胞により供給される１以上の他の必要なアデノウイルス配列（例えば、E2aおよび／またはE4 ORF6)は欠いているrAd/rAAVを提供する。以下に詳細に記載する本発明のハイブリッドウイルスは、AAV rep配列およびAAV cap配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含む宿主細胞中でのrAAVの発現に有用である。
Ａ．アデノウイルス遺伝子配列
本発明のrAd/rAAVハイブリッドウルスに使用する最小アデノウイルス配列は、アデノウイルスのシスに作用する逆方向末端反復（ITR）配列（これは複製起点として作用する）である。最も好適にはこのようなITR配列は、アデノウイルスの自然な5'および3'ITRを含む。しかし所望により、このような自然な配列に対する修飾も操作され得る。あるいはハイブリッドウイルスは異なる血清型のアデノウイルスに由来するITRsを含むように、あるいは２つの同一のITRsを含むように操作することもできる。またrAd/rAAVハイブリッドウイルスは、直線状のAdゲノムおよびE1プロモーターのエンハンサー要素をパッケージングするために必要な配列を含んでもよい。このような配列は自然なアデノウイルス5'パッケージング／エンハンサードメインにより都合よく提供され得る。さらにrAd/AAVハイブリッドウイルスは、選択された宿主細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とするために必要なアデノウイルスDNAを含む。
【００１２】
最小のアデノウイルスの機能に加えて、rAd/rAAVハイブリッドウイルスはさらなるアデノウイルス配列を含むことができる。最も好ましくはすべての必要なアデノウイルスの遺伝子産物、すなわちE1a、E1b、E2a、E2b、E4 ORF6、アデノウイルスの中期遺伝子IXおよびIXａ、およびアデノウイルスの後期遺伝子L1、L2、L3、L4およびL5が、ハイブリッドウイルスから発現される。アデノウイルス配列は１以上の野生型アデノウイルスまたは突然変異体アデノウイルスから誘導してもよい。
【００１３】
本発明に有用なアデノウイルス遺伝子をコードするDNA配列は、現在同定されている46のヒト型［例えば、Horwitz、同上およびアメリカン タイプ カルチャー コレクションを参照にされたい］を含む１以上のアデノウイルス型の中から選択することができる。同様に他の動物を感染させることが知られているアデノウイルスは、遺伝子配列を供給することができる。各E1およびE2a遺伝子配列の選択が本発明を限定することはない。Ad5型の血清型を含め多数のアデノウイルス血清型に関する配列は、ジーンバンクから入手可能である。種々のアデノウイルス株は、バージニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手でき、あるいは様々な工業用および研究用提供元から入手することができる。以下の実施例の態様では、E1およびE2a遺伝子配列は５型のアデノウイルス血清型（Ad5）に由来するものである。
【００１４】
本発明で使用するように「遺伝子産物を発現するDNA」とは、任意の核酸配列、それらの遺伝子産物または任意の機能的部分を意味する。同様に、核酸配列（例えば遺伝子）またはそれらの機能的部分の任意の対立遺伝子または他の修飾を含む。本発明で定めるように、「機能的部分または機能的フラグメント」とは、必要な所望する機能を提供するために必要なコード配列または遺伝子産物の領域である。そのような修飾は幾つかの様式で、ならびに自然に生じるそれらの対立遺伝子変異により遺伝子産物（１つまたは複数）の機能を強化するための通例の遺伝子操作または突然変異誘発法の手段により計画的に導入することができる。「機能的欠失」とは、その領域の機能を提供するために必要な配列を欠くコード配列または遺伝子産物の領域を称する。用語「機能的欠失」とは、領域の機能が排除されることを意味するとは限らない。領域またはそれらのフラグメントの切り出しは必要ではない。
【００１５】
好適な態様では、本発明のrAd/AAVハイブリッドウイルスはアデノウイルスのE3遺伝子産物をコードする配列を欠き、すなわちヘテロロガスな配列を複製および感染には必須ではない自然なE3領域に挿入することを可能とする。そのようなヘテロロガスな配列はアデノウイルスには自然ではない任意の核酸配列、または同じアデノウイルスの非連続領域からの任意の核酸配列でよい。同様に、rAd/AAVハイブリッドウイルスは、必須なE4 ORF6を除きアデノウイルスE4コード配列を欠いてもよい。適当にはrAd/AAVハイブリッドウイルスは、自然なアデノウイルスゲノムのサイズの105％を越えないように操作される（例えば36kbの105％)。すなわち所望するヘテロロガス配列の挿入を望む場合、rAd/AAVはハイブリッドが操作されるアデノウイルス（１つまたは複数）に対して野生型の配列の他の非機能的欠失を含むように操作することができる。そのような非機能的欠失は、ハイブリッドウイルスがハイブリッドウイルスの複製に必要な機能的遺伝子産物を発現する能力を消さない欠失を含む。E4 ORF6配列を除くすべてのアデノウイルスE4コード配列の欠失は、非機能的欠失の例である。他の適当な非機能的欠失も、容易に設計することができる。
【００１６】
すなわち、特に望ましい態様では、rAd/AAVハイブリッドウイルスの複製に必要なすべてのアデノウイルス遺伝子は、ハイブリッドウイルス自体により提供される。そのようなハイブリッドウイルスはビリオン中にパッケージングされるrAAV構築物を含み、アデノウイルスのE3をコードするアデノウイルス配列を欠き、そしてE4 ORF6機能を除くすべてのアデノウイルスE4コード配列を欠く。場合により、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子産物は、野生型E1領域以外の領域から発現されてもよく、例えばこのような遺伝子産物は野生型E3領域に挿入され、そして発現される。
【００１７】
別の態様では、本発明のrAd/AAVは複製に必要な１以上の他のアデノウイルス遺伝子を欠いている。ハイブリッドウイルスから欠失した必要なアデノウイルスの遺伝子産物は、選択したパッケージング細胞による生産プロセスで、または所望の遺伝子産物の発現を支配する核酸配列によりトランスに供給され得る。好ましくはrAd/AAVはE1aおよびE1b遺伝子産物を発現する。１例では、rAd/AAVハイブリッドウイルスは野生型E1機能を含むが、E4 ORF6の発現に必要な配列を欠く。この状況では、rAd/AAVハイブリッドがE4 ORF6の発現に必要な配列を含む宿主細胞に導入される。別の例では、rAd/AAVハイブリッドウイルスは、rAAVの生産に使用される宿主細胞中で機能を発現するE2aの発現に必要な配列を欠く。そのような宿主細胞を以下に詳細に説明する。
【００１８】
本発明の範囲内にあるこれらのおよび他のrAd/AAVハイブリッドウイルスの設計は、発現を促進するために目的遺伝子に操作可能に連結された適当な配列を含む。「操作可能に連結された」配列は、目的遺伝子と連続する発現制御配列およびトランスにまたは目的遺伝子の制御に対して遠くで作用する発現制御配列の両方を含む。そのような発現制御配列を導入遺伝子と関連して詳細に検討する。各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然のプロモーター（すなわちプロモーターはアデノウイルス遺伝子の5'フランキング領域と自然に結合しているものでよい）から独立して選択することができる。プロモーターは生物または細胞の特別な生理状態（すなわち分化状態により、または複製もしくは静止細胞中で）により、あるいは例えば外から加えた因子により調節することができる。選択したプロモーターは、同一でも異なっていてもよい。
【００１９】
１つの態様では、E1a遺伝子（そして続いてE1b遺伝子）は、構成的プロモーター、限定するわけではないがRSV LTRプロモーター／エンハンサー、CMV前初期プロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸シダクターゼプロモーター、細胞質β-アクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーターの制御下で発現される。
【００２０】
別の態様では、過剰に蓄積すると細胞に傷害性となり得るE1aおよびE1b遺伝子産物の細胞の生産の量および時期を制御するように、誘導性プロモーターがE1遺伝子産物を発現するために使用される［例えば、William S.M.Wold,J.Cell Biochem.,53:329-335(1993):J.Nevins,Current Opinion in Genetics and Decelopment,4:130-134(1994);E.Harrington et al.,Current Opinion in Genetics and Decelopment,4:120-129(1994);G.Evan et al.,Current Opinion in Cell Biology,7:825-834(1995);J.Nevins,Science,258:424(1992)を参照にされたい］。誘導性プロモーターは、当該技術分野で既知の、および上記で検討したプロモーターを含み、限定するわけではないが亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；T7プロモーター；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン-抑制系；テトラサイクリン-誘導系；RU486-誘導系；およびラパマイシン-誘導系を含む。強力に調節され、そして高レベルのE1発現を提供する任意の種類の誘導性プロモーターを使用できる。この内容において有用である他の種類の誘導性プロモーターは、特別な生理的状態、例えば温度、急性期、細胞の特別な分化状態、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターである。
Ｂ．組換えAAVに構築物
rAd/AAVウイルスでは、AAV配列を自然なアデノウイルス配列が欠失している領域のアデノウイルス骨格に導入し、そしてこれらを選択したアデノウイルス配列により挟む。AAV配列は典型的には本発明の方法に従いrAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物（例えばカセット）の状態である。rAAV構築物は最小の（5'から3'への)5'AAV ITR配列、選択したプロモーターおよび他の通例のベクター調節成分の制御下の選択した導入遺伝子、および3'AAV ITR配列を含む。このようなrAAV構築物の各成分を以下に検討する。また米国特許第5,856,152号および同第5,871,982号明細書も参照にされたい。当業者はrAAV構築物を所望のアデノウイルス領域に挿入するように、rAd/AAV ハイブリッドウイルスを容易に操作することができる。１つの態様では、rAAV構築物はrAd/AAV ハイブリッドウイルスのアデノウイルスE3領域に位置する。別の適当な態様では、rAAV構築物はrAd/AAV ハイブリッドウイルスのアデノウイルスE1領域に位置する。しかし本発明はこのような例示する態様に限定されない。
１．AAV配列
使用するAAV配列は、好ましくはシスに作用する5'および3'逆方向末端反復配列である［例えばB.J.Carter、「パルボウイルスのハンドブック（Handbook of Parvoviruses）」、P.Tijsser編集、CRC出版、155〜168頁(1990)を参照にされたい］。ITR配列は約145bpの長さである。好ましくはITRsをコードする実質的に全配列が分子中で使用されるが、このような配列のわずかな程度の修飾は許容され得る。このようなITR配列を修飾する能力は、当業者の技術的範囲内である。［例えば、Sambrook et al.「モレキュラークローニング。ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1989)のようなテキスト；Carter et al.、同上；およびK.Fisher et al.,J.Virol.,70:520-532(1996)を参照にされたい］。本発明で使用するそのような分子の例は、導入遺伝子を含む「シスに作用する」プラスミドであり、ここで選択した導入遺伝子配列および付随する調節要素は5'および3'AAV ITR配列により挟まれている。
【００２１】
AAV ITR配列は、現在同定されているヒトAAV型を含め任意の既知のAAVから得ることができる。同様に、他の動物を感染させることが知られているAAV も、本発明の分子または構築物で使用するこれらのITRsを提供することができる。例えばITRsは１型AAV、２型AAV、３型AAV、４型AAV、５型AAV、６型AAV、他の血清型のAAVまたはデンソウイルスにより提供され得る。種々のAAV株がアメリカン タイプ カルチャー コレクションから入手することができ、あるいは様々な工業用および研究用の提供源から入手することができる。以下の例示的態様では、AAV-2が便宜的に使用されている。しかしこのような配列を提供するAAVの種および血清型の選択は、本出願の教示に従い当業者の技術範囲内であり、そして以下の発明を限定することはない。
２．導入遺伝子
本発明に従い、rAAV構築物は所望の導入遺伝子、プロモーターおよび宿主細胞中でAAV配列により挟まれた導入遺伝子の発現を制御そして支配する他の調節要素を含む。導入遺伝子配列はAAV配列に対してヘテロロガスな核酸配列であり、導入遺伝子が目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする。導入遺伝子配列の組成物は、生成するrAAVの意図する用途に依存する。例えば導入遺伝子配列の１種はレポーターまたはマーカー配列を含んで成り、これは発現で検出可能なシグナルを生成する。そのようなレポーターまたはマーカー配列は、限定するわけではないがβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ（LacZ)、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色の蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、例えばCD2、CD4、CD8を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質および当該技術分野で周知の他の配列を含み、これらに向けられる高親和性抗体が存在するか、または日常的に作成されることができ、そして融合タンパク質は中でも赤血球凝集素またはMycに由来する抗原標識ドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んで成る。
【００２２】
このような配列は、発現を駆動する調節配列と結合した時、酵素的、ラジオグラフィー的、発色的、蛍光的または他の分光的アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイおよびELISA、RIAおよび免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば導入遺伝子がLacZ遺伝子である場合、rAAVの存在はベータ−ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。同様に導入遺伝子がルシフェラーゼである場合、rAAVはルミノメーター中での光生産により測定することができる。
【００２３】
しかし望ましくは導入遺伝子は、この方法により生産されるrAAVを介して細胞または動物に送達され得る非−マーカー遺伝子である。導入遺伝子は、タンパク質、アンチセンス核酸（例えばRNA）、または触媒的RNAのような生物学的および医学的に有用な広範な種類の遺伝子産物から選択することができる。本発明は遺伝子欠失を矯正または改善するために使用することができ、ここで正常な遺伝子が発現されるが、正常レベルよりは低く、そして機能的遺伝子産物が発現されない遺伝的欠陥を矯正または改善するために使用することができる。好適な種類の導入遺伝子配列は、宿主細胞中で所望の遺伝子産物を発現する治療用遺伝子である。このような治療用核酸配列は典型的には発現すると遺伝的または非−遺伝的欠陥を矯正または相補することができるか、あるいは後成的な障害または疾患を処置することができる産物をコードする。しかし選択した導入遺伝子は研究のために望ましい任意の産物をコードすることもできる。この導入遺伝子の選択は本発明を限定しない。導入遺伝子配列の選択は本出願の教示に従い、当業者の技術的範囲内にある。
【００２４】
また本発明は、マルチ−サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝子欠陥を矯正または改善するために使用することができるrAAVの製造法を含む。特定の状況では、異なる導入遺伝子を使用してタンパク質の各サブユニットをコードすることができる。これはタンパク質のサブユニットをコードするDNAのサイズが大きい時、例えば免疫グロブリンまたは血小板由来増殖因子レセプターの時に望ましい。細胞がマルチ−サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞は異なるサブユニットの各々を含有するrAAVに感染しなければならない。あるいはタンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によりコードされ得る。この場合、１つの導入遺伝子が各サブユニットをそれぞれコードするDNAを含み、各サブユニットのDNAはインターナルリボゾームエントリーサイト（internal ribosome entry site：IRES）により分けられている。これはサブユニットをコードする全DNAおよびIRESが５キロベースよりも小さくなるように、各サブユニットをコードするDNAサイズが小さい時に望ましい。
【００２５】
有用な遺伝子産物は、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（GH）、副甲状腺ホルモン（PTH）、成長ホルモン放出因子（GRF）、濾胞刺激ホルモン（FSH）、黄体ホルモン（LH）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（hCG）、血管内皮増殖因子（VEGF）、アンギオポイエチン（angiopoietin）、アンギオスタチン（angiostatin）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、エリスロポイエチン（EPO）、結合組織増殖因子（CTGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォーミング増殖因子α（TGFα）、血小板由来増殖因子（PDGF）、インスリン−様増殖因子IおよびII（IGF-IおよびIGF-II）、TGFβ、アクチビン、インヒビンを含んで成る任意のトランスフォーミング増殖因子β(TGFβ）スーパーファミリー、あるいは骨形態形成タンパク質（BMP)BMPs1-15、増殖因子のヒグレリン／ニューレグリン／ARIA／neu分化因子（NDF）ファミリーの任意の１つ、神経成長因子（NGF）、脳−由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン NT-3およびNT-4/5，毛様体神経栄養因子（CNTF）、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）、ノルトリン（neurturin）、アグリン（agrin）、セマホリン（semaphorin)／コラプシンのファミリーの任意の１つ、ネトリン-1およびネトリン-2、肝細胞増殖因子（HGF）、エファリン（ephrin）、ノギン、ソニック ヘッジホックおよびチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび成長および分化因子を含む。
【００２６】
他の有用な産物は免疫系を調節するタンパク質を含み、限定するわけではないが、トロンボポイエチン（TPO)、インターロイキン（IL) IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16およびIL-17、単球ケモアトラクタント（chemoattractant)タンパク質（MCP-1）、白血病抑制因子（LIF）、顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）、Fas-リガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ（TNFαおよびTNFβ）、インターフェロン（INF）INF-α、INF-βおよびINF-γ、幹細胞因子、flk-2/flk-3のようなサトカインおよびリンホカインを含む。免疫系により生産される遺伝子産物も本発明に包含する。これらには限定するわけではないが、免疫グロブリン IgG、IgM、IgA、IgM、IgDおよびIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスIおよびクラスII MHC分子ならびに単鎖MHC分子を含む操作されたMHC分子を含む。遺伝子産物の用途には、補体調節タンパク質、膜コファクタータンパク質（MCP）、崩壊促進因子（DAF）、CR1、CR2およびCD59のような補体調節タンパク質を含む。
【００２７】
さらに別の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本発明はコレステロール調節のレセプターを包含し、LDLレセプター、HDLレセプター、VLLDレセプターおよびスカベンジャーレセプターを含む。また本発明は、ステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーのような遺伝子産物を包含し、グルココルチコイドレセプターおよびエストラゲンレセプター、ビタミンＤレセプターおよび他の核レセプターを含む。さらに有用な遺伝子産物は、jun、fos、max、mad、血清応答因子（SRF）、AP-1、AP-2、myb、MRG1、CREM、Alx4、FREAC1、NF-κB、ロイシン ジッパータンパク質の員、Zif268、EGR1、EGR2を含むC2H4ジンクフィンガータンパク質、グルココルチコイドおよびエストロゲンレセプターのようなC6ジンクフィンガータンパク質、Pit1により例示されるPOUドメインタンパク質、HOX-1を含むホモドメインタンパク質、myc、MyoDおよびミオゲニンを含む塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質、EST-ボックスを含むタンパク質、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNG-4、C/EBP、SP1、CCAAT-ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（IRF-1)、Wilms腫瘍タンパク質、EST-結合タンパク質、STAT、GATA-ボックス結合タンパク質、例えばGATA-3、およびウイング（winged）ヘリックスタンパク質のフークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【００２８】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル シンセターゼI、オルニチン トランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネート シンセターゼ、アルギノスクシネート リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニン ヒドロキシラーゼ、アルファ-１ アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、低密度−リポタンパク質レセプター、ポルホビリノーゲン デアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオン ベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-CoA デヒドロゲナーゼ、プロピオニル CoA カルボキシラーゼ、メチル マロニル CoA ムターゼ、グルタリル CoA デヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン デカルボキシラーゼ（P-プロテインとも言われている）、H-プロテイン、T-プロテイン、メンケス病タンパク質、腫瘍抑制物質（例えばp53）、のう胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター（CFTR）、およびウィルソン病遺伝子PEDを含む。
【００２９】
他の有用な導入遺伝子は、自然には存在しないキメラまたはハイブリッドポリペプチドのようなポリペプチド、または挿入、欠失またはアミノ酸置換を含む自然には存在しないアミノ酸配列を含む。例えば単鎖の操作した免疫グロブリンは、ある種の免疫抑制患者には有用となることができる。他の種類の自然には存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子およびリボザイムのような触媒的核酸、これは遺伝子の過剰発現を下げることができる。
【００３０】
哺乳動物細胞および宿主中で発現するための導入遺伝子の設計は、発現を促進するために目的遺伝子に操作可能に連結された適当な配列を含むべきである。発現制御配列は、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニレーションシグナルのような効率的なRNAプロセッシング シグナル；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザックのコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および所望する時には、タンパク質の分泌を強化する配列を含む。莫大な数の発現制御配列（天然の、構成的、誘導性および／または組織-特異的）が当該技術分野では知られており、そして所望する発現の種類に依存して導入遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。真核細胞には、発現制御配列は典型的にはプロモーター、エンハンサー（免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等から誘導されるようなもの）、およびスプライスドナーおよびアクセプター部位を含むポリアデニレーション配列を含む。ポリアデニレーション配列は一般に導入遺伝子配列の後、そして3'AAV ITR配列の前に挿入される。本発明に有用なrAAV構築物は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に配置されたイントロンも含む。１つの可能なイントロン配列もSV40に由来し、そしてSV-40 Tイントロン配列と称する。使用できる別のベクター要素は、インターナル リボザイム エントリー サイト（IRES）である。IRES配列は１つの遺伝子転写物から１以上のポリペプチドを生成するために使用される。IRES配列は１以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使用される。このようなおよび他の通例のベクター要素の選択は常法であり、そして多くのそのような配列が入手可能である［例えば、Sambrook et al.,およびそこに引用されている文献、例えば第3.18-3.26および16.17-16.27頁およびAusebel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1989を参照にされたい］。
【００３１】
１つの態様では、高レベルの構成的発現が望ましい。そのようなプロモーターの例は、限定するわけではないがレトロウイルス ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター／エンハンサー、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター／エンハンサー［例えば、Boshart et al.,Cell.41:521-530(1985)］、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸シダクターゼプロモーター、細胞質β-アクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーターを含む。
【００３２】
別の態様では、誘導性プロモーターが望ましい。誘導性プロモーターは外部から供給される化合物により調節されるプロモーターであり、限定するわけではないが亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；T7ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第98/10088号明細書］；エクジソン昆虫プロモーター［No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)］；テトラサイクリン-抑制系［Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)］；テトラサイクリン-誘導系［Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)；ならびにまたHavey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1988)を参照にされたい］；RU486-誘導系［Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)およびWang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997)］；およびラパマイシン-誘導系［Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997)］を含む。この内容において有用である他の種類の誘導性プロモーターは、特別な生理的状態、例えば温度、急性期、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターである。好適な態様では導入遺伝子はP5天然AAVプロモーターの制御下である。
【００３３】
別の態様では、導入遺伝子に天然のプロモーターが使用される。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が自然な発現を模倣するべき時に望ましい。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的または発育的に、あるいは組織−特異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用できる。さらなる態様では、エンハンサー要素、ポリアデニレーション部位またはコザックのコンセンサス配列のような別の天然の発現制御要素も自然な発現を模倣するために使用することができる。
【００３４】
導入遺伝子の別の態様は、組織−特異的プロモーターに操作可能に結合した導入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現を所望する場合、筋肉中で活性なプロモーターを使用するべきである。これらには、骨格筋α-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成の筋肉プロモーター［Li et al.,Nat.Biotech.17:241-245(1999)］を含む。組織−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓について［アルブミン、Miyatake et al.,J.Virol.,71:5124-32(1997)；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；アルファ-フェトプロテイン(AFP)、Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996)］、骨について［オステオカルシン、Stein et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-86(1997)；骨のシアロプロテイン、Chen et al.,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996)］、リンパ球について［CD2、Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖］、ニューロンについて［ニューロン−特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター、Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991)；ニューロン-特異的vgf遺伝子、Piccioli et al.,Neuron,15:373-84(1995)］知られている。
【００３５】
もちろん、すべてのベクターおよび発現制御配列が本発明のすべての導入遺伝子を発現させるために等しくよく機能するわけではない。しかし当業者は、本発明から逸脱することなくこのような発現制御配列の中から選択することができる。適当なプロモーター／エンハンサー配列は、本出願により提供される手引きを使用して、当業者により選択され得る。そのような選択は日常的な事柄であり、分子または構築物を限定しない。例えば目的の導入遺伝子に操作可能に連結された１以上の発現制御配列を選択し、そして発現制御配列および導入遺伝子を含んで成る「ミニ遺伝子」をAAVベクターに挿入することができる。本出願で教示する、または当該技術で教示するようにrAAVをパッケージングする１方法に従った後、インビトロまたはインビボで適当な細胞を感染させることができる。細胞中の導入遺伝子のコピー数は、サザンブロッティングまたは定量的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりモニターすることができ；RNA発現のレベルはノーザンブロッティングまたは定量的な逆転写酵素(RT)-PCRによりモニターすることができ：そしてタンパク質発現のレベルはウエスタンブロッティング、免疫組織化学、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、放射性免疫アッセイ（RIA）または導入遺伝子の遺伝子産物の生物活性の試験によりモニターすることができる。すなわち特定の発現制御配列が特別な導入遺伝子に適当であるかどうかを容易にアッセイし、そして所望の導入遺伝子の発現に最も適当な発現制御配列を選択することができる。
Ｃ．rAd/AAV ハイブリッド ウイルスの生産
本発明のrAd/AAV ハイブリッド ウイルスは、本明細書に記載し、ならびに当業者に既知である材料および方法を使用して構築し、そして生産することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用するそのような操作法は、核酸操作の当業者には既知であり、そして遺伝子操作、組換え工学および合成技法を含む。例えばSambrook et al.,and Ausubel、同上；および国際特許出願公開第95/13598号明細書を参照にされたい。さらにアデノウイルスのカプシド中にrAAVカセットを生産するために適する方法は、米国特許第5,856,152号および同第5,871,982号明細書に記載された。
【００３６】
本発明のrAd/AAV ハイブリッド ウイルスは複製できるので、当業者により知られ、そして本明細書中に記載した技法を使用して、選択した宿主細胞中で感染および複製により生産することができる。例えば米国特許第5,856,152号および同第5,871,982号明細書、および以下の第II部に記載するrAd/AAVを用いた宿主細胞の感染および培養法の検討を参照にされたい。
II．rAAV の生産
本発明の方法は、複製できるrAd/AAVを使用してrAAVの生産を提供する。特に好適な態様では、本発明の方法で使用するrAd/AAVはrAAVカセットおよび宿主細胞に対してすべての必要なアデノウイルス配列を提供し、すなわちヘルパーウイルスを用いた第２感染またはトランスフェクションの必要性を回避する。最も適当にはrAd/AAVハイブリッドウイルスは、ハイブリッドウイルスの複製に必要なすべてのアデノウイルス遺伝子産物がrAd/AAVハイブリッドウイルスにより発現されるように、本明細書に記載するように操作される。
【００３７】
簡単に説明すると、選択した宿主細胞をrAd/AAVハイブリッドウイルスで感染させる。いったんrAd/AAVハイブリッドウイルスが細胞に取り込まれると、AAV ITRにより挟まれた導入遺伝子は、好ましくは宿主パッケージング細胞中に存在するAAV rep遺伝子を感染した細胞に供給することにより、アデノウイルス骨格からレスキューされなければならない。組換えAAVゲノムは、好ましくは宿主パッケージング細胞中に存在するAAV cap遺伝子を感染した細胞に供給することによりパッケージングされる。
【００３８】
rAAVの生産に使用するrAd/AAVにかかわらず、本発明の方法はrAAVの最適な生産に重要である、宿主細胞の感染後の選択した時期に、rAd/AAVが複製する能力を制御する（すなわち、抑制または消失）工程を含む。この工程はrAd/AAVにより運ばれるrAAV構築物がレスキューされ、そしてrAAVビリオンにパッケージングされる能力を強化する。これは種々の手段により達成され、これを本明細書でより詳細に記載する。
Ａ．AAV RepおよびCap配列
rAd/AAVハイブリッドにより提供されるrAAV構築物をrAAVビリオンにパッケージングするために、宿主細胞はAAV repおよびAAV capまたはそれらの機能的フラグメントを発現するために必要な配列を含まなければならない。例えばrep78/52タンパク質は、必要なrep機能を提供するために十分であり得る。AAVrepおよびcap配列は、上記で確認されたAAV供給源から得られる。AAV repおよびcap配列は限定するわけではないがトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む上記のような当業者に既知の様式で宿主細胞に導入することができる。１つの態様では、repおよびcap配列は１以上の核酸分子により宿主細胞中にトランスフェクトされ、そしてエピソームとして細胞中で安定に存在し得る。別の態様では、repおよびcap配列は細胞のゲノムに安定に組み込まれる。repおよびcapを含む適当な宿主細胞は、PCT/US98/19463に記載されたB-50である。別の態様は、宿主細胞で一時的に発現されるrepおよびcap配列を有する。例えばそのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、5'から3'へ、プロモーター、場合によりプロモーターとrep遺伝子配列の開始部位との間に挿入されたスペーサー、AAV rep遺伝子配列、およびcap遺伝子配列を含んで成る。
【００３９】
repおよびcap配列はそれらの発現制御配列と一緒に、１つのベクターで供給されることができ、あるいは各々の配列をそれ自体のベクターで供給してもよい。好ましくはrepおよびcap配列は同じベクターで供給される。あるいはrepおよびcap配列は、宿主細胞に導入される他のDNA配列を含むベクターで供給することができる。
【００４０】
好ましくはこの構築物中で使用するプロモーターは、当業者に既知であるか、または上記のような任意の構成的、誘導性または天然のプロモーターである。好適な態様では、AAV P5プロモーター配列が使用される。これは任意の上記AAV源から得ることができるが、パルボウイルスP5プロモーターは好ましくはrepおよびcap遺伝子配列を提供するAAV血清型に相同的である。あるいはプロモーターはrepおよびcap配列を提供する型とは別のAAV型に由来するP5プロモーターでよい。ヒトまたは他の動物に感染することが知られているAAVも、P5プロモーターを提供することができる。任意のこのような配列を提供するためのAAVの選択は、本発明を限定しない。
【００４１】
別の好適な態様では、rep用のプロモーターは誘導性プロモーターである。上記に検討したように、誘導性プロモーターには限定するわけではないが、メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；T7ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン-抑制系；テトラサイクリン-誘導系；RU486-誘導系；およびラパマイシン-誘導系を含む。rep発現に好適なプロモーターはT7プロモーターである。T7プロモーターにより調節されるrep遺伝子およびcap遺伝子を含んで成るベクターを、構成的または誘導的にT7ポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクトまたは形質転換する。1998年3月12日さ公開された国際公開第98/10088号明細書を参照にされたい。
【００４２】
スペーサーはベクターの設計において任意の要素である。スペーサーはプロモーターとrep遺伝子ATG開始部位との間に挿入されたDNA配列である。スペーサーは所望の設計を有してよく；すなわちスペーサーはヌクレオチドの無作為な配列であるか、あるいはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは、開始／停止およびポリＡ部位を典型的に取り込む遺伝子を含むことができる。スペーサーは原核または真核生物に由来する非−コードDNA配列、反復非コード反復、転写制御が無いコード配列または転写制御を含むコード配列であることができる。２つのスペーサー配列の供給源の例は、λファージ ラダー配列または酵母ラダー配列であり、これらは中でも例えばギブコ（Gibco）またはインビトロゲン（Imvitrogen）から販売にれている。スペーサーはrep78およびrep68遺伝子産物の発現を下げ、rep52、rep40およびcap遺伝子の発現は正常レベルに残すために十分な任意のサイズであることができる。したがってスペーサーの長さは約10bpから約10.0kbp、好ましくは約100bpから約8.0kbpの範囲である。組換えの可能性を下げるために、スペーサーの長さは好ましくは２kbp未満であり；しかし本発明のそのように限定されない。
【００４３】
AAV repおよびcapタンパク質を提供する分子の例は、プラスミド、例えばpMT-Rep/Cap、pP5-Rep/CapおよびpMMTV-Rep/Capである。このようなプラスミドはそれぞれ、ネオマイシン選択マーカー遺伝子を含み、そしてそれらの天然のP5プロモーター(pP5-Rep/Cap)、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオニンプロモーター（pMTRRep/Cap)、あるいはデキサメタゾン(Dex)-誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター(pMMTV-Rep/Cap)のいずれかにより駆動されるAAV rep/cap遺伝子を発現する。このようなタンパク質は種々の手段により細胞に提供され得るが、本発明の方法の例には様々なプラスミドの使用を含む。プラスミドpMT-Rep/Capの構築には、ORF6配列をpMTE4ORF6プラスミド［G.P.Geo et al.,J.Virol.,70:8934-8943(1996)]からBamHI消化により取り出し、そして鋳型としてpSub201プラスミド［Samulski,R.J.et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)]を使用したPCR増幅により調製した4.1kbrep/capフラグメントと置き換えた。プラスミドpMMTV-Rep/CapはpMT-Rep/Capの構築と同様に構築したが、pMMTVEORF6プラスミド［Geo et al.，同上］をベクター骨格として使用した。P5-Rep/Capの構築には、MTプロモーターおよびORF6配列をpMTEORF6プラスミド［G.P.Geo et al.,J.Virol.,70:8934-8943(1996)]からEcoRI/BamHI消化により取り出し、そしてXbaI消化によりpSub201プラスミド［Samulski,R.J.et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)]から単離した4.3kbのP5 Rep/Capフラグメントと置き換えた。プラスミドの構築には、Sambrook et al.,同上に記載されているような通例の遺伝子工学法が含まれた。すべての上記に引用した参考文献は本明細書に編入する。
【００４４】
repおよびcapタンパク質を提供する様々な他のプラスミド構築物が当該技術分野では知られており、そして本発明の宿主細胞に使用することができる。例えば、rep/cap構築物は、上記の構築物において言うようなプロモーターとrep/cap遺伝子との間のスペーサーを省略してもよい。P5プロモーターをrep/cap遺伝子に対して3'に配置する米国特許第5,622,856号明細書に記載されているような当該技術における他の構築物も、本内容において使用することができる。
【００４５】
repおよびcapタンパク質を提供する分子は、このような成分を宿主細胞に移す任意の形態でよい。本明細書中に例示するように、この分子は好ましくはマーカー遺伝子のような他の非−ウイルス配列を含むことができるプラスミドの形態である。この分子はAAV IRTを含み、そして一般にはAAVパッケージング配列は含まない。相同的組換えが起こることを回避するために、他のウイルス配列、特にアデノウイルス配列はこのプラスミドでは避けられる。このプラスミドは望ましくは細胞に安定にトランスフェクトされ得るように構築される。
【００４６】
repおよびcapを提供する分子は宿主細胞に一時的にトランスフェクトされ得るが、宿主細胞は例えばエプソームとして、または宿主細胞の染色体への組込みにより宿主細胞中で機能的rep/capタンパク質を発現するために必要な配列で安定に形質転換されることが好ましい。そのような安定にトランスフェクトした宿主細胞の発現を制御するプロモーターに依存して、rep/capタンパク質は一時的に発現され得る（例えば誘導性プロモーターの使用を通して）。
【００４７】
本発明の態様を構成するために使用する方法は、上記参考文献に記載されているような通例の遺伝子工学または組換え工学法である。この明細書は特別な構築物の具体的な説明例を提供するが、本明細書に提供される情報を使用して、当業者はスペーサー、P5プロモーターおよび少なくとも１つの翻訳開始および停止シグナル、ならびに任意のポリアデニレーション部位の最適な付加を含む他の要素の選択を使用して、他の適当な構築物を選択し、そして設計することができる。
Ｂ．宿主細胞
哺乳動物の宿主細胞自体は、限定するわけではないがヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するA549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293細胞（これは機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Saos、C2C12、Ｌ細胞、HT1080、HepG2および初代繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のようなヒトの細胞型のような任意の哺乳動物種から選択することができる。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず；あるいは哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等をも限定しない。使用する細胞に関する要件は、rAAVの生産中に混入するウイルスの相同的組換えをもたらすことができるウイルス遺伝子を運んではならないということであり；そしてDNAのトランスフェクションおよびトランスフェクトしたDNAの発現が可能でなければならないということである。
【００４８】
好適な態様では、宿主細胞はB50細胞系のような細胞中に安定にトランスフェクトされたrepおよびcapを有するものである。米国特許第5,658,785号明細書に記載されているような他の安定なrep/cap発現細胞系も同様に使用することができる。別の適当な態様では、宿主細胞はハイブリッドウイルスが無いrAd/AAVハイブリッドウイルスの複製に必要な任意のアデノウイルス遺伝子産物を発現するために必要な配列で安定にトランスフェクトされる。
【００４９】
例えばrAd/AAVハイブリッドウイルスがアデノウイルスのE4 ORF6配列を欠く場合、選択した細胞系はE4 ORF6タンパク質の発現に必要な配列で安定にトランスフェクトされるように操作する。そのような場合、細胞系は好ましくはrep/capの発現のための配列を含むものである。rAd/AAVによる細胞の感染後、ハイブリッドウイルスにより発現されたE1aおよびE1b機能が宿主細胞によるrep/cap機能の発現を始めさせる。その後E4 ORF6発現は、望ましくはE4 ORF6遺伝子産物を発現するためにE4 ORF6機能を制御するプロモーターを誘導するために必要な薬剤を供給することにより始めさせる。
【００５０】
本明細書で検討するように、本発明は以下の具体的な態様例の細胞を使用することができる：
（ａ）AAVrepおよびcap遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)およびE4 ORF6遺伝子産物により安定にトランスフェクトされた細胞；
（ｂ）AAVrepおよびcap遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)、アデノウイルスE2a遺伝子産物およびアデノウイルスE4 ORF6で安定にトランスフェクトされた細胞；
（ｃ）エプソームに運ばれるか、または細胞の染色体に組込まれたAAVrepおよびcap遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされ、そして一時的にアデノウイルスのE2a遺伝子産物を発現する細胞；
（ｄ）少なくとも１つのAAVrepおよびcap遺伝子およびアデノウイルスE2a遺伝子産物（またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされた細胞；および
（ｅ）１以上のエプソームとして、または組込まれたDNAとして安定に、AAVrep遺伝子、AAVcap遺伝子、E2a遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされ、そして導入遺伝子を含む核酸分子を一時的に発現する細胞。
【００５１】
宿主細胞およびrAd/AAVハイブリッドウイルスが必要なrepおよび／またはcap配列および任意の必要なアデノウイルス配列を供給しない場合、このような配列は例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜誘導法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適当な方法により宿主細胞に導入することができる。
【００５２】
例えば、本発明の宿主細胞系またはrAd/AAVハイブリッドウイルスのいずれもがE2a遺伝子産物を発現しない場合、E2a遺伝子産物を発現するアデノウイルスDNAを、E2a遺伝子産物の発現を支配するプロモーターおよび他の調節成分も含む核酸配列の状態で宿主細胞に提供することができる。E2a用のプロモーターは、上記のような構成的、誘導性または天然のプロモーターでよい。E2a遺伝子産物の発現の制御に於けるプロモーターはある態様では構成的プロモーターでよいが、好適な態様ではプロモーターはE2a遺伝子産物生成（これは過剰に蓄積すると細胞に傷害性である［D.Brough et al., Virology,190:624-634(1992)およびD.Klessig et al.,Virus Res.,1:169-188(1984)]）の量および時期をE1遺伝子産物の生産に対して制御するような誘導性プロモーターである。１つの好適な態様は、E2aの生産を支配するプロモーターはE1aおよびE1bの発現を支配するプロモーターとは異なる誘導性プロモーターであり、そしてE1誘導性プロモーターに使用するものとは異なる誘導剤に暴露することにより誘導可能である態様を提供する。
【００５３】
核酸分子（プラスミドまたはウイルス）を宿主細胞に導入し、そして本発明に有用な宿主細胞を調製することは、当業者に既知の技術を使用して、そして本明細書を通して記載したように達成することができる。核酸分子の構築法には、cDNAおよびゲノムクローニング（これらは周知であり、そしてSambrook et al.,and Ausubel et al.、同上に記載されいる）、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望のヌクレオチド配列を提供するための任意の他の適当な方法と組合わせたアデノウイルスおよびAAVゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用が含まれる。好適な態様では、標準的なトランスフェクション法、例えばハイブリットアデノウイルス／AAVベクターによるヒト胚性腎細胞系HEK293(トランスに作用するE1タンパク質を提供する機能的アデノウイルスE1遺伝子を含むヒトの腎臓細胞)およびB50細胞系(安定に組込まれたrepおよびcap遺伝子を含むHeLa細胞系)のような細胞系へのCaPO4トランスフェクションまたはエレクトロポレーション、および／または感染を使用する。
Ｄ．rAAVの生産法
上記のように、本発明は混入するヘルパーウイルスまたは野生型の不存在下で、組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）を生産する方法を提供する。適当には、宿主細胞をrAd/AAVハイブリッドウイルスに、約0.5〜約1000またはその間、例えば約１〜約500、約10〜約250、そして約50〜約200の範囲の感染多重度で感染させる。
【００５４】
rAAVビリオンの生産法には、rAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物、AAVrep配列およびAAV capを配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含む本明細書に記載するようなrAd/AAVハイブリッドウイルスを含む哺乳動物細胞を培養することを含む。その後に、導入遺伝子の発現を支配する組換えAAVビリオンを、混入するヘルパーウイルスまたは野生型AAVの不存在下で細胞または細胞培養物から単離する。
【００５５】
この方法に使用する通例の技法は、rAAVウイルスゲノムのクローニング、およびシグナル生成の測定法等を含む。メッセージまたはシグナルを検出するために、あるいはrAAVを他のウイルスから分離するために精製工程は必要ない。一般に生産では、溶解物中の細胞タンパク質からrAAVを濃縮するために、クロライド勾配遠心またはカラムクロマトグラフィーのような通例の精製法が使用される。例えば、トランスフェクション培地を一緒に含む細胞がスクレーパーにより回収され、そしてエタノール−ドライアイスおよび37℃の水浴中で３回の凍結−解凍にかけられる。細胞は例えば４℃で15分間、遠心することもできる。
【００５６】
本発明のハイブリッドAd/AAVウイルスは複製できるため、選択した宿主細胞の感染後、rAAVビリオンの生産を至適化するために、rAd/AAVハイブリッドウイルスが複製する能力を制御し、これによりAAV構築物をレスキューし、そしてrAAVビリオンにパッケージングする能力を強化することが望ましい。rAd/AAVハイブリッドウイルスが感染後に複製する能力は、当業者には容易に明らかな種々の方法により抑制することができる。
【００５７】
例えば１つの特に適当な態様では、宿主細胞は温度感受性突然変異をアデノウイルスの複製および／またはパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子（例えばアデノウイルス遺伝子のE2b）に含むrAd/AAVハイブリッドウイルスを、約100〜約200のMOIで感染させる。その後に、宿主細胞を約32℃〜約37℃の温度で培養し、そして本明細書に記載するように単離する。以下の実施例で具体的に説明するように、この方法はrAAVの卓越した収率の提供することが分かった。温度感受性突然変異を含有する適当なrAdの１例は、すでに記載されたsub100rである［Schaack,J.et al.,J.Virol.,69:4079-4085(1995)］。
【００５８】
さらに、あるいはrAd/AAVの複製に必要な１以上のアデノウイルス遺伝子の発現を制御することができる。例えばアデノウイルスのE4（またはE4 ORF6）は、rAd/AAVにより、またはrAd/AAVハイブリッドウイルスが遺伝子産物を発現しない宿主細胞により、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の例では、アデノウイルスE1およびE2遺伝子産物は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの制御下で発現する。すなわちこの方法はさらに培養した宿主細胞と、少なくとも１つの必要なアデノウイルス遺伝子産物の発現を制御する少なくとも１つの誘導剤を接触させる工程を含む。必要な各アデノウイルス遺伝子産物が異なる誘導性プロモーターの制御下にある場合、この方法はさらに宿主細胞培養に第１誘導性プロモーター用の第１誘導剤および第２誘導性プロモーター用の第２誘導剤を加える工程が必要となる。この方法の態様は、このようにしてアデノウイルス遺伝子産物、例えばアデノウイルス遺伝子のE1a、E1b、E2aおよび／またはE4 ORF6の制御された発現を可能とする。さらに本発明はアデノウイルスの遺伝子産物（例えばE1aおよびE1b)を、他のアデノウイルス遺伝子産物(1つまたは複数)（例えばE2a)の発現に対して、所望の比率で発現することを可能とし、これは特定の宿主細胞中でその細胞に適する培養条件下でのrAAV生産に最適である。
【００５９】
E1遺伝子産物のE2a遺伝子産物およびAAV rep/cap産物に対する適当な比率の決定は、細胞の種類、使用する構成的および／または誘導性プロモーターの強さ、使用する誘導剤（１つまたは複数）の量、および好適な遺伝子産物の誘導の順序および時期を考慮して当業者により行われ得る。rAAVの最大生産を可能とする最適な比率は、このような因子が異なるので異なるかもしれない。例えばE1a遺伝子が弱いまたは中程度の強度の構成的プロモーターにより制御される場合、適当な比率を得るためにE2a遺伝子は強力な誘導性プロモーターにより制御され、そして誘導剤を培養の初期に加えるべきである。E1a遺伝子ならびにE2a遺伝子が誘導性プロモーターにより制御される場合、rAAVのための最適な生産系を提供するために、２種の誘導剤は量を変動させて、そして誘導の順序を変動させて加えることができる。しかし好適な量および順序を決定するために使用するそのような至適化実験は当業者の技術範囲内であり、そして本明細書の開示に照らせば単なる日常的な実験である。
【００６０】
本発明の別の好適な態様では、E1a遺伝子産物は誘導性プロモーターの制御下で発現され、そしてE1bおよびにE2a遺伝子、ならびに存在する他のアデノウイルス遺伝子（例えばE4ORF6および／またはVAI RNA）はそれらの自然なプロモーターの制御下で発現される。上記で検討したように、E1a遺伝子産物はE1b、E2aおよび他のアデノウイルス遺伝子の自然なプロモーターを活性化する。細胞が誘導されない時に低い基準レベルのE1aを発現し、そして細胞が誘導剤と接触した時に高レベルのE1aを発現する限り、任意の誘導性プロモーターを使用することができる。多数の誘導性プロモーターが当該技術分野では知られており、そして本明細書を通して検討した。特別な誘導性プロモーターには限定するわけではないが、亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン-抑制系；テトラサイクリン-誘導系；RU486-誘導系；およびラパマイシン-誘導系を含む。
【００６１】
以下の実施例は、本発明の幾つかの好適な方法を具体的に説明する。このような実施例は単に説明であり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【００６２】
【実施例】
実施例１−ヘルパー非依存的細胞系の生産のための B-50 細胞系および Ad/AAV ハイブリッドベクターの使用
組換えAd/AAVハイブリッドベクターは、米国特許第5,856,152号明細書に記載された方法を使用して構築するが、ただしE3遺伝子を削除し、そしてRSVまたはPGKプロモーターに操作可能に連結し、そして制御下にあるE1遺伝子を、アデノウイルスゲノムのE3領域にクローン化する。Ad/AAVハイブリッドベクターは、米国特許第5,856,152号明細書に記載されたようにパッケージングする。
【００６３】
簡単に説明すると、B-50はAAV２型repおよびcap遺伝子をホモロガスなp5プロモーターの制御下で安定に発現する細胞である。この細胞系はコンカテマー状態のP5-rep-cap-遺伝子カセットの多コピー(少なくとも５コピー)が宿主染色体に組込まれていることが特徴である。このB-50細胞系は、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の要件に従い、1997年9月18日にバージニア州 20110-2209、マナッサス 10801 ブルヴァール大学のアメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託番号CRL-12401で寄託された。
【００６４】
B-50細胞は、24時間に60mmのプレートあたり２×105細胞の密度でまかれる。24時間後、播種培地（抗生物質を補充したDMEM／10％FBS）をDMEM／２％FBSと交換する。細胞はE1およびrAAVミニ遺伝子を含有する組換えAd/AAVクローンにより適当なMOIで感染させる。このB-50細胞の１段階感染で、rAAV生産に必要なすべてのヘルパー遺伝子が提供される。すなわちsub100rのような他のヘルパーウイルスは必要ない。
【００６５】
感染から24〜96時間後、細胞溶解物を調製し、そして溶解物をrAAV生産について当該技術分野で既知の方法により滴定する。rAAVがrAAVLacZならば、溶解物は以下のように滴定することができる。細胞をトランスフェクション培地と一緒に、スクレーパーにより回収し、そしてエタノール−ドライアイスおよび37℃の水浴中で３回の凍結−解凍にかける。細胞は４℃で15分間、卓上で3000rpmにて遠心する。各溶解物の1/10を84-31細胞、rAAVにより形質導入可能なE1/E4-二重相補（complementing）細胞系を24時間感染させるために使用する。次いで84-31細胞をX-Galで組織化学的に染色する。各感染で多数の青色の細胞が採点され、そして各トランスフェクションで生産されたrAAVLacZの感染単位（IU、IUは計数された1つの青色細胞と定めた)として表す。
実施例２−複製できる Ad-AAV ハイブリッドウイルスによる B50 細胞中の rAAV の生産
緑色の蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子がCMVプロモーターにより駆動され、そしてAAV2 ITRsにより挟まれたAArVCMVGFPゲノムを、Ad5突然変異体、Sub100rウイルスのE3領域にクローン化した。Sub100rのE2b末端タンパク質遺伝子は、３bpの挿入により破壊され、温度感受性の表現型とした。生成した組換えAd-AAVハイブリッドは、E11、E2a、E4およびVARNA遺伝子については遺伝子型では野生型であるが、E3遺伝子は今、rAAVCMVGFPゲノムに置き換えらている。すなわちこの第２世代のAd-AAVハイブリッドは、すべての必須なヘルパー遺伝子およびrAAVゲノムを保有し、そして理論的にはB50細胞をウイルスで１回感染させれば、rAAVゲノムのレスキュー、複製およびパッケージングを導くはずである。
Ａ．複製できるrAd-AAVハイブリッドウイルスの構築
市販されているプラスミド構築物pAB27は、マイクロビックス バイオシステムズ(Microbix Biosystms）（オンタリオ州、カナダ）から購入した。このプラスミドはA5dゲノムの以下のセダメントを持つ：m.u.78.3n85.8に広がる2.7kbE3欠失を含むm.u.0−1、10.6−16.1および69−100。組換えAAVCMVGFPゲノムは、prAAVCMVGFP構築物［強化されたGFP、EGFPを含むクローンテックの製品］からPvuIIフラグメントとして単離され、そしてpAB27プラスミドのScaI部位にクローン化された。生成したシャトルプラスミドを、pABrAAVCMVEGFP［図１Ａ］と命名した。Ad E2B末端タンパク質突然変異体、Sub100rは許容され得る32℃で条件付きで複製できるある新しいAd-AAVハイブリッドを構築するためにウイルス骨格として使用した。rAAVCMVEGFPをSub100rゲノムに導入するために、Sub100rウイルスDNAを制限エンドヌクレアーゼSpeIで消化し、そしてpABrAAVCMVEGFPを用いて293細胞にリン酸カルシウム法によりコー−トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をトップアガーに重層し、そして32℃で14日間培養した。Sub100r-rAAVCMVGFPの緑色のウイルスプラークをさらなるプラーク精製のために単離し、そして大規模なウイルス調製用に拡大した。Sub100rAAVCMVGFPハイブリッドウイルスを生成するための相同的組換え工程の具体的説明については図１Ｂを参照にされたい。
Ｂ．rAAVの生産
B50細胞は、ウェルあたり１×105細胞密度で12ウェルプレートにまいた。24時間後、細胞をSub100rAAVCMVGFPハイブリッドで細胞あたり100、1000、2000および4000ウイルス粒子に感染させた。各感染について３重の12ウェルプレートを、異なる温度32、37および39.5℃でのインキューベーションのために準備した。陽性対照として、12ウェル中のB50細胞を野生型Ad5ヘルパーおよびSub100rAAVCMVGFPを用い、上記のMOIで同時に、または24時間の間隔で感染させた。感染から72、96および120時間後、各感染の全細胞溶解物を回収した。３回の凍結−解凍サイクルを通した後、溶解物を４℃で15分間、3000rpmで遠心した。生成した各サンプルの上清を集め、そして-80℃で保存した。各感染で生産されたrAAVCMVGFPを定量するために、各サンプルの一部を56℃に１時間加熱して、感染性Ad-AAVハイブリッドsub100r-AAVCMVGFPを不活性化し、そして84-31細胞、E1/E4相補細胞クローンに連続希釈して乗せた。各サンプルの緑色の蛍光形成単位（GFFU）を感染から24〜48時間でUV-顕微鏡下で採点し、最初のsub100rAAVCWGFP感染において使用したB50細胞あたりのGFFUとしてコンピーター処理した。ここでの１GFFUは限定-希釈感染において、rAAVCMVGFPによるGFP形質導入のフォーカスにより定めた。すなわち細胞あたりのGFFUは、対応する実験の設定で各B50細胞により生産される各々のrAAVCMVGFPを表す。
Ｃ．B50細胞中でAAVを生産するために、複製できるrAd-AAVハイブリッド使用の至適化
新規B50／ハイブリッド系により生産される最大収率のrAAVのための条件を至適化するために一連の実験を設定し、そしてもとのB50/ハイブリッド系と比較した。
【００６６】
B50/複製可能なハイブリッド感染系は、最初の実験でヘルパーウイルスの存在下にて生産されたrAAVCMVGFPの約1/3〜1/6を生産することができる。この表１にまとめるこのデータは、rAAV生産にB50/複製可能なAd-AAVハイブリッド感染系を使用することの可能性を示した。
【００６７】
【表１】
【００６８】
ここで与えるデータは、試験した実験条件下で、B50/複製可能Ad-AAVハイブリッド系がrAAVを生産できることを示唆している。しかし最大収率はB50細胞をAd5Wtヘルパーおよびハイブリッドで感染させた24時間間隔に比べて３〜６倍に低下した。単回感染系は、39.5℃に比べて32および37℃でより良く行われた。
【００６９】
我々はいったんB50細胞に入れば、複製できるAd-AAVハイブリッドは２つの可能な運命に直面すると仮定した：複製されるか、あるいはAVVレスキュー、複製およびパッケージングのためにRepタンパク質により無能にされる(crippled)かのいずれかである。この系を使用したrAAVの生産的感染は、両方向の微妙なバランスがとられるのだろう。我々はすでにB50/Adヘルパー/E1-欠失Ad-AAVハイブリッドによる高収率AVV生産には、Ad5 E1タンパク質により誘発されるRep/cap遺伝子発現間の重要な一時的関係、入ってくるAd-AAVハイブリッドの一時的な増幅、ハイブリッド骨格からのrAAVゲノムの分解（resolving）、そしてさらにAVVゲノムの複製があることを示した。Sub100r突然変異体に許容され得る温度は32℃であるが、そのよ うな温度感受性は37℃ではいくらか漏出性であり、しかし39.5℃では極めて緊縮である。我々は37℃で、sub100rAAVCMVGFPの複製は低下するが、Rep/cap、AAVレスキュー、複製およびパッケージングは最適であると予想した。このデータは、系が32℃よりも37℃で正により生産的であることを示した。しかし39.5℃でのAVVの生産性は鋭く低下した。この場合、おそらくハイブリッドは全く複製されなかった。さらに全細胞器官が高温度ストレス下にあり、rep/cap発現、AAVレスキュー、複製およびパッケージングの欠失をもたらした。
１．sub100rAAVCMVGFPに関する感染の最適多重度の決定
実施例２Ｂからのデータに基づき、低いMOIでのB50細胞の感染がAVVの生産に有利であると思われる。最初の実験からのデータに従い、生産温度32および37℃で、rAAVの収率はsub100rAAVCMVGFP感染のMOIが上昇するほど鋭く低下する。100pts/細胞と1000pts/細胞との間のAVV生産性において劇的な差異が存在することは、最大の生産性のための最適MOIがその範囲にあることを示唆している。最適なMOIを定めるために行った第２実験は、32および37℃の両方で20と1,000粒子(pt)/細胞の間のMOIの影響を調査することであった（表２）。したがってB50細胞を上記のように12ウェルプレートにまき、そしてsub100rAAVGFPの20、40、100、200、400および1000粒子で感染させた。粗細胞溶解物を調製し、そして細胞あたりのrAAVCMVGFP生産性について上記のようにアッセイした。
【００７０】
【表２】
【００７１】
結果から100または200pts/細胞のいずれかが32℃の感染には最適であることが明らかとなった。しかし37℃での状況は極めて異なり、ここでは最適MOIは200pts/細胞に厳しく限定された。MOIの２倍の増加または減少が、AVV生産性において60％の低下をもたらした。ここで、そしてこれまでの実験で観察されたAVV生産に対するMOIの影響は、AVV生産用のB50/ハイブリッド系の使用において、ハイブリッドの複製とrAAVパッケージングの間に微妙なバランスが達成されることが重要であることが証明された。アデノウイルスの複製過程は特に許容および半許容状態下では高度にMOI依存的であることは周知である。高いMOIでは、ハイブリッドウイルスの複製が優勢になるが、rAAVレスキュー、複製およびパッケージングは有意に低下するのが妥当と思われる。一方、限定されたハイブリッドウイルスの増幅は、レスキューおよびパッケージングに関するrAAVゲノムの数を増加させるために望ましい。これは表２に与える結果で明らかに示されている。32℃がsub100rAAVCMVGFPに許容され得るが、100と200pts/細胞との間に観察されるAVV収率について明らかな差異はなかった。MOIが400pts/細胞を越える時のみ、AVV収率は劇的に低下した。しかし感染が半許容温度の37℃で行われた時、最適なMOIは200pts/細胞のみに限定された。ここで限定され、そしてMOI依存的なハイブリッドウイルスの複製が、最大のAVVパッケージングに重要となる。
２．sub100rAAVGFPを用いた単回感染に最適温度の決定
最初の実験から、39.5℃では大変少量のAVVしか生産されないが、32および37℃でのAAV生産性は比較できるものであることが分かった。感染温度がAAV生産性に及ぼす影響を調査するために、上記のMOI実験を32および37℃で二重に行った。
【００７２】
表１および２に与えたデータは、最適MOIでAVV生産は32℃よりも37℃が良かったことをも示した。これはまた限定されたハイブリッドウイルスの複製とAVVレスキュー、複製およびパッケージングとの間にバランスが必要であることによっても説明することができた。明らかに半許容温度の37℃で、２つの異なる出来事の平衡はAVVパッケージングに向かって優先して移動し、より高い生産性を導いた。３．感染工程中の37から32℃への温度の切り替え
12ウェルプレート中のB50細胞は、細胞あたり100粒子のsub100rAAVCMVGFPで、37℃で36および60時間感染させた。次いでプレートを32℃に設定した別のインキューベーターに移動した。粗細胞溶解物は84-31細胞でのAAV生産性の滴定のために、感染後72、96、120、144および168時間に調製した。
【００７３】
この実験計画を裏付ける理論は、sub100rAAVCMVGFPウイルスが37℃では限定された複製を行うが、Rep/capタンパク質用のP5プロモーターの活性化は最適であるはずであるからである。37℃で24時間のインキューベーションにより、限定されたハイブリッドウイルスの複製レべルで開始さるRep/cap発現、そしてこれによりB50細胞をAVVレスキュー、複製およびパッケージングについて条件付けることを可能とする。いったん感染を32℃に切り替えると、ハイブリッドウイルスの複製も細胞中に蓄積したRepタンパク質の阻害効果により幾分遅くなるはずである。温度切り替え実験の結果(表３)が予想に反したのは、おそらくハイブリッドの複製とAVVレスキューおよび複製との間の最適なバランスが達成できなかったからであろう。しかしデータはより早い時期の温度の切り替えは、遅い切り替えよりも良い収率をもたらし、切り替えの時期がAVV生産に重要な役割を果たすことを示唆している。
【００７４】
【表３】
【００７５】
４．最初の感染から24時間後に、B50細胞に第２バッチのsub100rAAVCMVGFPの添加 12ウェルプレート中のB50細胞は、細胞あたり100粒子のsub100rAAVCMVGFPで、37℃で24時間感染させた。細胞あたり100粒子で第２バッチのsub100rAAVCMVGFPを37℃で加え、そして他の組を32℃に設定したインキューベーターに移動した。各条件下でのAVV生産は最初の感染後72、96、120、144および168時間で調査した。
【００７６】
古典的なB50/Ad5ヘルパー/E1-欠失Ad-AVVハイブリッド系では、第１Adヘルパーウイル感染と第２Ad-AVVハイブリッド感染との間に24時間の間隔を有することが必須である。２つの感染間のこの微妙な一時的関係は、高い収率のAVV生産のために、ハイブリッドウイル複製とAVVレスキューの適切な割合を調節するために、適切なレベルのRepタンパク質のような最適な細胞条件を作ることを可能とする。その場合、AdヘルパーウイルスとE1-欠失ハイブリッド感染との間の差異は、E1タンパク質の存在および不存在である。しかし複製できるAd-AVVハイブリッドをB50細胞中でAVV生産に使用する時、Adヘルパーウイルスとハイブリッドとの間にはそれらがすべての必要なヘルパー機能を提供する能力という意味で差異はない。細胞を２つのバッチのハイブリッドで24時間の間隔で感染させる場合、第１バッチは丁度Ad Wt感染のようにヘルパーとして役立ち、そして第２バッチは増幅、レスキューおよびパッケージングのためのrAAVゲノムを運ぶための丁度E1-欠失ハイブリッドとなるはずである。我々は850/複製可能なAd−AAVハイブリッド法のAAV生産性は、古典的なB50/ハイブリッド系のAAV生産性くらい高くなると予想した。実験から得られたデータは、我々の理論を正に支持していた(表４)。１つの種類のアデノウイルスだけをこの新しい生産法に使用したので、精製法は幾分簡略され、そしてスケールアップ工程も容易となる。さらにまた、我々はE4欠失のようなより一層重い突然変異をハイブリッド骨格に導入し、そして対応してAd遺伝子をB50細胞に安定に導入することができた。このように我々はハイブリッドウイルス自体を無能にするので、たとえAAV調製物に幾らかの欠損ハイブリッドが混入していても、そのような欠損ハイブリッドのインビボにおける副作用はさらに最小となるだろう。
【００７７】
【表４】
【００７８】
PCT/US99/05870および米国特許出願第09/404,555号明細書を含め上記に引用した技術文書は、引用により本明細書に編入する。本発明の多くの修飾および変更が上記の本明細書に含まれ、そして当業者には自明であると予想される。本発明の方法に対するそのような修飾および変更は、前記特許請求の範囲に包含されると考える。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 実施例２に記載するようなシャトルプラスミドpABrAAV-CMV-EGFPの生産の概略的説明である。
【図１Ｂ】 図１Ａのシャトルプラスミドと実施例２に記載するようなsub100rアデノウイルスとの間の相同的組換えによる複製できるrAd-AAVハイブリッドの生産の概略的説明である。
（技術分野）
発明の背景
アデノ−随伴ウイルス（AAV）は複製欠損性パルボウイルスであり、そのゲノムは約4.6kgの長さであり、145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ITRs）を含む。２つのオープンリーディングフレイムが一連のrepおよびcapポリペプチドをコードする。repポリペプチド(rep78、rep68、rep62およびrep40）はAAVゲノムの複製、レスキュー(rescue)および組込みに関与する。capタンパク質（VP1、VP2およびVP3）は、ビリオン キャプシドを形成する。5'および3'末端でrepおよびcapオープンリーディングフレイムを挟むのは、145bpの逆方向末端反復配列（ITRs）であり、その最初の125bpはY-またはT-形の二重構造を形成することができる。AAVベクターの開発に重要なことは、全repおよびcapドメインが切り出され、そして治療用またはレポーター導入遺伝子と交換できることである［B.J.Carter、「パルボウイルスのハンドブック」で、P.Tijsser編集、CRC出版、155〜168頁(1990)］。ITRsはAAVゲノムの複製、レスキュー、パッケージングおよび組込みに必要な最小配列を表すことが示された。
【０００２】
この非病原性のヒト ウイルスがヒトの細胞に感染した時、ウイルスゲノムは染色体19に組み込まれ、細胞の潜伏感染をもたらす。感染性ウイルスの生産およびウイルスの複製は、細胞をアデノウイルス（Ad）またはヘルペスウイルスのような溶菌性のヘルパーウイルスと混合感染(coinfected)しない限り起こらない。ヘルパーウイルスの感染で、AAVプロウルスはレスキューされ、そして増幅し、そしてAAVおよびヘルパーウイルスの両方が生産される。親のssDNSを感染することは、rep遺伝的様式で二重鎖複製形(RF)DNAへと広げられる。レスキューされたAAVゲノムは、形成されたタンパク質キャプシド（直径約20nmの正二十面体）にパッケージングされ、そして細胞の溶菌後に＋または-ssDNAゲノムのいずれかをパッケージングした感染性のビリオンとして放出される。
【０００３】
AAVは、外来DNA（例えば導入遺伝子）を細胞に運ぶためのベクターとして魅力的となる独自の特徴を有し、そして様々な群が疾患状態の処置にAAVを使用する可能性について研究された。本出願で使用するように、用語「導入遺伝子」は動物に送達されることが望まれるDNAを意味し、このDNAは非-AAV DNAである。しかし所望の導入遺伝子の状態でDNAを速達するために、形質導入ベクターとしてAAVを確立することに対する進展は、種々の理由から遅れた。
【０００４】
DNAの送達にAAVを使用するための１つの障害は、組換え体ゲノムのカプシド化（encapsidation）および感染性ビリオンの生産に関する高度に効率的なスキームがなかったことであった。R.Kotin,Hum.Gene Ther.,5:793-801(1994)を参照にされたい。この問題に取り組む１つの方法は、組換えAAV（rAAV）（これは送達すべきDNAを有するが、repおよびcap遺伝子を欠いている）を宿主細胞にトランスフェクションし、続いて野生型（wt）AAV（これはrepおよびcap遺伝子を供給する）およびアデノウイルス（これはrAAV生産に必要であると言われてきた少なくとも４つのアデノウイルス遺伝子；E1、E2、E4およびVAIを供給する）での混合感染が関与する［例えばCarter、同上、を参照にされたい］。しかしこの方法では混合感染が強制的であり、そして非-相同的組換えから生じる許容できない高レベルのwtAAVおよび生産されたrAAVへのwtAAVの混入を導く。他のウイルスまたはプラスミドの混入は、rAAVの精製を必要とする。混入wt AAVまたはヘルパーアデノウイルスの不存在下で細胞をrAAVとインキューベーションすると、わずかな組換え体の遺伝子発現しか生じない。
【０００５】
遺伝子療法のために形質導入AAVビリオンを製造するための広く認識されている手段には、２つの異なる相補する(complementing)プラスミドを用いたコ−トランスフェクション（co-transfection）が必要である。このようなプラスミドの１つは、２つのシスに作用するAAV ITRsの間に挟まれた治療用またはレポーター導入遺伝子を含む。子孫の組換え体ゲノムのレスキューおよびその後のパッケージングに必要なAAV成分は、repおよびcapタンパク質のウイルスオープンリーディングフレイムをコードする第２プラスミドによりトランスで提供される。この系では、Adヘルパー機能はwtアデノウイルスにより、またはHEK293細胞により供給される失ったE1遺伝子を持つ複製−欠損性アデノウイルスにより提供される。この方法の他の変更はすでに記載されている。例えば、米国特許第5,658,785号明細書（これはrAAVゲノムで、およびAAV repおよびcap遺伝子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、および宿主細胞をヘルパーウイルスで感染することによる生産法に関する）を参照にされたい。
【０００６】
米国特許第5,658,776号明細書は、AAVp5プロモーターがヘテロロガスなプロモーターにより置き換えられたAAVベクターをパッケージングするためのパッケージング系および方法に関する。あるいは米国特許第5,622,856号明細書は、ホモロガスなp5プロモーターがrep遺伝子の位置3'に移動し、場合によってはFRT配列でrep/cap遺伝子および再配置p5プロモーターを挟むAAVベクター生産用の構築物または方法に関する。
【０００７】
当該技術にはすでに記載された方法に存在する非効率、混入および精製の問題無しに、体細胞遺伝子療法用のベクターとして使用するためのAAVおよび組換えAAVウイルスの効率的な生産を可能とするさらなる組成物および方法の必要性が存在する。
発明の要約
本発明は、所望の導入遺伝子DNAを含むrAAVの効率的生産を可能とする。特に本発明は、rAAV生産中に混入する再集成されたwtAAVを生産する事なく、rAAVの生産を可能とする組成物および方法の両方を提供する。
【０００８】
１つの観点では、本発明は組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）ベクター、および選択細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とするために十分なアデノウイルス配列を含む、複製できる（replication-competent）ハイブリッドアデノウイルス／AAVウイルスを提供する。１つの態様では、ハイブリッドウイルスはハイブリッドウイルスがE4 ORF6機能に必要な配列を含むように、野生型アデノウイルスE3領域に機能的欠失を、かつ／またはE4領域に非−必須アデノウイルス配列の欠失を含む。
【０００９】
別の観点では、本発明は（ａ）複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス5'シス-要素；（ｂ）組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）ベクター；（ｃ）E3領域からのアデノウイルス配列の欠失；（ｄ）E1aおよびE1b遺伝子産物の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスE1aおよびアデノウイルスE1bをコードする核酸配列、ここで該E1aおよびE1b核酸配列はE3領域の部位に位置する；（ｅ）複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス3'シス-要素を含む、アデノウイルス／AAVハイブリッドウイルスを提供する。
【００１０】
別の観点では、混入するヘルパーウイルスまたは野生型ウイルスの不存在下で、組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）の生産法、この方法は複製できるrAd/AAVならびにAAV rep配列およびAAV cap配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る宿主細胞を培養する工程を含んで成る。適当にはこの方法はさらに、感染後のrAd/AAVハイブリッドの複製を制御する工程が含まれ、これによりrAAVの複製を強化する。好適な態様では、本発明の方法は複製できるrAd/AAVがパッケージングされるrAAV構築物およびすべての必要なアデノウイルス配列を提供し、使用するヘルパーウイルスが無く、しかも混入するwtウイルスに対する相同的組換えを可能とする十分なアデノウイルス配列が宿主細胞中に無いので、精製工程が簡略化される。
【００１１】
本発明の他の観点および利点は、以下の本発明の好適な態様の詳細な説明にさらに記載する。
発明の詳細な説明
I．E1 を発現するアデノウイルス /AAV ハイブリッドウイルス
本発明は、組換えアデノウイルス/AAV(rAd/AAV)ハイブリッドウイルスを提供し、ここでアデノウイルスはrAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物、および選択した宿主細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とする十分なアデノウイルス配列を含むように操作されている。好適な態様では、すべての必要なアデノウイルス遺伝子が、rAd/AAVハイブリッドウイルスにより提供され、これは野生型E3からアデノウイルス配列を失っていてよく、そしてアデノウイルス配列の非機能的欠失を含んでもよく、例えばハイブリッドウイルスはE4 ORF6機能を発現するために必要な配列を除くすべてのアデノウイルスのE4コード配列を失ってもよい。rAAV構築物はアデノウイルスのE3またはE1領域のいずれかに挿入され得る。場合によりE1遺伝子産物をコードする配列は、野生型E3領域に挿入され、そして発現される。別の態様では、本発明はE1遺伝子産物を発現しているが、宿主細胞により供給される１以上の他の必要なアデノウイルス配列（例えば、E2aおよび／またはE4 ORF6)は欠いているrAd/rAAVを提供する。以下に詳細に記載する本発明のハイブリッドウイルスは、AAV rep配列およびAAV cap配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含む宿主細胞中でのrAAVの発現に有用である。
Ａ．アデノウイルス遺伝子配列
本発明のrAd/rAAVハイブリッドウルスに使用する最小アデノウイルス配列は、アデノウイルスのシスに作用する逆方向末端反復（ITR）配列（これは複製起点として作用する）である。最も好適にはこのようなITR配列は、アデノウイルスの自然な5'および3'ITRを含む。しかし所望により、このような自然な配列に対する修飾も操作され得る。あるいはハイブリッドウイルスは異なる血清型のアデノウイルスに由来するITRsを含むように、あるいは２つの同一のITRsを含むように操作することもできる。またrAd/rAAVハイブリッドウイルスは、直線状のAdゲノムおよびE1プロモーターのエンハンサー要素をパッケージングするために必要な配列を含んでもよい。このような配列は自然なアデノウイルス5'パッケージング／エンハンサードメインにより都合よく提供され得る。さらにrAd/AAVハイブリッドウイルスは、選択された宿主細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とするために必要なアデノウイルスDNAを含む。
【００１２】
最小のアデノウイルスの機能に加えて、rAd/rAAVハイブリッドウイルスはさらなるアデノウイルス配列を含むことができる。最も好ましくはすべての必要なアデノウイルスの遺伝子産物、すなわちE1a、E1b、E2a、E2b、E4 ORF6、アデノウイルスの中期遺伝子IXおよびIXａ、およびアデノウイルスの後期遺伝子L1、L2、L3、L4およびL5が、ハイブリッドウイルスから発現される。アデノウイルス配列は１以上の野生型アデノウイルスまたは突然変異体アデノウイルスから誘導してもよい。
【００１３】
本発明に有用なアデノウイルス遺伝子をコードするDNA配列は、現在同定されている46のヒト型［例えば、Horwitz、同上およびアメリカン タイプ カルチャー コレクションを参照にされたい］を含む１以上のアデノウイルス型の中から選択することができる。同様に他の動物を感染させることが知られているアデノウイルスは、遺伝子配列を供給することができる。各E1およびE2a遺伝子配列の選択が本発明を限定することはない。Ad5型の血清型を含め多数のアデノウイルス血清型に関する配列は、ジーンバンクから入手可能である。種々のアデノウイルス株は、バージニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手でき、あるいは様々な工業用および研究用提供元から入手することができる。以下の実施例の態様では、E1およびE2a遺伝子配列は５型のアデノウイルス血清型（Ad5）に由来するものである。
【００１４】
本発明で使用するように「遺伝子産物を発現するDNA」とは、任意の核酸配列、それらの遺伝子産物または任意の機能的部分を意味する。同様に、核酸配列（例えば遺伝子）またはそれらの機能的部分の任意の対立遺伝子または他の修飾を含む。本発明で定めるように、「機能的部分または機能的フラグメント」とは、必要な所望する機能を提供するために必要なコード配列または遺伝子産物の領域である。そのような修飾は幾つかの様式で、ならびに自然に生じるそれらの対立遺伝子変異により遺伝子産物（１つまたは複数）の機能を強化するための通例の遺伝子操作または突然変異誘発法の手段により計画的に導入することができる。「機能的欠失」とは、その領域の機能を提供するために必要な配列を欠くコード配列または遺伝子産物の領域を称する。用語「機能的欠失」とは、領域の機能が排除されることを意味するとは限らない。領域またはそれらのフラグメントの切り出しは必要ではない。
【００１５】
好適な態様では、本発明のrAd/AAVハイブリッドウイルスはアデノウイルスのE3遺伝子産物をコードする配列を欠き、すなわちヘテロロガスな配列を複製および感染には必須ではない自然なE3領域に挿入することを可能とする。そのようなヘテロロガスな配列はアデノウイルスには自然ではない任意の核酸配列、または同じアデノウイルスの非連続領域からの任意の核酸配列でよい。同様に、rAd/AAVハイブリッドウイルスは、必須なE4 ORF6を除きアデノウイルスE4コード配列を欠いてもよい。適当にはrAd/AAVハイブリッドウイルスは、自然なアデノウイルスゲノムのサイズの105％を越えないように操作される（例えば36kbの105％)。すなわち所望するヘテロロガス配列の挿入を望む場合、rAd/AAVはハイブリッドが操作されるアデノウイルス（１つまたは複数）に対して野生型の配列の他の非機能的欠失を含むように操作することができる。そのような非機能的欠失は、ハイブリッドウイルスがハイブリッドウイルスの複製に必要な機能的遺伝子産物を発現する能力を消さない欠失を含む。E4 ORF6配列を除くすべてのアデノウイルスE4コード配列の欠失は、非機能的欠失の例である。他の適当な非機能的欠失も、容易に設計することができる。
【００１６】
すなわち、特に望ましい態様では、rAd/AAVハイブリッドウイルスの複製に必要なすべてのアデノウイルス遺伝子は、ハイブリッドウイルス自体により提供される。そのようなハイブリッドウイルスはビリオン中にパッケージングされるrAAV構築物を含み、アデノウイルスのE3をコードするアデノウイルス配列を欠き、そしてE4 ORF6機能を除くすべてのアデノウイルスE4コード配列を欠く。場合により、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子産物は、野生型E1領域以外の領域から発現されてもよく、例えばこのような遺伝子産物は野生型E3領域に挿入され、そして発現される。
【００１７】
別の態様では、本発明のrAd/AAVは複製に必要な１以上の他のアデノウイルス遺伝子を欠いている。ハイブリッドウイルスから欠失した必要なアデノウイルスの遺伝子産物は、選択したパッケージング細胞による生産プロセスで、または所望の遺伝子産物の発現を支配する核酸配列によりトランスに供給され得る。好ましくはrAd/AAVはE1aおよびE1b遺伝子産物を発現する。１例では、rAd/AAVハイブリッドウイルスは野生型E1機能を含むが、E4 ORF6の発現に必要な配列を欠く。この状況では、rAd/AAVハイブリッドがE4 ORF6の発現に必要な配列を含む宿主細胞に導入される。別の例では、rAd/AAVハイブリッドウイルスは、rAAVの生産に使用される宿主細胞中で機能を発現するE2aの発現に必要な配列を欠く。そのような宿主細胞を以下に詳細に説明する。
【００１８】
本発明の範囲内にあるこれらのおよび他のrAd/AAVハイブリッドウイルスの設計は、発現を促進するために目的遺伝子に操作可能に連結された適当な配列を含む。「操作可能に連結された」配列は、目的遺伝子と連続する発現制御配列およびトランスにまたは目的遺伝子の制御に対して遠くで作用する発現制御配列の両方を含む。そのような発現制御配列を導入遺伝子と関連して詳細に検討する。各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然のプロモーター（すなわちプロモーターはアデノウイルス遺伝子の5'フランキング領域と自然に結合しているものでよい）から独立して選択することができる。プロモーターは生物または細胞の特別な生理状態（すなわち分化状態により、または複製もしくは静止細胞中で）により、あるいは例えば外から加えた因子により調節することができる。選択したプロモーターは、同一でも異なっていてもよい。
【００１９】
１つの態様では、E1a遺伝子（そして続いてE1b遺伝子）は、構成的プロモーター、限定するわけではないがRSV LTRプロモーター／エンハンサー、CMV前初期プロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸シダクターゼプロモーター、細胞質β-アクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーターの制御下で発現される。
【００２０】
別の態様では、過剰に蓄積すると細胞に傷害性となり得るE1aおよびE1b遺伝子産物の細胞の生産の量および時期を制御するように、誘導性プロモーターがE1遺伝子産物を発現するために使用される［例えば、William S.M.Wold,J.Cell Biochem.,53:329-335(1993):J.Nevins,Current Opinion in Genetics and Decelopment,4:130-134(1994);E.Harrington et al.,Current Opinion in Genetics and Decelopment,4:120-129(1994);G.Evan et al.,Current Opinion in Cell Biology,7:825-834(1995);J.Nevins,Science,258:424(1992)を参照にされたい］。誘導性プロモーターは、当該技術分野で既知の、および上記で検討したプロモーターを含み、限定するわけではないが亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；T7プロモーター；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン-抑制系；テトラサイクリン-誘導系；RU486-誘導系；およびラパマイシン-誘導系を含む。強力に調節され、そして高レベルのE1発現を提供する任意の種類の誘導性プロモーターを使用できる。この内容において有用である他の種類の誘導性プロモーターは、特別な生理的状態、例えば温度、急性期、細胞の特別な分化状態、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターである。
Ｂ．組換えAAVに構築物
rAd/AAVウイルスでは、AAV配列を自然なアデノウイルス配列が欠失している領域のアデノウイルス骨格に導入し、そしてこれらを選択したアデノウイルス配列により挟む。AAV配列は典型的には本発明の方法に従いrAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物（例えばカセット）の状態である。rAAV構築物は最小の（5'から3'への)5'AAV ITR配列、選択したプロモーターおよび他の通例のベクター調節成分の制御下の選択した導入遺伝子、および3'AAV ITR配列を含む。このようなrAAV構築物の各成分を以下に検討する。また米国特許第5,856,152号および同第5,871,982号明細書も参照にされたい。当業者はrAAV構築物を所望のアデノウイルス領域に挿入するように、rAd/AAV ハイブリッドウイルスを容易に操作することができる。１つの態様では、rAAV構築物はrAd/AAV ハイブリッドウイルスのアデノウイルスE3領域に位置する。別の適当な態様では、rAAV構築物はrAd/AAV ハイブリッドウイルスのアデノウイルスE1領域に位置する。しかし本発明はこのような例示する態様に限定されない。
１．AAV配列
使用するAAV配列は、好ましくはシスに作用する5'および3'逆方向末端反復配列である［例えばB.J.Carter、「パルボウイルスのハンドブック（Handbook of Parvoviruses）」、P.Tijsser編集、CRC出版、155〜168頁(1990)を参照にされたい］。ITR配列は約145bpの長さである。好ましくはITRsをコードする実質的に全配列が分子中で使用されるが、このような配列のわずかな程度の修飾は許容され得る。このようなITR配列を修飾する能力は、当業者の技術的範囲内である。［例えば、Sambrook et al.「モレキュラークローニング。ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1989)のようなテキスト；Carter et al.、同上；およびK.Fisher et al.,J.Virol.,70:520-532(1996)を参照にされたい］。本発明で使用するそのような分子の例は、導入遺伝子を含む「シスに作用する」プラスミドであり、ここで選択した導入遺伝子配列および付随する調節要素は5'および3'AAV ITR配列により挟まれている。
【００２１】
AAV ITR配列は、現在同定されているヒトAAV型を含め任意の既知のAAVから得ることができる。同様に、他の動物を感染させることが知られているAAV も、本発明の分子または構築物で使用するこれらのITRsを提供することができる。例えばITRsは１型AAV、２型AAV、３型AAV、４型AAV、５型AAV、６型AAV、他の血清型のAAVまたはデンソウイルスにより提供され得る。種々のAAV株がアメリカン タイプ カルチャー コレクションから入手することができ、あるいは様々な工業用および研究用の提供源から入手することができる。以下の例示的態様では、AAV-2が便宜的に使用されている。しかしこのような配列を提供するAAVの種および血清型の選択は、本出願の教示に従い当業者の技術範囲内であり、そして以下の発明を限定することはない。
２．導入遺伝子
本発明に従い、rAAV構築物は所望の導入遺伝子、プロモーターおよび宿主細胞中でAAV配列により挟まれた導入遺伝子の発現を制御そして支配する他の調節要素を含む。導入遺伝子配列はAAV配列に対してヘテロロガスな核酸配列であり、導入遺伝子が目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする。導入遺伝子配列の組成物は、生成するrAAVの意図する用途に依存する。例えば導入遺伝子配列の１種はレポーターまたはマーカー配列を含んで成り、これは発現で検出可能なシグナルを生成する。そのようなレポーターまたはマーカー配列は、限定するわけではないがβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ（LacZ)、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色の蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、例えばCD2、CD4、CD8を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質および当該技術分野で周知の他の配列を含み、これらに向けられる高親和性抗体が存在するか、または日常的に作成されることができ、そして融合タンパク質は中でも赤血球凝集素またはMycに由来する抗原標識ドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んで成る。
【００２２】
このような配列は、発現を駆動する調節配列と結合した時、酵素的、ラジオグラフィー的、発色的、蛍光的または他の分光的アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイおよびELISA、RIAおよび免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば導入遺伝子がLacZ遺伝子である場合、rAAVの存在はベータ−ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。同様に導入遺伝子がルシフェラーゼである場合、rAAVはルミノメーター中での光生産により測定することができる。
【００２３】
しかし望ましくは導入遺伝子は、この方法により生産されるrAAVを介して細胞または動物に送達され得る非−マーカー遺伝子である。導入遺伝子は、タンパク質、アンチセンス核酸（例えばRNA）、または触媒的RNAのような生物学的および医学的に有用な広範な種類の遺伝子産物から選択することができる。本発明は遺伝子欠失を矯正または改善するために使用することができ、ここで正常な遺伝子が発現されるが、正常レベルよりは低く、そして機能的遺伝子産物が発現されない遺伝的欠陥を矯正または改善するために使用することができる。好適な種類の導入遺伝子配列は、宿主細胞中で所望の遺伝子産物を発現する治療用遺伝子である。このような治療用核酸配列は典型的には発現すると遺伝的または非−遺伝的欠陥を矯正または相補することができるか、あるいは後成的な障害または疾患を処置することができる産物をコードする。しかし選択した導入遺伝子は研究のために望ましい任意の産物をコードすることもできる。この導入遺伝子の選択は本発明を限定しない。導入遺伝子配列の選択は本出願の教示に従い、当業者の技術的範囲内にある。
【００２４】
また本発明は、マルチ−サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝子欠陥を矯正または改善するために使用することができるrAAVの製造法を含む。特定の状況では、異なる導入遺伝子を使用してタンパク質の各サブユニットをコードすることができる。これはタンパク質のサブユニットをコードするDNAのサイズが大きい時、例えば免疫グロブリンまたは血小板由来増殖因子レセプターの時に望ましい。細胞がマルチ−サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞は異なるサブユニットの各々を含有するrAAVに感染しなければならない。あるいはタンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によりコードされ得る。この場合、１つの導入遺伝子が各サブユニットをそれぞれコードするDNAを含み、各サブユニットのDNAはインターナルリボゾームエントリーサイト（internal ribosome entry site：IRES）により分けられている。これはサブユニットをコードする全DNAおよびIRESが５キロベースよりも小さくなるように、各サブユニットをコードするDNAサイズが小さい時に望ましい。
【００２５】
有用な遺伝子産物は、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（GH）、副甲状腺ホルモン（PTH）、成長ホルモン放出因子（GRF）、濾胞刺激ホルモン（FSH）、黄体ホルモン（LH）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（hCG）、血管内皮増殖因子（VEGF）、アンギオポイエチン（angiopoietin）、アンギオスタチン（angiostatin）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、エリスロポイエチン（EPO）、結合組織増殖因子（CTGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォーミング増殖因子α（TGFα）、血小板由来増殖因子（PDGF）、インスリン−様増殖因子IおよびII（IGF-IおよびIGF-II）、TGFβ、アクチビン、インヒビンを含んで成る任意のトランスフォーミング増殖因子β(TGFβ）スーパーファミリー、あるいは骨形態形成タンパク質（BMP)BMPs1-15、増殖因子のヒグレリン／ニューレグリン／ARIA／neu分化因子（NDF）ファミリーの任意の１つ、神経成長因子（NGF）、脳−由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン NT-3およびNT-4/5，毛様体神経栄養因子（CNTF）、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）、ノルトリン（neurturin）、アグリン（agrin）、セマホリン（semaphorin)／コラプシンのファミリーの任意の１つ、ネトリン-1およびネトリン-2、肝細胞増殖因子（HGF）、エファリン（ephrin）、ノギン、ソニック ヘッジホックおよびチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび成長および分化因子を含む。
【００２６】
他の有用な産物は免疫系を調節するタンパク質を含み、限定するわけではないが、トロンボポイエチン（TPO)、インターロイキン（IL) IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16およびIL-17、単球ケモアトラクタント（chemoattractant)タンパク質（MCP-1）、白血病抑制因子（LIF）、顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）、Fas-リガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ（TNFαおよびTNFβ）、インターフェロン（INF）INF-α、INF-βおよびINF-γ、幹細胞因子、flk-2/flk-3のようなサトカインおよびリンホカインを含む。免疫系により生産される遺伝子産物も本発明に包含する。これらには限定するわけではないが、免疫グロブリン IgG、IgM、IgA、IgM、IgDおよびIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスIおよびクラスII MHC分子ならびに単鎖MHC分子を含む操作されたMHC分子を含む。遺伝子産物の用途には、補体調節タンパク質、膜コファクタータンパク質（MCP）、崩壊促進因子（DAF）、CR1、CR2およびCD59のような補体調節タンパク質を含む。
【００２７】
さらに別の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本発明はコレステロール調節のレセプターを包含し、LDLレセプター、HDLレセプター、VLLDレセプターおよびスカベンジャーレセプターを含む。また本発明は、ステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーのような遺伝子産物を包含し、グルココルチコイドレセプターおよびエストラゲンレセプター、ビタミンＤレセプターおよび他の核レセプターを含む。さらに有用な遺伝子産物は、jun、fos、max、mad、血清応答因子（SRF）、AP-1、AP-2、myb、MRG1、CREM、Alx4、FREAC1、NF-κB、ロイシン ジッパータンパク質の員、Zif268、EGR1、EGR2を含むC2H4ジンクフィンガータンパク質、グルココルチコイドおよびエストロゲンレセプターのようなC6ジンクフィンガータンパク質、Pit1により例示されるPOUドメインタンパク質、HOX-1を含むホモドメインタンパク質、myc、MyoDおよびミオゲニンを含む塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質、EST-ボックスを含むタンパク質、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNG-4、C/EBP、SP1、CCAAT-ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（IRF-1)、Wilms腫瘍タンパク質、EST-結合タンパク質、STAT、GATA-ボックス結合タンパク質、例えばGATA-3、およびウイング（winged）ヘリックスタンパク質のフークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【００２８】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル シンセターゼI、オルニチン トランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネート シンセターゼ、アルギノスクシネート リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニン ヒドロキシラーゼ、アルファ-１ アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、低密度−リポタンパク質レセプター、ポルホビリノーゲン デアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオン ベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-CoA デヒドロゲナーゼ、プロピオニル CoA カルボキシラーゼ、メチル マロニル CoA ムターゼ、グルタリル CoA デヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン デカルボキシラーゼ（P-プロテインとも言われている）、H-プロテイン、T-プロテイン、メンケス病タンパク質、腫瘍抑制物質（例えばp53）、のう胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター（CFTR）、およびウィルソン病遺伝子PEDを含む。
【００２９】
他の有用な導入遺伝子は、自然には存在しないキメラまたはハイブリッドポリペプチドのようなポリペプチド、または挿入、欠失またはアミノ酸置換を含む自然には存在しないアミノ酸配列を含む。例えば単鎖の操作した免疫グロブリンは、ある種の免疫抑制患者には有用となることができる。他の種類の自然には存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子およびリボザイムのような触媒的核酸、これは遺伝子の過剰発現を下げることができる。
【００３０】
哺乳動物細胞および宿主中で発現するための導入遺伝子の設計は、発現を促進するために目的遺伝子に操作可能に連結された適当な配列を含むべきである。発現制御配列は、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニレーションシグナルのような効率的なRNAプロセッシング シグナル；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザックのコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および所望する時には、タンパク質の分泌を強化する配列を含む。莫大な数の発現制御配列（天然の、構成的、誘導性および／または組織-特異的）が当該技術分野では知られており、そして所望する発現の種類に依存して導入遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。真核細胞には、発現制御配列は典型的にはプロモーター、エンハンサー（免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等から誘導されるようなもの）、およびスプライスドナーおよびアクセプター部位を含むポリアデニレーション配列を含む。ポリアデニレーション配列は一般に導入遺伝子配列の後、そして3'AAV ITR配列の前に挿入される。本発明に有用なrAAV構築物は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に配置されたイントロンも含む。１つの可能なイントロン配列もSV40に由来し、そしてSV-40 Tイントロン配列と称する。使用できる別のベクター要素は、インターナル リボザイム エントリー サイト（IRES）である。IRES配列は１つの遺伝子転写物から１以上のポリペプチドを生成するために使用される。IRES配列は１以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使用される。このようなおよび他の通例のベクター要素の選択は常法であり、そして多くのそのような配列が入手可能である［例えば、Sambrook et al.,およびそこに引用されている文献、例えば第3.18-3.26および16.17-16.27頁およびAusebel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1989を参照にされたい］。
【００３１】
１つの態様では、高レベルの構成的発現が望ましい。そのようなプロモーターの例は、限定するわけではないがレトロウイルス ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター／エンハンサー、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター／エンハンサー［例えば、Boshart et al.,Cell.41:521-530(1985)］、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸シダクターゼプロモーター、細胞質β-アクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーターを含む。
【００３２】
別の態様では、誘導性プロモーターが望ましい。誘導性プロモーターは外部から供給される化合物により調節されるプロモーターであり、限定するわけではないが亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；T7ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第98/10088号明細書］；エクジソン昆虫プロモーター［No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)］；テトラサイクリン-抑制系［Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)］；テトラサイクリン-誘導系［Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)；ならびにまたHavey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1988)を参照にされたい］；RU486-誘導系［Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)およびWang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997)］；およびラパマイシン-誘導系［Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997)］を含む。この内容において有用である他の種類の誘導性プロモーターは、特別な生理的状態、例えば温度、急性期、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターである。好適な態様では導入遺伝子はP5天然AAVプロモーターの制御下である。
【００３３】
別の態様では、導入遺伝子に天然のプロモーターが使用される。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が自然な発現を模倣するべき時に望ましい。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的または発育的に、あるいは組織−特異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用できる。さらなる態様では、エンハンサー要素、ポリアデニレーション部位またはコザックのコンセンサス配列のような別の天然の発現制御要素も自然な発現を模倣するために使用することができる。
【００３４】
導入遺伝子の別の態様は、組織−特異的プロモーターに操作可能に結合した導入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現を所望する場合、筋肉中で活性なプロモーターを使用するべきである。これらには、骨格筋α-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成の筋肉プロモーター［Li et al.,Nat.Biotech.17:241-245(1999)］を含む。組織−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓について［アルブミン、Miyatake et al.,J.Virol.,71:5124-32(1997)；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；アルファ-フェトプロテイン(AFP)、Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996)］、骨について［オステオカルシン、Stein et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-86(1997)；骨のシアロプロテイン、Chen et al.,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996)］、リンパ球について［CD2、Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖］、ニューロンについて［ニューロン−特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター、Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991)；ニューロン-特異的vgf遺伝子、Piccioli et al.,Neuron,15:373-84(1995)］知られている。
【００３５】
もちろん、すべてのベクターおよび発現制御配列が本発明のすべての導入遺伝子を発現させるために等しくよく機能するわけではない。しかし当業者は、本発明から逸脱することなくこのような発現制御配列の中から選択することができる。適当なプロモーター／エンハンサー配列は、本出願により提供される手引きを使用して、当業者により選択され得る。そのような選択は日常的な事柄であり、分子または構築物を限定しない。例えば目的の導入遺伝子に操作可能に連結された１以上の発現制御配列を選択し、そして発現制御配列および導入遺伝子を含んで成る「ミニ遺伝子」をAAVベクターに挿入することができる。本出願で教示する、または当該技術で教示するようにrAAVをパッケージングする１方法に従った後、インビトロまたはインビボで適当な細胞を感染させることができる。細胞中の導入遺伝子のコピー数は、サザンブロッティングまたは定量的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりモニターすることができ；RNA発現のレベルはノーザンブロッティングまたは定量的な逆転写酵素(RT)-PCRによりモニターすることができ：そしてタンパク質発現のレベルはウエスタンブロッティング、免疫組織化学、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、放射性免疫アッセイ（RIA）または導入遺伝子の遺伝子産物の生物活性の試験によりモニターすることができる。すなわち特定の発現制御配列が特別な導入遺伝子に適当であるかどうかを容易にアッセイし、そして所望の導入遺伝子の発現に最も適当な発現制御配列を選択することができる。
Ｃ．rAd/AAV ハイブリッド ウイルスの生産
本発明のrAd/AAV ハイブリッド ウイルスは、本明細書に記載し、ならびに当業者に既知である材料および方法を使用して構築し、そして生産することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用するそのような操作法は、核酸操作の当業者には既知であり、そして遺伝子操作、組換え工学および合成技法を含む。例えばSambrook et al.,and Ausubel、同上；および国際特許出願公開第95/13598号明細書を参照にされたい。さらにアデノウイルスのカプシド中にrAAVカセットを生産するために適する方法は、米国特許第5,856,152号および同第5,871,982号明細書に記載された。
【００３６】
本発明のrAd/AAV ハイブリッド ウイルスは複製できるので、当業者により知られ、そして本明細書中に記載した技法を使用して、選択した宿主細胞中で感染および複製により生産することができる。例えば米国特許第5,856,152号および同第5,871,982号明細書、および以下の第II部に記載するrAd/AAVを用いた宿主細胞の感染および培養法の検討を参照にされたい。
II．rAAV の生産
本発明の方法は、複製できるrAd/AAVを使用してrAAVの生産を提供する。特に好適な態様では、本発明の方法で使用するrAd/AAVはrAAVカセットおよび宿主細胞に対してすべての必要なアデノウイルス配列を提供し、すなわちヘルパーウイルスを用いた第２感染またはトランスフェクションの必要性を回避する。最も適当にはrAd/AAVハイブリッドウイルスは、ハイブリッドウイルスの複製に必要なすべてのアデノウイルス遺伝子産物がrAd/AAVハイブリッドウイルスにより発現されるように、本明細書に記載するように操作される。
【００３７】
簡単に説明すると、選択した宿主細胞をrAd/AAVハイブリッドウイルスで感染させる。いったんrAd/AAVハイブリッドウイルスが細胞に取り込まれると、AAV ITRにより挟まれた導入遺伝子は、好ましくは宿主パッケージング細胞中に存在するAAV rep遺伝子を感染した細胞に供給することにより、アデノウイルス骨格からレスキューされなければならない。組換えAAVゲノムは、好ましくは宿主パッケージング細胞中に存在するAAV cap遺伝子を感染した細胞に供給することによりパッケージングされる。
【００３８】
rAAVの生産に使用するrAd/AAVにかかわらず、本発明の方法はrAAVの最適な生産に重要である、宿主細胞の感染後の選択した時期に、rAd/AAVが複製する能力を制御する（すなわち、抑制または消失）工程を含む。この工程はrAd/AAVにより運ばれるrAAV構築物がレスキューされ、そしてrAAVビリオンにパッケージングされる能力を強化する。これは種々の手段により達成され、これを本明細書でより詳細に記載する。
Ａ．AAV RepおよびCap配列
rAd/AAVハイブリッドにより提供されるrAAV構築物をrAAVビリオンにパッケージングするために、宿主細胞はAAV repおよびAAV capまたはそれらの機能的フラグメントを発現するために必要な配列を含まなければならない。例えばrep78/52タンパク質は、必要なrep機能を提供するために十分であり得る。AAVrepおよびcap配列は、上記で確認されたAAV供給源から得られる。AAV repおよびcap配列は限定するわけではないがトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む上記のような当業者に既知の様式で宿主細胞に導入することができる。１つの態様では、repおよびcap配列は１以上の核酸分子により宿主細胞中にトランスフェクトされ、そしてエピソームとして細胞中で安定に存在し得る。別の態様では、repおよびcap配列は細胞のゲノムに安定に組み込まれる。repおよびcapを含む適当な宿主細胞は、PCT/US98/19463に記載されたB-50である。別の態様は、宿主細胞で一時的に発現されるrepおよびcap配列を有する。例えばそのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、5'から3'へ、プロモーター、場合によりプロモーターとrep遺伝子配列の開始部位との間に挿入されたスペーサー、AAV rep遺伝子配列、およびcap遺伝子配列を含んで成る。
【００３９】
repおよびcap配列はそれらの発現制御配列と一緒に、１つのベクターで供給されることができ、あるいは各々の配列をそれ自体のベクターで供給してもよい。好ましくはrepおよびcap配列は同じベクターで供給される。あるいはrepおよびcap配列は、宿主細胞に導入される他のDNA配列を含むベクターで供給することができる。
【００４０】
好ましくはこの構築物中で使用するプロモーターは、当業者に既知であるか、または上記のような任意の構成的、誘導性または天然のプロモーターである。好適な態様では、AAV P5プロモーター配列が使用される。これは任意の上記AAV源から得ることができるが、パルボウイルスP5プロモーターは好ましくはrepおよびcap遺伝子配列を提供するAAV血清型に相同的である。あるいはプロモーターはrepおよびcap配列を提供する型とは別のAAV型に由来するP5プロモーターでよい。ヒトまたは他の動物に感染することが知られているAAVも、P5プロモーターを提供することができる。任意のこのような配列を提供するためのAAVの選択は、本発明を限定しない。
【００４１】
別の好適な態様では、rep用のプロモーターは誘導性プロモーターである。上記に検討したように、誘導性プロモーターには限定するわけではないが、メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；T7ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン-抑制系；テトラサイクリン-誘導系；RU486-誘導系；およびラパマイシン-誘導系を含む。rep発現に好適なプロモーターはT7プロモーターである。T7プロモーターにより調節されるrep遺伝子およびcap遺伝子を含んで成るベクターを、構成的または誘導的にT7ポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクトまたは形質転換する。1998年3月12日さ公開された国際公開第98/10088号明細書を参照にされたい。
【００４２】
スペーサーはベクターの設計において任意の要素である。スペーサーはプロモーターとrep遺伝子ATG開始部位との間に挿入されたDNA配列である。スペーサーは所望の設計を有してよく；すなわちスペーサーはヌクレオチドの無作為な配列であるか、あるいはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは、開始／停止およびポリＡ部位を典型的に取り込む遺伝子を含むことができる。スペーサーは原核または真核生物に由来する非−コードDNA配列、反復非コード反復、転写制御が無いコード配列または転写制御を含むコード配列であることができる。２つのスペーサー配列の供給源の例は、λファージ ラダー配列または酵母ラダー配列であり、これらは中でも例えばギブコ（Gibco）またはインビトロゲン（Imvitrogen）から販売にれている。スペーサーはrep78およびrep68遺伝子産物の発現を下げ、rep52、rep40およびcap遺伝子の発現は正常レベルに残すために十分な任意のサイズであることができる。したがってスペーサーの長さは約10bpから約10.0kbp、好ましくは約100bpから約8.0kbpの範囲である。組換えの可能性を下げるために、スペーサーの長さは好ましくは２kbp未満であり；しかし本発明のそのように限定されない。
【００４３】
AAV repおよびcapタンパク質を提供する分子の例は、プラスミド、例えばpMT-Rep/Cap、pP5-Rep/CapおよびpMMTV-Rep/Capである。このようなプラスミドはそれぞれ、ネオマイシン選択マーカー遺伝子を含み、そしてそれらの天然のP5プロモーター(pP5-Rep/Cap)、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオニンプロモーター（pMTRRep/Cap)、あるいはデキサメタゾン(Dex)-誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター(pMMTV-Rep/Cap)のいずれかにより駆動されるAAV rep/cap遺伝子を発現する。このようなタンパク質は種々の手段により細胞に提供され得るが、本発明の方法の例には様々なプラスミドの使用を含む。プラスミドpMT-Rep/Capの構築には、ORF6配列をpMTE4ORF6プラスミド［G.P.Geo et al.,J.Virol.,70:8934-8943(1996)]からBamHI消化により取り出し、そして鋳型としてpSub201プラスミド［Samulski,R.J.et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)]を使用したPCR増幅により調製した4.1kbrep/capフラグメントと置き換えた。プラスミドpMMTV-Rep/CapはpMT-Rep/Capの構築と同様に構築したが、pMMTVEORF6プラスミド［Geo et al.，同上］をベクター骨格として使用した。P5-Rep/Capの構築には、MTプロモーターおよびORF6配列をpMTEORF6プラスミド［G.P.Geo et al.,J.Virol.,70:8934-8943(1996)]からEcoRI/BamHI消化により取り出し、そしてXbaI消化によりpSub201プラスミド［Samulski,R.J.et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)]から単離した4.3kbのP5 Rep/Capフラグメントと置き換えた。プラスミドの構築には、Sambrook et al.,同上に記載されているような通例の遺伝子工学法が含まれた。すべての上記に引用した参考文献は本明細書に編入する。
【００４４】
repおよびcapタンパク質を提供する様々な他のプラスミド構築物が当該技術分野では知られており、そして本発明の宿主細胞に使用することができる。例えば、rep/cap構築物は、上記の構築物において言うようなプロモーターとrep/cap遺伝子との間のスペーサーを省略してもよい。P5プロモーターをrep/cap遺伝子に対して3'に配置する米国特許第5,622,856号明細書に記載されているような当該技術における他の構築物も、本内容において使用することができる。
【００４５】
repおよびcapタンパク質を提供する分子は、このような成分を宿主細胞に移す任意の形態でよい。本明細書中に例示するように、この分子は好ましくはマーカー遺伝子のような他の非−ウイルス配列を含むことができるプラスミドの形態である。この分子はAAV IRTを含み、そして一般にはAAVパッケージング配列は含まない。相同的組換えが起こることを回避するために、他のウイルス配列、特にアデノウイルス配列はこのプラスミドでは避けられる。このプラスミドは望ましくは細胞に安定にトランスフェクトされ得るように構築される。
【００４６】
repおよびcapを提供する分子は宿主細胞に一時的にトランスフェクトされ得るが、宿主細胞は例えばエプソームとして、または宿主細胞の染色体への組込みにより宿主細胞中で機能的rep/capタンパク質を発現するために必要な配列で安定に形質転換されることが好ましい。そのような安定にトランスフェクトした宿主細胞の発現を制御するプロモーターに依存して、rep/capタンパク質は一時的に発現され得る（例えば誘導性プロモーターの使用を通して）。
【００４７】
本発明の態様を構成するために使用する方法は、上記参考文献に記載されているような通例の遺伝子工学または組換え工学法である。この明細書は特別な構築物の具体的な説明例を提供するが、本明細書に提供される情報を使用して、当業者はスペーサー、P5プロモーターおよび少なくとも１つの翻訳開始および停止シグナル、ならびに任意のポリアデニレーション部位の最適な付加を含む他の要素の選択を使用して、他の適当な構築物を選択し、そして設計することができる。
Ｂ．宿主細胞
哺乳動物の宿主細胞自体は、限定するわけではないがヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するA549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293細胞（これは機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Saos、C2C12、Ｌ細胞、HT1080、HepG2および初代繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のようなヒトの細胞型のような任意の哺乳動物種から選択することができる。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず；あるいは哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等をも限定しない。使用する細胞に関する要件は、rAAVの生産中に混入するウイルスの相同的組換えをもたらすことができるウイルス遺伝子を運んではならないということであり；そしてDNAのトランスフェクションおよびトランスフェクトしたDNAの発現が可能でなければならないということである。
【００４８】
好適な態様では、宿主細胞はB50細胞系のような細胞中に安定にトランスフェクトされたrepおよびcapを有するものである。米国特許第5,658,785号明細書に記載されているような他の安定なrep/cap発現細胞系も同様に使用することができる。別の適当な態様では、宿主細胞はハイブリッドウイルスが無いrAd/AAVハイブリッドウイルスの複製に必要な任意のアデノウイルス遺伝子産物を発現するために必要な配列で安定にトランスフェクトされる。
【００４９】
例えばrAd/AAVハイブリッドウイルスがアデノウイルスのE4 ORF6配列を欠く場合、選択した細胞系はE4 ORF6タンパク質の発現に必要な配列で安定にトランスフェクトされるように操作する。そのような場合、細胞系は好ましくはrep/capの発現のための配列を含むものである。rAd/AAVによる細胞の感染後、ハイブリッドウイルスにより発現されたE1aおよびE1b機能が宿主細胞によるrep/cap機能の発現を始めさせる。その後E4 ORF6発現は、望ましくはE4 ORF6遺伝子産物を発現するためにE4 ORF6機能を制御するプロモーターを誘導するために必要な薬剤を供給することにより始めさせる。
【００５０】
本明細書で検討するように、本発明は以下の具体的な態様例の細胞を使用することができる：
（ａ）AAVrepおよびcap遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)およびE4 ORF6遺伝子産物により安定にトランスフェクトされた細胞；
（ｂ）AAVrepおよびcap遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)、アデノウイルスE2a遺伝子産物およびアデノウイルスE4 ORF6で安定にトランスフェクトされた細胞；
（ｃ）エプソームに運ばれるか、または細胞の染色体に組込まれたAAVrepおよびcap遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされ、そして一時的にアデノウイルスのE2a遺伝子産物を発現する細胞；
（ｄ）少なくとも１つのAAVrepおよびcap遺伝子およびアデノウイルスE2a遺伝子産物（またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされた細胞；および
（ｅ）１以上のエプソームとして、または組込まれたDNAとして安定に、AAVrep遺伝子、AAVcap遺伝子、E2a遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされ、そして導入遺伝子を含む核酸分子を一時的に発現する細胞。
【００５１】
宿主細胞およびrAd/AAVハイブリッドウイルスが必要なrepおよび／またはcap配列および任意の必要なアデノウイルス配列を供給しない場合、このような配列は例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜誘導法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適当な方法により宿主細胞に導入することができる。
【００５２】
例えば、本発明の宿主細胞系またはrAd/AAVハイブリッドウイルスのいずれもがE2a遺伝子産物を発現しない場合、E2a遺伝子産物を発現するアデノウイルスDNAを、E2a遺伝子産物の発現を支配するプロモーターおよび他の調節成分も含む核酸配列の状態で宿主細胞に提供することができる。E2a用のプロモーターは、上記のような構成的、誘導性または天然のプロモーターでよい。E2a遺伝子産物の発現の制御に於けるプロモーターはある態様では構成的プロモーターでよいが、好適な態様ではプロモーターはE2a遺伝子産物生成（これは過剰に蓄積すると細胞に傷害性である［D.Brough et al., Virology,190:624-634(1992)およびD.Klessig et al.,Virus Res.,1:169-188(1984)]）の量および時期をE1遺伝子産物の生産に対して制御するような誘導性プロモーターである。１つの好適な態様は、E2aの生産を支配するプロモーターはE1aおよびE1bの発現を支配するプロモーターとは異なる誘導性プロモーターであり、そしてE1誘導性プロモーターに使用するものとは異なる誘導剤に暴露することにより誘導可能である態様を提供する。
【００５３】
核酸分子（プラスミドまたはウイルス）を宿主細胞に導入し、そして本発明に有用な宿主細胞を調製することは、当業者に既知の技術を使用して、そして本明細書を通して記載したように達成することができる。核酸分子の構築法には、cDNAおよびゲノムクローニング（これらは周知であり、そしてSambrook et al.,and Ausubel et al.、同上に記載されいる）、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望のヌクレオチド配列を提供するための任意の他の適当な方法と組合わせたアデノウイルスおよびAAVゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用が含まれる。好適な態様では、標準的なトランスフェクション法、例えばハイブリットアデノウイルス／AAVベクターによるヒト胚性腎細胞系HEK293(トランスに作用するE1タンパク質を提供する機能的アデノウイルスE1遺伝子を含むヒトの腎臓細胞)およびB50細胞系(安定に組込まれたrepおよびcap遺伝子を含むHeLa細胞系)のような細胞系へのCaPO4トランスフェクションまたはエレクトロポレーション、および／または感染を使用する。
Ｄ．rAAVの生産法
上記のように、本発明は混入するヘルパーウイルスまたは野生型の不存在下で、組換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）を生産する方法を提供する。適当には、宿主細胞をrAd/AAVハイブリッドウイルスに、約0.5〜約1000またはその間、例えば約１〜約500、約10〜約250、そして約50〜約200の範囲の感染多重度で感染させる。
【００５４】
rAAVビリオンの生産法には、rAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物、AAVrep配列およびAAV capを配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含む本明細書に記載するようなrAd/AAVハイブリッドウイルスを含む哺乳動物細胞を培養することを含む。その後に、導入遺伝子の発現を支配する組換えAAVビリオンを、混入するヘルパーウイルスまたは野生型AAVの不存在下で細胞または細胞培養物から単離する。
【００５５】
この方法に使用する通例の技法は、rAAVウイルスゲノムのクローニング、およびシグナル生成の測定法等を含む。メッセージまたはシグナルを検出するために、あるいはrAAVを他のウイルスから分離するために精製工程は必要ない。一般に生産では、溶解物中の細胞タンパク質からrAAVを濃縮するために、クロライド勾配遠心またはカラムクロマトグラフィーのような通例の精製法が使用される。例えば、トランスフェクション培地を一緒に含む細胞がスクレーパーにより回収され、そしてエタノール−ドライアイスおよび37℃の水浴中で３回の凍結−解凍にかけられる。細胞は例えば４℃で15分間、遠心することもできる。
【００５６】
本発明のハイブリッドAd/AAVウイルスは複製できるため、選択した宿主細胞の感染後、rAAVビリオンの生産を至適化するために、rAd/AAVハイブリッドウイルスが複製する能力を制御し、これによりAAV構築物をレスキューし、そしてrAAVビリオンにパッケージングする能力を強化することが望ましい。rAd/AAVハイブリッドウイルスが感染後に複製する能力は、当業者には容易に明らかな種々の方法により抑制することができる。
【００５７】
例えば１つの特に適当な態様では、宿主細胞は温度感受性突然変異をアデノウイルスの複製および／またはパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子（例えばアデノウイルス遺伝子のE2b）に含むrAd/AAVハイブリッドウイルスを、約100〜約200のMOIで感染させる。その後に、宿主細胞を約32℃〜約37℃の温度で培養し、そして本明細書に記載するように単離する。以下の実施例で具体的に説明するように、この方法はrAAVの卓越した収率の提供することが分かった。温度感受性突然変異を含有する適当なrAdの１例は、すでに記載されたsub100rである［Schaack,J.et al.,J.Virol.,69:4079-4085(1995)］。
【００５８】
さらに、あるいはrAd/AAVの複製に必要な１以上のアデノウイルス遺伝子の発現を制御することができる。例えばアデノウイルスのE4（またはE4 ORF6）は、rAd/AAVにより、またはrAd/AAVハイブリッドウイルスが遺伝子産物を発現しない宿主細胞により、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の例では、アデノウイルスE1およびE2遺伝子産物は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの制御下で発現する。すなわちこの方法はさらに培養した宿主細胞と、少なくとも１つの必要なアデノウイルス遺伝子産物の発現を制御する少なくとも１つの誘導剤を接触させる工程を含む。必要な各アデノウイルス遺伝子産物が異なる誘導性プロモーターの制御下にある場合、この方法はさらに宿主細胞培養に第１誘導性プロモーター用の第１誘導剤および第２誘導性プロモーター用の第２誘導剤を加える工程が必要となる。この方法の態様は、このようにしてアデノウイルス遺伝子産物、例えばアデノウイルス遺伝子のE1a、E1b、E2aおよび／またはE4 ORF6の制御された発現を可能とする。さらに本発明はアデノウイルスの遺伝子産物（例えばE1aおよびE1b)を、他のアデノウイルス遺伝子産物(1つまたは複数)（例えばE2a)の発現に対して、所望の比率で発現することを可能とし、これは特定の宿主細胞中でその細胞に適する培養条件下でのrAAV生産に最適である。
【００５９】
E1遺伝子産物のE2a遺伝子産物およびAAV rep/cap産物に対する適当な比率の決定は、細胞の種類、使用する構成的および／または誘導性プロモーターの強さ、使用する誘導剤（１つまたは複数）の量、および好適な遺伝子産物の誘導の順序および時期を考慮して当業者により行われ得る。rAAVの最大生産を可能とする最適な比率は、このような因子が異なるので異なるかもしれない。例えばE1a遺伝子が弱いまたは中程度の強度の構成的プロモーターにより制御される場合、適当な比率を得るためにE2a遺伝子は強力な誘導性プロモーターにより制御され、そして誘導剤を培養の初期に加えるべきである。E1a遺伝子ならびにE2a遺伝子が誘導性プロモーターにより制御される場合、rAAVのための最適な生産系を提供するために、２種の誘導剤は量を変動させて、そして誘導の順序を変動させて加えることができる。しかし好適な量および順序を決定するために使用するそのような至適化実験は当業者の技術範囲内であり、そして本明細書の開示に照らせば単なる日常的な実験である。
【００６０】
本発明の別の好適な態様では、E1a遺伝子産物は誘導性プロモーターの制御下で発現され、そしてE1bおよびにE2a遺伝子、ならびに存在する他のアデノウイルス遺伝子（例えばE4ORF6および／またはVAI RNA）はそれらの自然なプロモーターの制御下で発現される。上記で検討したように、E1a遺伝子産物はE1b、E2aおよび他のアデノウイルス遺伝子の自然なプロモーターを活性化する。細胞が誘導されない時に低い基準レベルのE1aを発現し、そして細胞が誘導剤と接触した時に高レベルのE1aを発現する限り、任意の誘導性プロモーターを使用することができる。多数の誘導性プロモーターが当該技術分野では知られており、そして本明細書を通して検討した。特別な誘導性プロモーターには限定するわけではないが、亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター；デキサメタゾン（Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン-抑制系；テトラサイクリン-誘導系；RU486-誘導系；およびラパマイシン-誘導系を含む。
【００６１】
以下の実施例は、本発明の幾つかの好適な方法を具体的に説明する。このような実施例は単に説明であり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【００６２】
【実施例】
実施例１−ヘルパー非依存的細胞系の生産のための B-50 細胞系および Ad/AAV ハイブリッドベクターの使用
組換えAd/AAVハイブリッドベクターは、米国特許第5,856,152号明細書に記載された方法を使用して構築するが、ただしE3遺伝子を削除し、そしてRSVまたはPGKプロモーターに操作可能に連結し、そして制御下にあるE1遺伝子を、アデノウイルスゲノムのE3領域にクローン化する。Ad/AAVハイブリッドベクターは、米国特許第5,856,152号明細書に記載されたようにパッケージングする。
【００６３】
簡単に説明すると、B-50はAAV２型repおよびcap遺伝子をホモロガスなp5プロモーターの制御下で安定に発現する細胞である。この細胞系はコンカテマー状態のP5-rep-cap-遺伝子カセットの多コピー(少なくとも５コピー)が宿主染色体に組込まれていることが特徴である。このB-50細胞系は、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の要件に従い、1997年9月18日にバージニア州 20110-2209、マナッサス 10801 ブルヴァール大学のアメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託番号CRL-12401で寄託された。
【００６４】
B-50細胞は、24時間に60mmのプレートあたり２×105細胞の密度でまかれる。24時間後、播種培地（抗生物質を補充したDMEM／10％FBS）をDMEM／２％FBSと交換する。細胞はE1およびrAAVミニ遺伝子を含有する組換えAd/AAVクローンにより適当なMOIで感染させる。このB-50細胞の１段階感染で、rAAV生産に必要なすべてのヘルパー遺伝子が提供される。すなわちsub100rのような他のヘルパーウイルスは必要ない。
【００６５】
感染から24〜96時間後、細胞溶解物を調製し、そして溶解物をrAAV生産について当該技術分野で既知の方法により滴定する。rAAVがrAAVLacZならば、溶解物は以下のように滴定することができる。細胞をトランスフェクション培地と一緒に、スクレーパーにより回収し、そしてエタノール−ドライアイスおよび37℃の水浴中で３回の凍結−解凍にかける。細胞は４℃で15分間、卓上で3000rpmにて遠心する。各溶解物の1/10を84-31細胞、rAAVにより形質導入可能なE1/E4-二重相補（complementing）細胞系を24時間感染させるために使用する。次いで84-31細胞をX-Galで組織化学的に染色する。各感染で多数の青色の細胞が採点され、そして各トランスフェクションで生産されたrAAVLacZの感染単位（IU、IUは計数された1つの青色細胞と定めた)として表す。
実施例２−複製できる Ad-AAV ハイブリッドウイルスによる B50 細胞中の rAAV の生産
緑色の蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子がCMVプロモーターにより駆動され、そしてAAV2 ITRsにより挟まれたAArVCMVGFPゲノムを、Ad5突然変異体、Sub100rウイルスのE3領域にクローン化した。Sub100rのE2b末端タンパク質遺伝子は、３bpの挿入により破壊され、温度感受性の表現型とした。生成した組換えAd-AAVハイブリッドは、E11、E2a、E4およびVARNA遺伝子については遺伝子型では野生型であるが、E3遺伝子は今、rAAVCMVGFPゲノムに置き換えらている。すなわちこの第２世代のAd-AAVハイブリッドは、すべての必須なヘルパー遺伝子およびrAAVゲノムを保有し、そして理論的にはB50細胞をウイルスで１回感染させれば、rAAVゲノムのレスキュー、複製およびパッケージングを導くはずである。
Ａ．複製できるrAd-AAVハイブリッドウイルスの構築
市販されているプラスミド構築物pAB27は、マイクロビックス バイオシステムズ(Microbix Biosystms）（オンタリオ州、カナダ）から購入した。このプラスミドはA5dゲノムの以下のセダメントを持つ：m.u.78.3n85.8に広がる2.7kbE3欠失を含むm.u.0−1、10.6−16.1および69−100。組換えAAVCMVGFPゲノムは、prAAVCMVGFP構築物［強化されたGFP、EGFPを含むクローンテックの製品］からPvuIIフラグメントとして単離され、そしてpAB27プラスミドのScaI部位にクローン化された。生成したシャトルプラスミドを、pABrAAVCMVEGFP［図１Ａ］と命名した。Ad E2B末端タンパク質突然変異体、Sub100rは許容され得る32℃で条件付きで複製できるある新しいAd-AAVハイブリッドを構築するためにウイルス骨格として使用した。rAAVCMVEGFPをSub100rゲノムに導入するために、Sub100rウイルスDNAを制限エンドヌクレアーゼSpeIで消化し、そしてpABrAAVCMVEGFPを用いて293細胞にリン酸カルシウム法によりコー−トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をトップアガーに重層し、そして32℃で14日間培養した。Sub100r-rAAVCMVGFPの緑色のウイルスプラークをさらなるプラーク精製のために単離し、そして大規模なウイルス調製用に拡大した。Sub100rAAVCMVGFPハイブリッドウイルスを生成するための相同的組換え工程の具体的説明については図１Ｂを参照にされたい。
Ｂ．rAAVの生産
B50細胞は、ウェルあたり１×105細胞密度で12ウェルプレートにまいた。24時間後、細胞をSub100rAAVCMVGFPハイブリッドで細胞あたり100、1000、2000および4000ウイルス粒子に感染させた。各感染について３重の12ウェルプレートを、異なる温度32、37および39.5℃でのインキューベーションのために準備した。陽性対照として、12ウェル中のB50細胞を野生型Ad5ヘルパーおよびSub100rAAVCMVGFPを用い、上記のMOIで同時に、または24時間の間隔で感染させた。感染から72、96および120時間後、各感染の全細胞溶解物を回収した。３回の凍結−解凍サイクルを通した後、溶解物を４℃で15分間、3000rpmで遠心した。生成した各サンプルの上清を集め、そして-80℃で保存した。各感染で生産されたrAAVCMVGFPを定量するために、各サンプルの一部を56℃に１時間加熱して、感染性Ad-AAVハイブリッドsub100r-AAVCMVGFPを不活性化し、そして84-31細胞、E1/E4相補細胞クローンに連続希釈して乗せた。各サンプルの緑色の蛍光形成単位（GFFU）を感染から24〜48時間でUV-顕微鏡下で採点し、最初のsub100rAAVCWGFP感染において使用したB50細胞あたりのGFFUとしてコンピーター処理した。ここでの１GFFUは限定-希釈感染において、rAAVCMVGFPによるGFP形質導入のフォーカスにより定めた。すなわち細胞あたりのGFFUは、対応する実験の設定で各B50細胞により生産される各々のrAAVCMVGFPを表す。
Ｃ．B50細胞中でAAVを生産するために、複製できるrAd-AAVハイブリッド使用の至適化
新規B50／ハイブリッド系により生産される最大収率のrAAVのための条件を至適化するために一連の実験を設定し、そしてもとのB50/ハイブリッド系と比較した。
【００６６】
B50/複製可能なハイブリッド感染系は、最初の実験でヘルパーウイルスの存在下にて生産されたrAAVCMVGFPの約1/3〜1/6を生産することができる。この表１にまとめるこのデータは、rAAV生産にB50/複製可能なAd-AAVハイブリッド感染系を使用することの可能性を示した。
【００６７】
【表１】
ここで与えるデータは、試験した実験条件下で、B50/複製可能Ad-AAVハイブリッド系がrAAVを生産できることを示唆している。しかし最大収率はB50細胞をAd5Wtヘルパーおよびハイブリッドで感染させた24時間間隔に比べて３〜６倍に低下した。単回感染系は、39.5℃に比べて32および37℃でより良く行われた。
【００６９】
我々はいったんB50細胞に入れば、複製できるAd-AAVハイブリッドは２つの可能な運命に直面すると仮定した：複製されるか、あるいはAVVレスキュー、複製およびパッケージングのためにRepタンパク質により無能にされる(crippled)かのいずれかである。この系を使用したrAAVの生産的感染は、両方向の微妙なバランスがとられるのだろう。我々はすでにB50/Adヘルパー/E1-欠失Ad-AAVハイブリッドによる高収率AVV生産には、Ad5 E1タンパク質により誘発されるRep/cap遺伝子発現間の重要な一時的関係、入ってくるAd-AAVハイブリッドの一時的な増幅、ハイブリッド骨格からのrAAVゲノムの分解（resolving）、そしてさらにAVVゲノムの複製があることを示した。Sub100r突然変異体に許容され得る温度は32℃であるが、そのよ うな温度感受性は37℃ではいくらか漏出性であり、しかし39.5℃では極めて緊縮である。我々は37℃で、sub100rAAVCMVGFPの複製は低下するが、Rep/cap、AAVレスキュー、複製およびパッケージングは最適であると予想した。このデータは、系が32℃よりも37℃で正により生産的であることを示した。しかし39.5℃でのAVVの生産性は鋭く低下した。この場合、おそらくハイブリッドは全く複製されなかった。さらに全細胞器官が高温度ストレス下にあり、rep/cap発現、AAVレスキュー、複製およびパッケージングの欠失をもたらした。
１．sub100rAAVCMVGFPに関する感染の最適多重度の決定
実施例２Ｂからのデータに基づき、低いMOIでのB50細胞の感染がAVVの生産に有利であると思われる。最初の実験からのデータに従い、生産温度32および37℃で、rAAVの収率はsub100rAAVCMVGFP感染のMOIが上昇するほど鋭く低下する。100pts/細胞と1000pts/細胞との間のAVV生産性において劇的な差異が存在することは、最大の生産性のための最適MOIがその範囲にあることを示唆している。最適なMOIを定めるために行った第２実験は、32および37℃の両方で20と1,000粒子(pt)/細胞の間のMOIの影響を調査することであった（表２）。したがってB50細胞を上記のように12ウェルプレートにまき、そしてsub100rAAVGFPの20、40、100、200、400および1000粒子で感染させた。粗細胞溶解物を調製し、そして細胞あたりのrAAVCMVGFP生産性について上記のようにアッセイした。
【００７０】
【表２】
結果から100または200pts/細胞のいずれかが32℃の感染には最適であることが明らかとなった。しかし37℃での状況は極めて異なり、ここでは最適MOIは200pts/細胞に厳しく限定された。MOIの２倍の増加または減少が、AVV生産性において60％の低下をもたらした。ここで、そしてこれまでの実験で観察されたAVV生産に対するMOIの影響は、AVV生産用のB50/ハイブリッド系の使用において、ハイブリッドの複製とrAAVパッケージングの間に微妙なバランスが達成されることが重要であることが証明された。アデノウイルスの複製過程は特に許容および半許容状態下では高度にMOI依存的であることは周知である。高いMOIでは、ハイブリッドウイルスの複製が優勢になるが、rAAVレスキュー、複製およびパッケージングは有意に低下するのが妥当と思われる。一方、限定されたハイブリッドウイルスの増幅は、レスキューおよびパッケージングに関するrAAVゲノムの数を増加させるために望ましい。これは表２に与える結果で明らかに示されている。32℃がsub100rAAVCMVGFPに許容され得るが、100と200pts/細胞との間に観察されるAVV収率について明らかな差異はなかった。MOIが400pts/細胞を越える時のみ、AVV収率は劇的に低下した。しかし感染が半許容温度の37℃で行われた時、最適なMOIは200pts/細胞のみに限定された。ここで限定され、そしてMOI依存的なハイブリッドウイルスの複製が、最大のAVVパッケージングに重要となる。
２．sub100rAAVGFPを用いた単回感染に最適温度の決定
最初の実験から、39.5℃では大変少量のAVVしか生産されないが、32および37℃でのAAV生産性は比較できるものであることが分かった。感染温度がAAV生産性に及ぼす影響を調査するために、上記のMOI実験を32および37℃で二重に行った。
【００７２】
表１および２に与えたデータは、最適MOIでAVV生産は32℃よりも37℃が良かったことをも示した。これはまた限定されたハイブリッドウイルスの複製とAVVレスキュー、複製およびパッケージングとの間にバランスが必要であることによっても説明することができた。明らかに半許容温度の37℃で、２つの異なる出来事の平衡はAVVパッケージングに向かって優先して移動し、より高い生産性を導いた。３．感染工程中の37から32℃への温度の切り替え
12ウェルプレート中のB50細胞は、細胞あたり100粒子のsub100rAAVCMVGFPで、37℃で36および60時間感染させた。次いでプレートを32℃に設定した別のインキューベーターに移動した。粗細胞溶解物は84-31細胞でのAAV生産性の滴定のために、感染後72、96、120、144および168時間に調製した。
【００７３】
この実験計画を裏付ける理論は、sub100rAAVCMVGFPウイルスが37℃では限定された複製を行うが、Rep/capタンパク質用のP5プロモーターの活性化は最適であるはずであるからである。37℃で24時間のインキューベーションにより、限定されたハイブリッドウイルスの複製レべルで開始さるRep/cap発現、そしてこれによりB50細胞をAVVレスキュー、複製およびパッケージングについて条件付けることを可能とする。いったん感染を32℃に切り替えると、ハイブリッドウイルスの複製も細胞中に蓄積したRepタンパク質の阻害効果により幾分遅くなるはずである。温度切り替え実験の結果(表３)が予想に反したのは、おそらくハイブリッドの複製とAVVレスキューおよび複製との間の最適なバランスが達成できなかったからであろう。しかしデータはより早い時期の温度の切り替えは、遅い切り替えよりも良い収率をもたらし、切り替えの時期がAVV生産に重要な役割を果たすことを示唆している。
【００７４】
【表３】
４．最初の感染から24時間後に、B50細胞に第２バッチのsub100rAAVCMVGFPの添加 12ウェルプレート中のB50細胞は、細胞あたり100粒子のsub100rAAVCMVGFPで、37℃で24時間感染させた。細胞あたり100粒子で第２バッチのsub100rAAVCMVGFPを37℃で加え、そして他の組を32℃に設定したインキューベーターに移動した。各条件下でのAVV生産は最初の感染後72、96、120、144および168時間で調査した。
【００７６】
古典的なB50/Ad5ヘルパー/E1-欠失Ad-AVVハイブリッド系では、第１Adヘルパーウイル感染と第２Ad-AVVハイブリッド感染との間に24時間の間隔を有することが必須である。２つの感染間のこの微妙な一時的関係は、高い収率のAVV生産のために、ハイブリッドウイル複製とAVVレスキューの適切な割合を調節するために、適切なレベルのRepタンパク質のような最適な細胞条件を作ることを可能とする。その場合、AdヘルパーウイルスとE1-欠失ハイブリッド感染との間の差異は、E1タンパク質の存在および不存在である。しかし複製できるAd-AVVハイブリッドをB50細胞中でAVV生産に使用する時、Adヘルパーウイルスとハイブリッドとの間にはそれらがすべての必要なヘルパー機能を提供する能力という意味で差異はない。細胞を２つのバッチのハイブリッドで24時間の間隔で感染させる場合、第１バッチは丁度Ad Wt感染のようにヘルパーとして役立ち、そして第２バッチは増幅、レスキューおよびパッケージングのためのrAAVゲノムを運ぶための丁度E1-欠失ハイブリッドとなるはずである。我々は850/複製可能なAd−AAVハイブリッド法のAAV生産性は、古典的なB50/ハイブリッド系のAAV生産性くらい高くなると予想した。実験から得られたデータは、我々の理論を正に支持していた(表４)。１つの種類のアデノウイルスだけをこの新しい生産法に使用したので、精製法は幾分簡略され、そしてスケールアップ工程も容易となる。さらにまた、我々はE4欠失のようなより一層重い突然変異をハイブリッド骨格に導入し、そして対応してAd遺伝子をB50細胞に安定に導入することができた。このように我々はハイブリッドウイルス自体を無能にするので、たとえAAV調製物に幾らかの欠損ハイブリッドが混入していても、そのような欠損ハイブリッドのインビボにおける副作用はさらに最小となるだろう。
【００７７】
【表４】
PCT/US99/05870および米国特許出願第09/404,555号明細書を含め上記に引用した技術文書は、引用により本明細書に編入する。本発明の多くの修飾および変更が上記の本明細書に含まれ、そして当業者には自明であると予想される。本発明の方法に対するそのような修飾および変更は、前記特許請求の範囲に包含されると考える。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 実施例２に記載するようなシャトルプラスミドpABrAAV-CMV-EGFPの生産の概略的説明である。
【図１Ｂ】 図１Ａのシャトルプラスミドと実施例２に記載するようなsub100rアデノウイルスとの間の相同的組換えによる複製できるrAd-AAVハイブリッドの生産の概略的説明である。
Claims (15)
- （ａ）複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス５’シス要素；
（ｂ）天然のアデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ領域中のアデノウイルス配列の欠失；
（ｃ）組換えアデノ-随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
（ｄ）Ｅ３領域からのアデノウイルス配列の欠失；
（ｅ）Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子産物の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスＥ１ａおよびアデノウイルスＥ１ｂをコードする核酸配列、ここでＥ１ａおよびＥ１ｂ核酸配列はＥ３領域の部位に位置している；および
（ｆ）複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス３’シス要素、
を含んで成る複製できるウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。 - 請求項１に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、さらに、アデノウイルスＥ２ａ遺伝子産物をコードする核酸配列を、宿主細胞中でそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、さらに、アデノウイルスＥ４遺伝子産物またはそれらの機能的フラグメントをコードする核酸配列を、宿主細胞中でそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項３に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、該Ｅ４遺伝子産物の機能的フラグメントがＥ４ ＯＲＦ６である、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、さらに、ＶＡＩ ＲＮＡをコードするアデノウイルス配列を含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、該ｒＡＡＶが１型ＡＡＶまたは５型ＡＡＶから選択される配列を含む、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項４に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、上記ｒＡＡＶベクターが野生型アデノウイルスのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域に位置する、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、ＡＡＶベクターがＡＡＶ５’および３’逆方向末端反復配列(ITRs)および導入遺伝子をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、該（ｅ）の調節配列が、Ｅ１ａ遺伝子産物の発現を支配する第１プロモーターを含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項９に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、該第１プロモーターが、Ｅ１ａの天然のプロモーター、誘導性プロモーター、組織−特異的プロモーターおよび構成的プロモーターから成る群から選択される、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、該調節配列が、アデノウイルスＥ１ｂ遺伝子産物の発現を支配する第２プロモーターを含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１１に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、該第２プロモーターが第１プロモーターと同一である、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１１に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、第２プロモーターおよび第１プロモーターが異なる、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスであって、さらに、温度感受性突然変異をアデノウイルスＥ２ｂ遺伝子に含んで成る、上記のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルス。
- 請求項１または２に記載のアデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドウイルスを含む哺乳動物宿主細胞。
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