JP2001500497A - 組換えアデノ随伴ウイルスに指図される遺伝子治療の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物の筋肉中に投与される所望の遺伝子をもつ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に対する免疫応答を低下させることにより遺伝子発現を延長する方法が記述される。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアデノ随伴ウイルスに指図される遺伝子治療の方法 本研究は米国保健研究所助成金第ＤＫ４７７５７号により援助された。米国政 府は本発明においてある権利を有する。 発明の背景 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製の不完全なパルボウイルスであり、その ゲノムは長さ約4.6kbであり、145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ） を包含する。ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムは複製（ｒｅｐ）およびビリオン形成 （ｃａｐ）の原因である遺伝子を含有する。 この非病原性のヒトウイルスがヒト細胞を感染させる場合、ウイルスゲノムは 第19染色体に組込まれ(integrate)細胞の潜伏感染をもたらす。感染性ウイルス の産生およびウイルスの複製は、細胞がアデノウイルスもしくはヘルペスウイル スのような溶解性ヘルパーウイルスに共感染しない限り起こらない。ヘルパーウ イルスへの感染に際し、ＡＡＶのプロウイルスがレスキューされかつ増幅され、 そしてＡＡＶおよびヘルパーウイルスの双方が産生される。 ＡＡＶは、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的に する独特の特徴を保有する。多様なグループが、疾患状態の治療におけるＡＡＶ の潜在的使用を研究してきた。 インビトロでの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の研究は形質導入の低頻度のためが っかりさせるものであり；汚染する野生型ＡＡＶもしくはヘルパーアデノウイル スの非存在下でのｒＡＡＶとの細胞のインキュベーションは組換え遺伝子発現を ほとんど伴わない［ラッセル(D．Russell)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、91 :8915-8919(1994)；アレキサンダー(I ．Alexander)ら、J．Virol.、68:8282-8287(1994)；ラッセル(D．Russell)ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA、92:5719-5723(1995)；フィッシャー(K．Fisher)ら 、J．Virol.、70:520-532(1996)；およびフェラーリ(F．Ferrari)ら、J．Virol. 、70:3227-3234(1996)］。さらに、ｒｅｐが非存在である場合、組込みは非効率 的であり、かつ、第19染色体に向けられない［クマール(S．Kumar)ら、J．Mol． Biol.、222:45-57（1991)］。ＡＡＶの形質導入はアデノウイルスの存在下で本 質的に高められる。なぜなら、一本鎖ｒＡＡＶゲノムが、転写的に活性である組 み込まれない二本鎖の中間体に変換されるからである［フィッシャー(K．Fisher )ら、J．Virol.、70:520-532(1996)；およびフェラーリ(F．Ferrari)ら、J．Vir ol.、70:3227-3234(1996)］。アデノウイルスは初期遺伝子産物Ｅ４ ＯＲＦ６ の発現によりｒＡＡＶの形質導入を増大させる［フィッシャー(K．Fisher)ら、J ．Virol.、70:520-532(1996)；およびフェラーリ(F．Ferrari)ら、J．Virol.、7 0:3227-3234(1996)］。 遺伝子治療のインビボのモデルのためのベクターとしてのｒＡＡＶの功績は雑 多であった。最も有望な結果は中枢神経系においてであり、ここでは、安定な形 質導入が有糸分裂後の細胞で達成されている［カプリット(M．Kaplitt)ら、Nat ．Genet.、8:148-154(1994)］。骨髄細胞のエクスビボでのｒＡＡＶとのインキ ュベーションは若干の形質導入をもたらすが、とは言え安定かつ効率的な造血移 植(engraftment)は移植モデルで立証されていない［ミラー(J．Miller)ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA、91:10183-10187(1994)；ポドサコフ(G．Podsakoff)ら 、J．Virol.、68:5656-5666(1994)；およびウォルシュ(C．Walsh)ら、J．Clin． Invest.、94:1440-1448(1994)］。気道もしくは血液中へのｒＡＡＶの 投与は、それぞれ肺上皮細胞［フィッシャー(K．Fisher)ら、J．Virol.、70:520 -532(1996)；およびフロッテ(T．F1otte)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、90: 10613-10617(1993)］ならびに肝細胞［フィッシャー(K．Fisher)ら、J．Virol. 、70:520-532(1996)］への遺伝子導入につながるが；しかしながら、導入遺伝子 発現はアデノウィルスが存在しなぃ限り低いことが見出されている［フィッシャ ー(K．Fisher)ら、J．Virol.、70:520-532(1996)］。 必要とされるものは、ｒＡＡＶ媒介性の遺伝子導入を向上させる方法である。 発明の要約 本発明は、組換えＡＡＶを介して動物に送達される選択された遺伝子の発現を 向上させる方法を提供する。当該方法は、ヘルパーウイルスの非存在下に、筋細 胞中に所望の導入遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターを導入することを必要とす る。当該ベクターは、心筋、平滑筋、もしくは、好ましくは、骨格筋中に投与さ れうる。 好ましい一態様において、ｒＡＡＶで送達される導入遺伝子は、治療上有用で ぁる分泌性および／もしくは拡散性の産物をコードする。この態様において、導 入遺伝子産物は、送達部位から一定距離の部位に対し治療効果を有しうる。別の 態様において、導入遺伝子は、筋肉への送達が望ましい（例えば、筋ジストロフ ィーの治療のため）非分泌性産物（例えば、ジストロフィンポリペプチド）をコ ードする。 別の局面において、本発明は、血友病の動物の治療方法を提供する。 当該方法は、動物の筋肉中に、第IX因子をコードする遺伝子およびその遺伝子の 発現を調節する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスを投与す ることを必要とする。 なお別の局面において、本発明は、アテローム硬化症の動物の治療方法を提供 する。当該方法は、動物の筋肉中に、ＡｐｏＥをコードする遺伝子および前記遺 伝子を発現させることが可能な調節配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスを投与 することを必要とする。 本発明の他の局面および利点は、その好ましい態様の以下の詳述された記述に おいてさらに記述される。 図面の簡単な説明 図１はＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ（4883bp）の線状の配置を示す略図である。関 連する要素は、ＡＡＶのＩＴＲ（黒色の四角）、ＣＭＶプロモーター（平行線を ひかれた矢印）、ＳＶ４０のイントロンおよびポリアデニル酸化シグナル（白色 の四角）、ならびにｌａｃＺのＤＮＡ（影を付けられた四角）を包含する。内部 ＢａｍＨＩ断片ならびに完全長のベクターを検出するのに使用され得るｃＤＮＡ プローブの位置もまた示される。 図２Ａは、ＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺのコンカテマーの線状の配置の略図である 。関連する境界標識は、ＡＡＶのＩＴＲ（平行線を引かれた四角）、ＣＭＶのエ ンハンサー／プロモーター（黒色の矢印）、ＳＶ４０のイントロンおよびポリア デニル酸化シグナル（白色の四角）、ならびにｌａｃＺのｃＤＮＡ（影をつけら れた四角）を包含する。ＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの単量体は、ＩＴＲで直接の末 端と末端(end-to-end)のライゲーション機構に従って結合されて（ｊと標識付け される）示される。従って、この戯画では２コピーのＡＡＶのＩＴＲが結合部(j unction)に存在する。 図２Ｂは結合部ドメインの拡大された概観を示す略図である。関連する境界標 識は上の図２Ａに示されたようである。横方向の矢印は以前の結合部を越えて増 幅するのに使用されたＰＣＲプラィマーの位置および方向を示す。プライマー０ ０５はセンス鎖のプライマーである。プライマー０１３および０１７はアンチセ ンス鎖のプライマーである。 図３は、単量体のＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノムの直接の末端と末端のタンデ ムのライゲーションを仮定して予測されるＰＣＲ産物を示す略図である。それら のそれぞれの「フロップ(FLOP)」および「フリップ(FLIP)」の向きの２個の完全 なＩＴＲ（影をつけられた四角）が結合部（ｊと標識付けされる）に示される。 ＣＭＶプロモーター（黒色の四角）およびポリアデニル酸化シグナル（白色の四 角）もまた示される。ｐＣＲＩＩ中のＰＣＲのクローニング部位は、示されるよ うにＥｃｏＲＩ切断部位により隣接される。ＰＣＲ産物内で位置を定められた３ 個のＳｎａＢＩ切断部位の位置もまた示される。プライマー００５および０１３ もまた示される。 図４Ａは、図４Ｂ〜４Ｇとともに、図４ＡのＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺのコンカ テマーの先頭と末尾(head-to-tail)の結合部に位置する(map to)ＰＣＲ産物の構 造を具体的に説明する。図４Ａは単量体のＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノムの直接 の末端と末端のタンデムのライゲーションを仮定して予測されるＰＣＲ産物を示 す。それらのそれぞれの「フロップ」および「フリップ」の向きの２個の完全な ＩＴＲ（影をつけられた四角）が結合部（ｊと標識付けされる）に示される。Ｃ ＭＶプロモーター（黒色の四角）およびポリアデニル酸化シグナル（白色の四角 ）もまた示される。 図４Ｂはクローン３からのＰＣＲ産物の構造を具体的に説明する。 図４Ｃはクローン８からのＰＣＲ産物の構造を具休的に説明する。クローン８ はクローン３と大きさがほぼ同一であるが、しかし、ＩＴＲ結合部の異なる再配 置を含有する。 図４Ｄはクローン５からのＰＣＲ産物の構造を具体的に説明する。 図４Ｅはクローン２からのＰＣＲ産物の構造を具体的に説明する。 図４Ｆはクローン６からのＰＣＲ産物の構造を具体的に説明する。 図４Ｇはクローン７からのＰＣＲ産物の構造を具体的に説明する。 図５Ａはアデノウイルス抗原ならびにＬａｃＺに対して向けられる細胞傷害性 Ｔリンパ球の活性化を特徴づける。これは実施例５の第１群から収穫されたリン パ球の分析である。 図５Ｂはアデノウイルス抗原ならびにＬａｃＺに対して向けられる細胞傷害性 Ｔリンパ球の活性化を特徴づける。これは実施例５の第２群から収穫されたリン パ球の分析である。 図５Ｃはアデノウイルス抗原ならびにＬａｃＺに対して向けられる細胞傷害性 Ｔリンパ球の活性化を特徴づける。これは実施例５の第３群から収穫されたリン パ球の分析である。 図６Ａは、実施例５の第１〜４群のそれぞれについての、β−ガラクトシダー ゼ、精製されたＡＡＶもしくはアデノウイルスを包含する多様な抗原に応答する Ｔリンパ球の活性化を示す。活性化は、Ｔ細胞のＴＨ１サブセットを表すＩＦＮ −γの分泌により立証される。 図６Ｂは、実施例５の第１〜４群のそれぞれについての、β−ガラクトシダー ゼ、精製されたＡＡＶもしくはアデノウイルスを包含する多様な抗原に応答する Ｔリンパ球の活性化を示す。活性化は、Ｔ細胞のＴＨ ２サブセットを表すＩＬ−１０の分泌により立証される。 図７Ａは、実施例５の多様な群におけるβ−ガラクトシダーゼに対して向けら れた抗体の発生を示す、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）からの結果を具体的に説 明する。 図７Ｂは、実施例５の多様な群におけるアデノウイルスタイプ５に対して向け られた抗体の発生を示す、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）からの結果を具体的に 説明する。 図８は、動物（ｎ＝４）あたり２×10¹¹のｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸベクターゲノ ムのＩＭ注入後の時間の関数としてのＣ５７ＢＬ／６マウスのｈＦ．ＩＸの血漿 濃度のグラフである。 図９は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸのＩＭ注入の結 果としてのヒトＦ．ＩＸに対する循環抗体を示すグラフである。 動物（ｎ＝３）あたり２×10¹¹のベクターゲノムの注入後の血漿中の抗ｈＦ．Ｉ Ｘ抗体濃度の時間経過を、標準としてマウスＭＡｂ抗ｈＦ．ＩＸ［ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim)］を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。 各線は個々の動物を表す。 図１０は、注入後の時間の関数としての３匹のマウスのｈＦ．ＩＸの血漿濃度 を具体的に説明する。各印は異なる動物を表す。この実験の第４の動物は、注入 ５週間後に外傷性静脈切開後に死亡した。 図１１は、ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸの注入後の時間の関数としての４匹のＲａｇ −１マウスのｈＦ．ＩＸの血漿濃度を具体的に説明するグラフである。各印は異 なる動物を表す。 図１２は、形質導入された細胞中に存在するｒＡＡＶの先頭と末尾のコンカテ マーの概略の図解である。 図１３は、ＡＶ．ＣＭＶＡｐｏＥの構築を具体的に説明する概略図である。 発明の詳細な記述 本発明は、ヘルパーウイルスもしくは外因性ヘルパー分子の非存在下に高レベ ルかつ安定な導入遺伝子発現を提供する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性 の筋肉に指向性の遺伝子導入の方法を提供する。とりわけ、本方法は、所望の導 入遺伝子をもつ組換えＡＡＶを筋細胞に導入することを伴う。望ましくは、当該 ｒＡＡＶベクターは、心筋、骨格筋もしくは平滑筋に直接注入され、また、当該 導入遺伝子は、ポリペプチドもしくはＲＮＡ分子のような分泌性および／もしく は拡散性の治療的産物をコードする。しかしながら、本発明の方法は、非分泌性 の治療上有用な産物をコードする核酸の投与に関して同様に有用である。 とりわけ、発明者は、ヘルパーを含まない精製されたｒＡＡＶ（すなわち、ア デノウィルスもしくは野生型ＡＡＶでの汚染を本質的に含まないｒＡＡＶ）の筋 肉内注入が、安定かつ持続性の導入遺伝子発現につながる筋線維の高度に効率的 な形質導入につながることを発見した。ヘルパーを含まないことにより、ＡＡＶ がヘルパーウイルスもしくは他の外因性ヘルパー分子（すなわち、筋細胞に固有 でないもしくはそこに通常存在しないヘルパー分子）の本質的非存在下にあるこ とがさらに意味をもつ。これは、導入遺伝子産物が新抗原となりうるという事実 にもかかわらず、その産物に対する有意の炎症もしくは免疫応答の活性化なしに 成し遂げられる。 本発明の方法に従って生じられる導入遺伝子発現の安定性はとりわけ印象的で ある。理論により束縛されることを望まないが、この安定性は、 ヘルパーウイルスもしくは他の外因性ヘルパー分子の非存在下での筋細胞中のＡ ＡＶプロウイルスＤＮＡの高度に非効率的な染色体の組込みによると考えられる 。いくつかの観察結果がこの仮説を支持する。下の実施例に記述されるように、 ハート(Hirt)抽出物の分析は二本鎖のエピソームの形態のウイルスゲノムを検出 することに失敗した。全細胞ＤＮＡのサザン分析は、ＡＡＶベクター内に２個の 切断部位を有する酵素で切断された場合に分離したバンドを示した一方、同一の ＤＮＡがウイルスゲノム内に切断部位を有しない酵素で切断された場合に分離し たバンドは観察されなかった。 さらなるＤＮＡ分析はコンカテマーの形成およびそれらの構造に焦点を当てた 。溶解性ＡＡＶ感染の以前の研究は、ｒＡＡＶのエピソームの複製が先頭と先頭 (head-to-head)もしくは末尾と末尾(tail-to-tail)のコンカテマーにより進行す る一方、プロウイルスの組込みをもたらす潜伏感染は先頭と末尾(head-to-tail) のタンデムの配列として確立されることを示した［バーンズ(K.I．Berns)、Micr obiol．Rev.、54:316-329(1990)；トラチン(J.-D．Tratschin)ら、Mol．Cell．B iol.、5:3251-3260(1985)；ムチツスカ(N．Muzcyzska)、Current Topics in Mic robiology and Immunology、158:97-129(1993)；マクラグリン(S.K．McLauglin) ら、J．Virol.、62:1963-1973(1988)］。本明細書に示されるデータは、本発明 に従ったｒＡＡＶベクターで形質導入された筋細胞が、ｒＡＡＶプロウイルスの 組込みを必要とする形質導入の機構と矛盾しない、双方のＩＴＲの変動性の欠失 を伴う先頭と末尾のタンデムの配列から成るコンカテマーを含有することを立証 する。 ｒＡＡＶのコンカテマーにより創製される結合部の配列分析は、双方 のＩＴＲの一貫したしかし変動性の欠失を示した。蛍光インシトゥハイブリダイ ゼーション（ＦＩＳＨ）分析は、20個の核でおよそ１個の単一の組込み部位と矛 盾しなかった一方、サザン分析は、筋線維の二倍体ゲノムあたり１個のプロウイ ルスゲノムの平均を示した。合わせたこれらの知見は、平均的コンカテマーは最 小で10個のプロウイルスゲノムを含むことを示す。 本発明の方法の別の利点は、治療用量のベクターの投与に際しての炎症の驚く べき非存在である。例えば、ＬａｃＺのＡＡＶベクターを注入されたＣ５７ＢＬ ／６マウスは、活性の(vibrant)抗β−ガラクトシダーゼ抗体がｌａｃＺアデノ ウイルスベクターが骨格筋中に注入された場合にこれらの動物で誘発されたとい う事実にもかかわらず、大腸菌(E.coli)のβ−ガラクトシダーゼに対する体液性 の免疫応答を装備することに失敗した。かように、ヘルパーを含まないＡＡＶベ クターが本発明の方法に従って使用された場合、導入遺伝子に対する免疫応答が 調節された。これは、導入遺伝子に対する強い免疫応答を典型的に導き出す、裸 の(naked)プラスミドＤＮＡ［ウオルフ(J.A．Wo1ff)ら、Science、247:1465-146 8(1990)］もしくはアデノウイルス媒介性の遺伝子治療［トリパシー(S.K．Tripa thy)ら、Nat．Med.、2:545-550(1996)］を使用するもののような従来技術の遺伝 子導入方法と鋭くよい対照をなす。かように、本発明の方法は、とりわけ、反復 される投与を必要としうる慢性の障害の治療に関して、他の遺伝子送達系を上回 る有意の利点を提供する。 Ｉ．組換えＡＡＶ 選択された導入遺伝子をもつ組換えＡＡＶベクターが本発明の方法で 使用される。導入遺伝子に加え、当該ベクターは、宿主細胞、例えば筋細胞中で 導入遺伝子の発現を制御する調節配列をさらに含有する。 多くのｒＡＡＶベクターが当業者に既知であり、かつ、本発明はいずれかの特 定のｒＡＡＶベクターに制限されない。例えば、適するＡＡＶベクターおよびそ れの製造方法は、米国特許第5,252,479号；米国特許第5,139,941号；国際特許出 願第WO 94/13788号；および国際特許出願第WO 93/24641号に記述される。１種の 特定の所望のベクターが下に記述される。 Ａ．ＡＡＶの配列 現在、好ましいｒＡＡＶは、全てのウイルスの読み取り枠（ＯＲＦ）が欠失さ れ、そしてシスに作用する５’および３’の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列［例 えば、カーター(B.J．Carter)、"Handbook of Parvoviruses"、ティサー(P．Tij sser)編、ＣＲＣ プレス(CRC Press)中の155〜168ページ(1990)を参照］のみを 保持する。かように、ｒｅｐおよびｃａｐポリペプチドをコードする配列が欠失 される。ＡＡＶのＩＴＲ配列は長さ約143bpである。本質的に、ＩＴＲを含む５ ’および３’配列全体がこのベクターで使用されることが好ましい一方、当業者 は、これらの配列の若干の程度の小さな修飾が許されることを理解することがで きる。それらの生物学的機能を保持しつつこれらのＩＴＲ配列を修飾する能力は 当該技術の熟練内にある。例えば、サンブルック(Sambrook)ら、"Molecular Clo ning．A Laboratory Manual."、第２版、コールド スプリング ハーバー ラ ボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1989)のような教 科書を参照。 ＡＡＶのＩＴＲ配列は、現在同定されているヒトＡＡＶの型を包含す るいずれかの既知のＡＡＶから得られうる。ＡＡＶの型の選択は本発明を限定す るものと予期されない。タイプ１〜４を包含する多様なＡＡＶの型が、アメリカ ン タイプ カルチャー コレクション(American Type Culture Collection)か ら入手可能か、もしくは多様な商業的および団体の(institutional)供給源から 要求により入手可能である。同様に、他の動物を感染させることが既知のＡＡＶ もまた、本発明の方法で使用されるベクターで使用されうる。本明細書に述べら れる実施例においてはＡＡＶ−２が便宜上使用される。とりわけ、ＡＡＶ−２か らの５’および３’のＡＡＶのＩＴＲ配列が、下述されるように、選択された導 入遺伝子配列および関連する調節要素に隣接する。 Ｂ．導入遺伝子 ｒＡＡＶベクター内に含有される導入遺伝子配列は、ＡＡＶ配列に対し異種の 核酸配列であり、目的のＲＮＡもしくはポリペプチドをコードする。導入遺伝子 は、筋細胞中での導入遺伝子発現を可能にする様式で調節成分に操作可能に連結 される。 導入遺伝子配列の組成は生じるベクターが用いられることができる使用に依存 することができる。例えば、１種の型の導入遺伝子配列はレポーター配列を包含 し、これは発現に際して検出可能なシグナルを生じる。こうしたレポーター配列 は、制限なしに、大腸菌(E．coli)のβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）ｃＤＮ Ａ、アルカリホスファターゼ遺伝子および緑蛍光タンパク質遺伝子を包含する。 これらの配列は、それらの発現をさせる調節要素を伴う場合、慣習的手段、例え ば紫外波長の吸光度、可視的な色の変化などにより検出可能なシグナルを提供す る。こうした導入遺伝子の発現は、細胞の定量(quantitation)、細胞の同定など のた めの方法において使用されうる。 より好ましい導入遺伝子配列は、所望の遺伝子産物をコードする治療的遺伝子 を包含する。これらの治療的核酸配列は、典型的に、インビボもしくはエクスビ ボで患者に投与される場合に遺伝的もしくは非遺伝的な遺伝子欠陥を置き換える もしくは矯正する、または後生的な障害もしくは疾患を治療することが可能であ る産物をコードする。 導入遺伝子を筋細胞に送達する本発明の方法は、血友病の治療で有用な第IX因 子、もしくはアテローム硬化症の治療で有用なアポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ｅ のような分泌性の治療的タンパク質に関しての使用にとりわけ良好に適する。し かしながら、他の治療的遺伝子産物、とりわけ分泌されるものが、当業者により 容易に選択されうる。分泌性および／もしくは拡散性の産物をコードする遺伝子 の例は、限定されるものでないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、分化因 子など、例えば、β−インターフェロン（β−ＩＦＮ）、エリスロポエチン（ｅ ｐｏ）、インスリン、成長ホルモン（ＧＨ）および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ） を包含する。これらの遺伝子は、多発性硬化症および癌（β−ＩＦＮ）、貧血（ ｅｐｏ）、糖尿病（インスリン）、低身長（ＧＨ）ならびに骨粗鬆症（ＰＴＨ） を包含する多様な状態の治療に有用である。本発明の方法は、非分泌性の産物を コードする遺伝子の筋への送達にもまた有用である。例えば、本発明の方法は、 本発明の方法に従ったｒＡＡＶを介してジストロフィン遺伝子［例えば、リー(C .C．Lee)ら、Nature、349:334-336(1991)を参照］の送達を可能にすることによ り筋ジストロフィーの治療において有用であることが予期される。導入遺伝子の 選択は本発明の制限であると考えられない。なぜなら、こうした選択は当業者の 知 識内にあるからである。 Ｃ．当該ベクターの調節要素 ＡＡＶのＩＴＲ配列および導入遺伝子に加え、当該ベクターは、形質導入され た筋細胞中で導入遺伝子の発現をさせるのに必要な調節要素もまた包含する。従 って、当該ベクターは、望ましくは、導入遺伝子に操作可能に連結されかつ導入 遺伝子とともに当該ベクターのＡＡＶのＩＴＲ配列の間に配置される、選択され たプロモーターおよびエンハンサー（所望の場合）を含有する。 プロモーターおよび所望の場合はエンハンサーの選択は慣例の事柄であり、か つ、ベクターそれ自体を限定するものではない。有用なプロモーターは構成性プ ロモーターもしくは調節される（誘導可能な）プロモーターであることができ、 これらは導入遺伝子の制御された発現を可能にすることができる。例えば、望ま しいプロモーターはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター／エンハンサー のものである［例えば、ボスハルト(Boshart)ら、Cell、41:521-530(1985)を参 照］。他の望ましいプロモーターは、限定されるものでないが、ラウス肉腫ウイ ルスのＬＴＲプロモーター／エンハンサーおよび誘導可能なマウスメタロチオネ インプロモーターを包含する。さらに他のプロモーター／エンハンサー配列が当 業者により選択されうる。 当該ベクターはまた、望ましくは、転写物の効率的なポリアデニル酸化に必要 とされるシグナルならびに機能性のスプライスドナーおよびアクセプター部位を もつイントロンを提供する配列を包含する、導入遺伝子の転写もしくは翻訳に影 響を及ぼす核酸配列も含有することができる。本発明の例示的ベクターで使用さ れる共通のポリＡ配列はパポーバウイ ルスＳＶ−４０由来のものである。ポリＡ配列は、一般に、導入遺伝子配列の後 かつ３’のＡＡＶのＩＴＲ配列の前にベクター中に挿入される。共通のイントロ ン配列もまたＳＶ−４０由来であり、そしてＳＶ−４０のＴイントロン配列と称 される。これらおよび遺伝子発現を制御するもしくは高めるのに望ましい他の要 素の選択は慣習的であり、かつ、多くのこうした配列は当業者に既知である［例 えば、サンブルック(Sambrook)ら、およびその中に引用される参考文献を参照］ 。 導入遺伝子、プロモーター／エンハンサー、および他の調節要素の組み合わせ は、本明細書で言及の容易さのため「ミニ遺伝子」と称される。上に述べられた ように、ミニ遺伝子は５’および３’のＡＡＶのＩＴＲ配列により隣接される。 本発明の教示を提供されれば、こうしたミニ遺伝子の設計は当業者により容易に 成し遂げられ得る。 ｒＡＡＶの一例すなわちＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺおよび本発明の方法でのその 使用が下の実施例で提供される。図１に具体的に説明されるように、この例示的 ｒＡＡＶは、５’のＡＡＶのＩＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ−４０イントロ ン、ＬａｃＺ導入遺伝子、ＳＶ−４０ポリＡ配列および３’のＡＡＶのＩＴＲを 含有する。しかしながら、上に述べられたように、本発明の方法はいかなる特定 のｒＡＡＶの使用にも制限されない。 Ｄ．ｒＡＡＶの製造 本発明の方法とともに使用されるｒＡＡＶの構築で使用される配列は、以前に 出版および記述された材料を基礎として商業的もしくは学術的供給源から得られ うる。これらの材料はまた個々の患者からも得られうるか、もしくは、当業者に より知られかつ実施される標準的組換え分子ク ローニング技術を使用して生じられかつ選択されうる。配列の欠失、挿入および 他の突然変異を包含する、ｒＡＡＶベクターの製造で使用される存在する核酸配 列のいかなる修飾もまた、標準的技術を使用して生じられうる。 ＡＡＶ、導入遺伝子および他のベクター要素の配列を包含するｒＡＡＶの集成 (assembly)が慣習的技術を使用して成し遂げられうる。あるとりわけ望ましい技 術がフィッシャー(K.J．Fisher)ら、J．Virol.、70(1):520-532（1996年１月） に記述され、これは引用により本明細書に組み込まれる。しかしながら、他の適 する技術は、教科書［サンブルック(Sambrook)ら、上に引用された］に記述され るもののようなｃＤＮＡクローニング、ＡＡＶゲノムの重なり合うオリゴヌクレ オチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提 供するいずれかの適する方法を包含する。適切な場合は、標準的なトランスフェ クションおよびコトランスフェクション技術が、リン酸カルシウムトラスフェク ション技術のような技術を使用して、ヘルパーウイルス、例えばＥ１について欠 失されたアデノウイルスの存在下にｒＡＡＶウイルスを増殖させるのに使用され 、また、当業者により容易に選択されうる。本発明で使用されうる他の慣習的方 法は、ＡＡＶのウイルスゲノムの相同的組換え、寒天重層でのウイルスのプラー ク形成、シグナル発生を測定する方法などを包含する。 望ましくは、製造されるｒＡＡＶは、いかなる汚染するアデノウイルスもしく は野生型ＡＡＶも除去するために精製される。とりわけ望ましい精製スキームが フィッシャー(K.J．Fisher)ら、J．Viro1.、70(1):520-532（1996年１月）に記 述され、これは引用により組み込まれる。し かしながら、当業者は他の適切な精製手段を容易に選択し得る。 II．治療上の応用 所望の導入遺伝子を含有するｒＡＡＶが得られれば、このベクターが動物の筋 肉中に直接投与される。本発明の方法の１個の利点は、筋肉がなかんずく第IX因 子もしくはアポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ｅのような分泌性の治療的産物の産生 のための部位としてとりわけ良好に適することである。あるいは、本発明の方法 は、非分泌性遺伝子産物を筋細胞に送達するのに使用される。 本発明のｒＡＡＶベクターは、好ましくは生物学的に適合性の溶液または製薬 学的に許容できる担体もしくは送達ベヒクル中に懸濁されて患者に投与されうる 。適するベヒクルは滅菌生理的食塩水を包含する。製薬学的に許容できる担体で あることが知られかつ当業者に公知の他の水性および非水性の等張滅菌注入溶液 ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液がこの目的上使用されうる。 本発明のｒＡＡＶベクターは、治療上の利益が過度の副作用なしにかつ医学の 当業者により決定され得る医学的に許容できる生理学的効果を伴い得られうるよ うに、選択された導入遺伝子の組込みおよび発現を提供するのに十分な量で投与 される。好ましい一態様において、ｒＡＡＶは心筋、骨格筋もしくは平滑筋に直 接注入される。当業者はまた、他の投与方法、例えば静脈内もしくは動脈内注入 もまた、ｒＡＡＶが筋細胞に標的を定められる限りは本発明の方法で利用されう ることも認識することができる。 ｒＡＡＶベクターの投薬量は、主として、治療されている状態、選択された導 入遺伝子、患者の年齢、体重および健康状態のような因子に依 存することができ、そして従って患者間で変動しうる。本発明のｒＡＡＶの治療 上有効な用量は、粒子約１×10⁸から１×10¹¹個／mlまでの本発明のｒＡＡＶベ クターの濃度を含有する生理的食塩水溶液の約１から約50mlまでの範囲にあると 考えられる。望ましくは、各用量は最低10⁹個の粒子のｒＡＡＶを含有する。よ り好ましいヒトの投薬量は上の濃度の生理的食塩水溶液約１〜20mlである。選択 された導入遺伝子の発現のレベルが、投与の経路、用量もしくは頻度を決定する ためにバイオアッセイにより監視され得る。ｒＡＡＶの投与は必要とされるよう に反復されうる。 下に述べられる実施例は、ベクターを製造しかつ本発明の方法を実施するため の好ましい方法を具体的に説明する。これらの実施例は具体的に説明するのみで あり、かつ、本発明の範囲を限定するものでない。 実施例１−ＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの製造 ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がＣＭＶプロモーターの制御下に大腸菌(E．coli) のβ−ガラクトシダーゼを発現するミニ遺伝子で置き換えられた組換えＡＡＶ（ ｒＡＡＶ）を生じさせた（ＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺ）。ＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺ は、ｐｓｕｂ２０１［サムルスキ(R．Samulski)ら、J．Virol.、61(10):3096-31 01(1987)］由来であったシスに作用するプラスミドｐＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺを 使用することにより製造した。簡潔には、このプラスミドを、Ｅ１欠失アデノウ イルス［フィッシャー(K.J．Fisher)ら、J．Virol.、70:520-532(1996)］に感染 した２９３細胞にトランスフェクションし、そしてＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ の機能を、トランスに作用するプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ［サムルスキ(R．Samu lski)ら、J．Virol.、63:3822-3826(1989)］により提供した。Ａ ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺベクターの製造ロット(production lots)を、記述された ように［フィッシャー(Fisher)ら、J．Virol.、70:520-532（1996)］、ゲノムコ ピー数／mlに従って力価を測定した。 ＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノム（4883bp）の５’から３’への構成は、 鋳型としてｐＡＶ２［ラフリン(C.A．Laughlin)ら、Gene、23:65-73(1983)］ を使用するＰＣＲにより得られる５’のＡＡＶ(1)ＩＴＲ（塩基対１〜173）［配 列番号１のヌクレオチド番号365〜538］； ＣＭＶの前初期エンハンサー／プロモーター［ボスハルト(Boshart)ら、Cell 、41:521-530(1985)；配列番号１のヌクレオチド番号563〜1157］； ＳＶ４０イントロン（配列番号１のヌクレオチド番号1178〜1179）、 大腸菌(E．coli)のｌａｃＺのｃＤＮＡ（配列番号１のヌクレオチド番号1356 〜4827）、 ＳＶ４０ポリアデニル酸化シグナル（初期および後期双方の転写単位からの切 断／ポリＡシグナルを含有する237のＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩ制限酵素断片；配列 番号１のヌクレオチド番号4839〜5037）ならびに ＳｎａＢＩ−ＢｇＩＩＩ断片としてｐＡＶ２から得られる３’のＡＡＶのＩＴ Ｒ（配列番号１のヌクレオチド番号5053〜5221） を包含する。 図１に関しては、２個のＢａｍＨＩ切断部位が二本鎖ベクター配列中に存在す る。第一は塩基対位置875のＳＶ４０イントロン中に配置され、また、第二は塩 基対位置4469のｌａｃＺのＤＮＡとＳＶ４０ポリアデニル酸化シグナルの間に存 する。従って、ＢａｍＨＩでの二本鎖配列の切断は長さ3595bpの断片を遊離する 。内部ＢａｍＨＩ断片ならびに完全長 のベクターを検出するのに使用され得るｃＤＮＡプローブの位置もまた示される 。 ｒＡＡＶ．ＣＭＡｌａｃＺウイルスを、標準的技術［例えば、コザルスキ(K.F ．Kozarsky)ら、J．Biol．Chem.、269:13695-13702(1994)を参照］を使用して精 製した。以下の実施例で使用されたｒＡＡＶのストックを試験して、以下のよう に複製能力のある野生型ＡＡＶおよびヘルパ−Ｅ１欠失アデノウイルスの非存在 を確実にした。 ２９３細胞をチャンバースライド(chamber slide)に接種し、そして野生型ア デノウイルスおよびｒＡＡＶベクターストックのアリコートに共感染させた。感 染24時間後に細胞を固定し、そしてＡＡＶのキャプシドタンパク質に対するマウ スモノクローナル抗体（アメリカン リサーチ プロダクツ(American Research Product)）とともにインキュベーションした。抗原−抗体複合体をＦＩＴＣ結 合二次抗体を用いて検出した。陽性のシグナルを１感染ＡＡＶ単位として点数を つけた(scored)。汚染するヘルパーアデノウイルスを、２９３細胞をｒＡＡＶベ クターストックのアリコートに感染させること、そしてアルカリホスファターゼ レポーター発現について染色することにより測定した。このヘルパーアデノウイ ルスはＥ１欠失であり、かつ、ＣＭＶプロモーターの転写制御下にヒト胎盤アル カリホスファターゼｃＤＮＡを含有する。複製能力のある野生型ＡＡＶもしくは アデノウイルスのヘルパーは、高度に精製されたｒＡＡＶ調製物で検出されなか った。 実施例２−ｒＡＡＶはインビボで骨格筋に安定に形質導入する ｒＡＡＶを、形質導入を高めることを意図されたＥ２ａ欠失アデノウイルスと ともにもしくはこれを伴わずに投与した。動物の処置はウィス ター インスティテュート(Wistar Institute)の研究用動物の保護および使用委 員会(Institutional Animal Care and Use Committee)（ＩＡＣＵＣ）により承 認された。 簡潔には、５週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン ラボラトリーズ (Jackson Laboratories)、メーン州バーハーバー）を、ケタミン（70mg/kg）お よびキシラジン（10mg/kg）の腹腔内注入で麻酔し、そしてその後の１cmの下肢 切開を作成した。25μｌのＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ7.8）中 のｒＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ（１×10⁹ベクターゲノム）もしくは注入直前にア デノウイルスＥ２ａ突然変異体ｄ１８０２［ライス(S.A．Rice)とクレシッヒ(D. L．Klessig)、J．Virol.、56:767-778(1985)］で補充されたｒＡＡＶ．ＣＭＶｌ ａｃＺ（５×10¹⁰のＡ₂₆₀の粒子、１×10⁸ｐｆｕ）のサンプルを、ハミルトンシ リンジを使用して各脚の脛側骨前方筋に注入した。切開を４−０ビクリル(Vicry l)縫合糸で閉鎖した。導入遺伝子発現を分析するため、動物を注入後多様な時間 点で剖検し、そして注入された筋肉を小刀で切除した。組織を一滴のＯＴＣ包埋 コンパウンド(embedding compound)上に置き、液体窒素冷却されたイソペンタン 中で７秒間急速凍結し(snap-frozen)、そして直ちに液体窒素に移した。各時間 点での組織の分析は最低６注入部位（すなわち最低３匹の動物からの両側のサン プリング）を表した。 組織化学的分析のため、凍結された筋肉を２個の等しい半分に側方に区分して 組織の横断面を生じさせた。組織の双方の半分を連続的に薄片に切った（６μｍ ）。Ｘ−ｇａｌの組織化学のため、切片を新たに調製されたＰＢＳ中0.5％グル タルアルデヒド溶液中で固定し、そして記述されたように［フィッシャー(K.J． Fisher)ら、J．Virol.、70:520-532 (1996)］β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。切片をニュートラルレッ ド溶液で対染色し、そして検鏡用に固定した。 アデノウイルスをｒＡＡＶのヘルパーとして使用した場合、Ｘ−ｇａｌの組織 化学分析は、第17日までに本質的な炎症を伴う筋線維の高レベルの形質導入を示 した。しかしながら、驚くべきことに、アデノウイルスヘルパーの非存在下にｒ ＡＡＶを受けた動物は、アデノウイルスの存在下で見出されたものを越えた形質 導入のレベルを立証した。これらの高レベルは明らかな減少なしに180日間持続 した。 実施例３−ｒＡＡＶゲノムは短くされた先頭と末尾のコンカテマーとして高効率 で組込む 安定化されたｒＡＡＶゲノムの分子状態を特徴づけするため、上のように注入 されたマウスから収穫された骨格筋からのＤＮＡのサザンブロット分析を実施し た。ｒＡＡＶゲノムが、溶解性感染の間に形成されるもののようなエピソームの 二本鎖ゲノム、もしくは潜伏感染に類似する組込まれたプロウイルスのいずれか として持続するモデルを考慮した。 簡潔には、低分子量ＤＮＡ（ハート(Hirt)）（下のＡ部を参照）および高分子 量ゲノムＤＮＡ（下のＢ部を参照）を、選択された時間点でマウスの筋肉から単 離した。ＤＮＡサンプルを１％アガロースゲル上で分離し、そして電気泳動的に ナイロンメンブレン（ハイボンド(Hybond)−Ｎ、アマーシャム(Amersham)）に転 写した。このブロットを、１ａｃＺのＤＮＡから単離された³²Ｐ−ｄＣＴＰラン ダムプライマー標識制限酵素断片とハイブリダイゼーションさせた。 Ａ．エピソームの二本鎖ゲノムの検出 ｒＡＡＶゲノムの組込まれない形態を検出するため、形質導入された 筋肉のＤＮＡのハート(Hirt)抽出物を、図１に示されるプローブ配列に位置する³² Ｐ−標識されたｃＤＮＡとのハイブリダィゼーションにより分析した。ハート (Hirt)ＤＮＡサンプル（15μｌ、15mgの組織に同等）は、注入後第８、17、30お よび64日に収穫された筋肉から抽出した。 アデノウイルス存在下にｒＡＡＶに感染した培養された細胞系からのＤＮＡを 分析した。その細胞系からのハート(Hirt)抽出物の分析は、一本鎖および単量体 の二本鎖の双方の形態のウイルスの存在を立証した。しかしながら、ｒＡＡＶ単 独で形質導入された筋肉のハート(Hirt)抽出物は第８日までに一本鎖ゲノムを立 証し、これは第64日までに検出できないレベルに減少した。二本鎖の形態のｒＡ ＡＶは、フィルターを露出過度にした場合でさえハート(Hirt)抽出物中で検出さ れなかった。これは、一本鎖ｒＡＡＶゲノムが骨格筋の細胞中に効率的に導入さ れることを示すが；しかしながら、それは転写的に活性なエピソームの形態に変 換されない。 Ｂ．組込まれたプロウイルスＤＮＡの検出および特徴づけ 組込まれたプロウイルスＤＮＡを検出するため、付加的なハイブリダイゼーシ ョン研究を、感染後64日に形質導入された骨格筋から収穫された全細胞ＤＮＡを 用いて実施した。ゲノムＤＮＡ（10μｇ、18mgの組織に同等）を、プロウイルス ＤＮＡを切断しない制限酵素ＢａｍＨＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩで切断した。期 待されたように、ＨｉｎｄＩＩＩ切断は、ゲル分画およびウイルス特異的プロー ブに対するハイブリダイゼーション後にスメアをもたらした。しかしながら、ゲ ノムＤＮＡを、プロウイルス内で２度切断するＢａｍＨＩで切断した場合、3.6k bの予測された大きさの分離したバンドが、二倍体の宿主細胞ゲノムあたり豊富 なおよそ１個のプロウイルスゲノムで検出された。 組込まれたプロウイルスの構造を、持続性の潜在的機構を詳細に叙述するため にＰＣＲ分析を使用して特徴づけした。野生型およびｒＡＡＶの以前の研究は、 ウイルスの生活環の溶解相および潜伏相での異なるＤＮＡ複製経路を示唆してい る。とりわけ、ヘルパーウイルスの存在下で、ＡＡＶは、先頭と先頭もしくは末 尾と末尾のコンカテマーの合成をもたらす機構により複製して二量体の複製中間 体を形成する。これは、組込まれたプロウイルスゲノムが先頭と末尾のゲノムの 配列により特徴づけられる潜伏感染とよい対照をなす。 骨格筋からのゲノムＤＮＡをＰＣＲ分析にかけてＡＡＶゲノムのコンカテマー の間の結合部を増幅した。組込まれたｒＡＡＶを検出するＰＣＲ法を、組込まれ た形態のｒＡＡＶが典型的に先頭と末尾のコンカテマーとして見出されることを 示すデータを基礎として開発した。とりわけ、ＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノムの ２個の単量体の先頭と末尾の結合部にわたる選択的ＰＣＲ増幅を可能にするオリ ゴヌクレオチドプライマーを合成した。センス鎖プライマー００５（５’−ＡＴ ＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴ−３’；配列番号４）はＳＶ４０ポリア デニル酸化シグナルドメインの塩基対位置4584〜4603に位置した。アンチセンス 鎖プライマー０１３（５’−ＣＡＴＧＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＴＧＡＣＴＡ−３’ ；配列番号２）はＣＭＶプロモーターの塩基対位置497〜478に位置した一方、ア ンチセンス鎖プライマー０１７（５’−ＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣ ＴＣ−３’；配列番号３）はＣＭＶプロモーターの塩基対位置700〜680に位置し た。ＩＴＲが無傷で保持される場合、オリゴヌクレオチド００５＋０１３［配列 番号２］は797bpの断片を増 幅するはずである一方、オリゴヌクレオチド００５および０１７［配列番号３］ は1000bpの断片を増幅するはずである。予測されるＰＣＲ産物の大きさは、プロ ウイルスの結合部が２個のＩＴＲのコピーを含有するという仮定を基礎とするこ とを強調することが重要である。２コピーより少なく有する結合部にわたる増幅 は、従って、大きさが比例してより小さいＰＣＲ産物を生じることができる。 ＰＣＲ反応を、100ngのゲノムＤＮＡの鋳型および0.5μＭのプライマー濃度を 使用して実施した。熱周期(thermocycle)のプロフィルは、94℃１分、52℃１分 、および72℃１分30秒を35周期であり；最初の周期の94℃の変性段階は２分であ った一方、最後の周期の72℃の伸長段階は10分であった。ＰＣＲ産物をアガロー スゲル電気泳動により分析した。 ＰＣＲ反応を、上述されたように、感染後64日に収穫されたＡＡＶ．ＣＭＶＬ ａｃＺで形質導入された筋肉から単離されたゲノムＤＡで実施した。Ｈｅｐｅｓ 緩衝生理的食塩水（ＨＢＳ）を注入された筋肉からのゲノムＤＮＡを、陰性ＰＣ Ｒ対照として使用した。増幅産物は、先頭と先頭もしくは末尾と末尾の結合部に わたるはずであるプライマーを使用した場合に検出されなかった（データは示さ れない）。しかしながら、ＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで形質導入された筋肉からの ＤＮＡを、オリゴヌクレオチド００５および０１３ならびに００５および０１７ を用いて分析した場合、先頭と末尾のコンカテマーの不均一な集団と一致するス メアが検出された（図２Ａおよび２Ｂ）。 ＰＣＲ反応を、組込まれたＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺを含有する細胞系からのゲ ノムＤＮＡを用いてもまた実施した。これらのクローンのプロウイルスの構造は サザンブロット分析により決定されている。そのそれ ぞれが、先頭と末尾で配置された組込まれたＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの最低２個 の単量体のコピーを含有する、３種の細胞系（１０−３．ＡＶ５、１０−３．Ａ Ｖ６および１０−３．ＡＶ１８）を同定した。ＰＣＲ産物の大きさを基礎とすれ ば（プライマーの組００５−０１３を使用して720bpの産物、およびプラィマー の組００５−０１７を使用して930bpの産物）、２種のクローン１０−３．ＡＶ ５および１０−３．ＡＶ６が結合部で1.5コピーのＡＡＶのＩＴＲを含有するよ うである。もうひとっのクローン１０−３．ＡＶ１８は、プライマーの組００５ −０１３を使用して320bpの産物およびプライマーの組００５−０１７を使用し て500bpの産物を生じるＡＡＶのＩＴＲを包含する大きな欠失を含有する。別の 細胞系１０−３．ＡＶ９は、サザンブロッティングによれば、組込まれたＡＡＶ ．ＣＭＶＬａｃＺの単一の単量体のコピーを含有し、かつ、ＰＣＲ産物の非存在 により確認されるとみられる。 かように、安定な形質導入のために選択されたｒＡＡＶに感染した細胞系から のＤＮＡの分析は、無傷の先頭と末尾のコンカテマーについて予測されたものよ り小さな明確なバンドを示した。 Ｄ．構造分析 骨格筋のＤＮＡから回収されたプロウイルスの結合部の詳述された構造分析を 、ＰＣＲ反応からのサブクローニング（図３）、次いで制限酵素分析（図４Ａ〜 ４Ｇ）により実施した。とりわけ、上述されたように得られた筋肉サンプルＢＬ ．１１の一からのＰＣＲサンプルを、挿入物がＥｃｏＲＩ切断部位により隣接さ れた商業的に入手可能なプラスミドｐＣＲＩＩ中に直接ライゲーションした。商 業的に入手可能なコンピテント細菌株ＴＯＰ１０ Ｆ’を、ライゲーション反応 を用いて形質転換 した。事実上、この処置は、ＰＣＲ産物のプラスミドライブラリーをもたらす。 このライブラリーを、十分に単離されたコロニーを与える密度で培養し、そして 、ナイロンメンブレンを上に置くこと、およびＣＭＶプロモーター／エンハンサ ーに対応する³²Ｐ−標識された断片とハイブリダイゼーションさせることにより スクリーニングした。推定の陽性クローンを小スケール培養（２ml）で一夜成長 させた。 ６個の代表的なクローンからのプラスミドＤＮＡを小スケール培養物から抽出 し、そしてＰＣＲ産物全体を遊離させるためにＥｃｏＲＩで、もしくは診断上の 指標としてＳｎａＢＩでのいずれかで切断した。ＳｎａＢＩでの酵素切断はＣＭ Ｖプロモーターにわたる306bpの断片（ＳｎａＢＩ476からＳｎａＢＩ782）を遊 離するはずである。ＩＴＲの結合部（ＳｎａＢＩ142からＳｎａＢＩ476）に位置 する第二の断片の遊離はコンカテマー形成の間に起こる再配置を条件とし、そし て従って、ＩＴＲが欠失されている場合は、大きさが334bp（２個の完全なＩＴ Ｒのコピー）から０bpまでの範囲にわたり得る。 1.5コピーのＡＡＶのＩＴＲを含有すると考えられる細胞系１０−３．ＡＶ５ からのＰＣＲ産物（１０−３．ＡＶ５）もまた、ｐＣＲＩＩ中にクローニングし そして示された酵素で切断した。このサンプルは診断上のＳｎａＢＩ切断の陽性 対照としてはたらく。このサンプルのＥｃｏＲＩでの切断は、730bpのＰＣＲ断 片、ならびに大きさがおよそ500bpの二次的な二重線のバンドを正しく遊離する 。この二次的バンドは、細菌中での複製の間に1.5コピーのＡＡＶのＩＴＲ中で 発生する二次構造による人工産物であると考えられる。ＳｎａＢＩでの陽性対照 の切断は、ＣＭＶプロモーターからの診断上の3O6bpの断片およびＩＴＲの結合 部に 位置する250bpの断片を遊離する。 ＥｃｏＲＩおよびＳｎａＢＩでの６個の個々のクローンの切断は、変動する長 さの欠失が全ての回収された結合部に存在し、かつ主として結合部のＩＴＲに限 られたことを示した。配列分析は、大部分の欠失が隣接するウィルスＤＮＡを伴 うことなく結合部の双方のＩＴＲの部分にわたったことをさらに示した。 Ｅ．蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析 ＦＩＳＨを骨格筋の凍結切片(cryosections)で実施して、注入された組織内の プロウイルスＤＮＡの分布を特徴づけした。処理されたもしくは対照のマウスか らの筋肉の小さな４〜５mmの片をＯＴＣ中に包埋し、そして液体窒素で冷却され た液体イソペンタン中で迅速に凍結させた。10μ厚の凍結された切片を低温ミク ロトーム(cryomicrotome)で切断した。切片を検鏡用に作り、固定し（ヒストチ ョイス(Histochoice)）、そして以前に記述されたプロトコール［グッソーニ(E ．Gussoni)ら、Nat．Biotech.、14:1012-1016(1996)］を使用するインシトゥハ イブリダイゼーションにより蛍光について処理した。隣接する切片をβ−ガラク トシダーゼ活性について染色して筋束中のｌａｃＺ陽性領域を同定した。 ＦＩＳＨのシグナルを定量化するため、ｌａｃＺ陽性領域（β−ガラクトシダ ーゼ活性について隣接する切片を染色することにより測定されるような）を、後 蛍光(epifluorescence)を装備されたニコン マイクロフォト(microphot)ＦｘＡ 顕微鏡下で検査した。切片中のｌａｃＺ陽性領域に対応する個々の筋線維の総数 を標準的位相差(phase contrast)モード下で計数した。同一領域をその後、ロー ダミンイソチオシアネートに適切なフィルターパッケージを使用して蛍光顕微鏡 検査下に検査し た。点状染色を示す筋細胞核の数を記録した。各陽性核を位相差下で検査してそ れが筋線維から生じたことを確認した。対照については、ｌａｃＺ陰性領域（β −ガラクトシダーゼ活性を欠いた同一の切片中の領域もしくは模擬トランスフェ クションされた筋肉切片）を検査し、そして類似の様式で定量した。 共焦点顕微鏡検査のために、切片を、クリプトンーアルゴンレーザー（ライカ レーザーテクニク(Leica lasertechnik)、ＧｍｂＨ）、ＴＳＣおよびヴォクセ ル ビュー シリコン グラフィクス(Voxel View Silicon graphics)セントラ ルワークステーションを装備されたライカ共焦点レーザー顕微鏡で浸油対物レン ズ（100倍）下に観察した。ローダミンチャンネル下で観察された画像を視差干 渉対比(differential interference contrast)下でもまた連続して観察して、筋 細胞核を伴う蛍光シグナルの位置を確認した。視差対比および蛍光の画像をその 後、ＴＣＳセントラルワークステーションで連続して重ね合わせ、そして画像処 理のためシリコン グラフィクス ワークステーションに転送した。処理された 画像をストアし、そしてフォトショップ(Photoshop)ソフトウェアを使用して印 刷した。 連続的切片を、β−ガラクトシダーゼ活性について二者択一的に染色して導入 遺伝子を発現する筋線維を同定し、また、ビオチニル化プロウイルスプローブと ハイブリダイゼーションさせてプロウイルスゲノムの分布の位置をつきとめた。 分離した蛍光シグナルが、β−ガラクトシダーゼを発現する筋線維の若干の核で 検出された。３個の連続的切片の検分は、β−ガラクトシダーゼを発現する線維 の53／1006（5.3％）の核およびβ−ガラクトシダーゼを発現しない線維の０／3 77の核でハイブ リダイゼーションを示した。ハイブリダイゼーションは未感染の動物からの組織 で検出されなかった（データは示されない）。 ＦＩＳＨによるウイルスゲノムを検出する能力はこの分析に別の次元を加えた 。ハイブリダイゼーションの単一の病巣(single foci)が、β−ガラクトシダー ゼを発現する筋線維内に含有される全ての核の５％で検出された。これは、とり わけ大きさが12kb未満の標的配列についてのこの技術の感受性の限界のため［ト ラスク(B.J．Trask)、Trends Genet.、7:149-154(1991)］、形質導入された核の 過小評価であるという可能性がある。ＦＩＳＨ分析の意味は興味深い。サザンに より測定されるような二倍体の筋原細胞ゲノムあたり１個のプロウイルスゲノム の存在は、ＡＡＶゲノムをもつ５％の核酸を立証したＦＩＳＨの結果と一緒にな って、平均的コンカテマーが最小で10個のプロウイルスゲノムを含むことを予測 することができた。これらの研究は、ベクターで形質導入された核の部位からは るか遠くに広がるβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を示し、最低10μｍの拡大され た核ドメインを示唆する。これは、細胞質タンパク質についての拡大された核ド メインを報告した以前の研究［ブラウ(H.M．Blau)ら、Adv．Exp．Med．& Biol. 、280:167-172(1990)］と矛盾しない。筋線維のシンシチウム構造内の導入遺伝 子発現の拡大された核ドメインは、いくつかの理由から遺伝子治療の応用に重要 である。形質導入事象からの組換えタンパク質の正味の収量は、タンパク質の分 布が膜障壁によりより少なく束縛されるシンシチウムにおいてより高くありうる 。さらに、この系は、誘導可能なプロモーターを伴うもののような、複数の組換 えタンパク質の発現を必要とするベクター系で利点を有する［ハウ(J.R．Howe) ら、J．Biol.Chem.、270:14168-14174(1995)；リ ヴェラ(V.M．Rivera)ら、Nat．Med.、2:1028-1032(1996)］。筋においては、組 換えタンパク質の共発現は、重なり合うドメインの広範な網状構造のため、単一 の核を伴う共形質導入を必要としない。 実施例４−導入遺伝子に向けられる免疫応答は、ヘルパーを含まないｒＡＡＶが 筋に向けられる遺伝子送達に使用される場合に最小限にされる ヘルパーウイルスの非存在下に投与される、ｌａｃＺを含有するｒＡＡＶベク ターから達成される筋細胞でのｌａｃＺ発現の安定性は、筋線維でアデノウイル スベクターから発現されたβ−ガラクトシダーゼに対して装備される破壊的な免 疫応答を立証した以前の研究に照らして、驚くべきものであった。導入遺伝子特 異的な免疫応答を、ウェスタン分析を使用して抗β−ガラクトシダーゼ抗体の血 清レベルを測定することによりさらに研究した。 血液を、ウイルス注入後第30日に剖検されたＣ５７ＢＬ／６およびＲＯＳＡ− ２６マウス（ジャクソン ラボラトリーズ(Jackson Laboratories)、メーン州バ ーハーバー）から採取し、そして血清を収集した。ＲＯＳＡ−２６は大腸菌(E． coli)のβ−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡをもつトランスジェニック系であり、 かつ、１２９バックグラウンドで発達された。血清を、組換えＬａｃＺアデノウ イルス（Ｈ５．０１０ＣＭＶＬａｃＺ、25μｌのＨＢＳ中５×10⁸ｐｆｕ）もし くは組換えＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ（上述されたような）のいずれかの筋肉内注 入を受けたＣ５７ＢＬ／６マウスからもまた収穫した。双方のベクターは、ＣＭ Ｖに動かされるミニ遺伝子から大腸菌(E．coli)のβ−ガラクトシダーゼを発現 する。大腸菌(E．coli)からの精製されたβ−ガラクトシダーゼ（シグマ(Sigma) ）のアリコート（５μｇ）を10％ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル（５μｇ／レーン）上で分離し、そしてニトロセルロースメンブレン（ ハイボンド(Hybond)−ＥＣＬ、アマーシャム(Amersham)）に電気泳動的に転写し た。このブロットを、ブロット(blotto)［５％脱脂乳、50mMトリス−塩酸（ｐＨ 8.0）、２mM塩化カルシウムおよび0.05％トゥイーン(Tween)−２０］とともに室 温で２時間インキュベーションして、利用可能な部位をブロッキングした。個々 のレーンを切断し、そして血清（ブロット(blotto)中で200倍希釈された）とと もに室温で１時間インキュベーションした。抗原−抗体複合体の位置推定を、ヤ ギ抗マウスワサビペルオキシダーゼ結合物を添加すること、次いでＥＣＬ検出（ アマーシャム(Amersham)）により成し遂げた。切断されたレーンは、ＥＣＬ試薬 の添加およびフィルムドキュメンテーションに先立ち、マイラー(mylar)シート 上で再集成した。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨格筋へのＨ５．０１０ＣＭＶ１ａｃＺ Ｅ１欠失ア デノウイルスの筋肉内注入は、血清中での本質的なβ−ガラクトシダーゼ抗体の 蓄積をもたらした。これは、β−ガラクトシダーゼに対し免疫寛容である挿入さ れたｌａｃＺ遺伝子をもつ、ＭＨＣが同一のトランスジェニック動物で起こらな かった。意味のあることに、Ｃ５７ＢＬ／６もｌａｃＺトランスジェニック動物 も、ＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺの筋肉内注入後にβ−ガラクトシダーゼに対する抗 体を発生しなかった。 実施例５−筋細胞でのアデノウイルスおよびＡＡＶベクターの比較研究 組換えＡＡＶおよびアデノウイルスにより媒介される、筋肉に向けられた遺伝 子導入の生物学の研究は、アデノウイルスは抗原提示細胞（ＡＰＣ）を感染させ るがしかしＡＡＶはさせないことを立証する。抗原提 示細胞は、破壊的な細胞性および体液性免疫につながる免疫学的応答のカスケー ドを導き出す。 実験的範例を、組換えＡＡＶおよびアデノウイルスを用いる骨格筋に向けられ た遺伝子導入に対する宿主応答の特異的差異を定義するために構築した。最終目 標は、組換えアデノウイルスベクターから発現された（しかしＡＡＶベクターか ら発現されない）場合の導入遺伝子産物（すなわちβ−ガラクトシダーゼ）に対 し向けられる優先的な免疫学的活性化につながるこれらのベクター系の生物学で の差異を詳細に叙述することであった。 一般的アプローチは、ｌａｃＺを発現するＡＡＶをマウスの右脚に注入するこ とであった。これは効率的かつ安定な遺伝子発現を与えることが上の実施例で示 されている。他の実験群では、動物は、破壊的な細胞性および体液性免疫につな がるＡｄに対し向けられた免疫応答の成分を定義するために、ベクターおよび細 胞の多様な組み合わせに加えてｒＡＡＶを受ける。これらの実験操作の効果を、 ｒＡＡＶを移植された(engrafted)筋線維の安定性に対するそれらの影響を評価 すること、ならびに他の免疫学的パラメーターを測定することにより追跡した。 筋線維中でβ−ｇａｌに対する免疫を導き出すいかなる介入も、ＡＡＶで形質導 入された筋肉での導入遺伝子の発現の安定性、および炎症の発生を評価すること により検出され得る。 ４実験群を、下に要約されるように、この研究のために創り出した。ウイルス を、上の実施例２に記述されたものに本質的に類似の技術を使用してマウスに注 入した。すなわち、ウイルスをリン酸緩衝生理的食塩水中に懸濁し、そして脛側 骨前方筋中に直接注入した。動物を剖検した 場合に、筋組織を、液体窒素冷却されたイソペンタン中で急速凍結させ、そして ６μｍ厚で薄片に切った一方、血清サンプルおよび排出する(draining)鼠蹊部リ ンパ節を免疫学的アッセイのため収穫した。 リンパ球を鼠蹊部リンパ節から収穫し、そして標準的な６時間⁵¹クロム（Ｃｒ ）放出アッセイを、本質的に下述されるように、Ｖ型底の96穴プレート中の200 μｌのＤＭＥＭ中の標的細胞（Ｃ５７ＳＶ、Ｈ−２^b）に対するエフェクター細 胞の多様な比を使用して実施した。エフェクター細胞と混合するのに先立ち、標 的細胞は、アルカリホスファターゼを発現するアデノウイルス（ＡｄＡＬＰ）に 感染させたか、もしくは、100μＣｉの⁵¹Ｃｒで標識されたｌａｃＺを発現する レトロウイルスｐＬＪー１ａｃＺで安定に形質導入したかのいずれかであり、そ してウェルあたり細胞５×10³個で使用した。６時間のインキュベーション後、1 00μｌの上清のアリコートをγ線計数装置で計数した。第１〜３群についての結 果を図５Ａ〜５Ｃに提供する。 凍結された切片（６μｍ）をメタノール中で固定し、そして抗ＣＤ４および抗 ＣＤ８抗体を用いて染色した。形態計測的分析を実施して、切片あたりのＣＤ８ ＋細胞およびＣＤ４＋細胞の数を定量した。 サイトカイン放出アッセイを本質的に以下のように実施した。リンパ球を、β −ガラクトシダーゼ、精製されたＡＡＶもしくはアデノウイルスタイプ５で40時 間再刺激した。細胞を含まない上清（100μｌ）をＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ の分泌についてアッセイした。増殖を、８時間の³Ｈ−チミジン（0.50μＣｉ／ ウェル）のパルスにより72時間後に測定した。４群についての結果を図６Ａおよ び６Ｂに提供する。 中和抗体アッセイは本質的に以下のように実施した。マウス血清サン プルを56℃で30分間インキュベーションして補体を不活性化し、そしてその後、 20倍から開始する２倍の段階でＤＭＥＭ中で希釈した。各血清希釈物（100μｌ ）をβ−ガラクトシダーゼもしくはアデノウイルスタイプ５と混合した。37℃で 60分のインキュベーション後、20％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ10Oμｌを各ウェ ルに添加した。細胞を固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現について次の日 に染色した。細胞の全てが血清サンプルの非存在下に青色に染色した。４群につ いての結果を図６Ａおよび６Ｂに提供する。 第１群のマウスは、他の介入を伴わず、右脚に、実施例１に記述されたように 製造されたＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺを受けた。ＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺ単独での 形質導入は、リンパ球浸潤を伴わない高レベルの安定な遺伝子導入（28日でさえ 明らか）につながった。ＣＤ８Ｔ細胞の活性化は検出されなかった（図５）。抗 原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞［すなわち、ウイルスもしくはβ−ガラクトシダーゼ （図６Ａおよび６Ｂ）］も検出されなかった。抗体は、β−ガラクトシダーゼも しくはアデノウイルスに対し生じられなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。 第２群のマウスは、右脚にＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺおよび左脚にｌａｃＺを発 現するアデノウイルス（Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ）を受けた。この群の最終 目標は、反対側のＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺで形質導入された脚の生物学に対する その影響により立証されるような、Ａｄに感染した筋線維に対する免疫学的応答 が全身性であるかどうかを決定することであった。明らかに、アデノウイルスの ｌａｃＺ処理はβ−ガラクトシダーゼに対する免疫応答を誘導し、これは、ＡＡ ＶでｌａｃＺが形質導入された線維の破壊につながった。驚くべきことではない が、これ は、ＡＡＶで形質導入された脚へのＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞の浸潤、な らびアデノウイルスおよびβ−ガラクトシダーゼ双方の抗原に対する細胞傷害性 Ｔリンパ球の活性化を伴った（図８）。ＡＡＶ、Ａｄおよびβ−ｇａｌ抗原に特 異的な活性化されたＣＤ４Ｔ細胞、ならびにアデノウイルスおよびβ−ガラクト シダーゼに特異的な抗体もまた観察された。 第３群の動物は右脚にＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺおよびＡｄ ＢｇｌＩＩの混合 物を受けた。ＡｄＢｄｌＩＩは組換え遺伝子を発現しないＥ１欠失アデノウイル スである。この群の最終目標は、アデノウイルスがこの設定でＡＡＶのｌａｃＺ に対する免疫を導き出しうるアジュバント効果を提供するかどうかを決定するこ とであった。これは導入遺伝子発現の喪失にっながらなかったが、とは言え、Ｃ Ｄ８Ｔ細胞の本質的な浸潤およびウイルス抗原に対する（しかしβ−ガラクトシ ダーゼに対してでない）ＣＤ４Ｔ細胞の若干の活性化が存在した（図６Ａ〜６Ｂ ）。期待されたように、抗体はアデノウイルスに対して生じられたが、しかしβ −ガラクトシダーゼに対しては生じられなかった（図７Ａ〜７Ｂ）。 第４群の動物は、右脚にＡＡＶ．ＣＭＶｌａｃＺを受け、また、実験を受けた ことがない動物から収穫された抗原提示細胞を養子的に移入させ、かつエクスビ ボでアデノウイルスに感染させた。 これらの動物は、導入遺伝子発現の喪失により立証されたように、β−ｇａｌ に対する活発かつ有効な免疫学的応答、ならびにＣＤ８およびＣＤ４のＴ細胞の 膨大な浸潤を装備した。ＣＤ４Ｔ細胞は、図６Ａ〜６Ｂに示されるように、この 実験でβ−ｇａｌに対し活性化され、また、図７Ａ〜７Ｂに示されるように、抗 β−ガラクトシダーゼ抗体が生じら れた。 実施例６−骨格筋細胞中への第IX因子を含有する精製されたｒＡＡＶベクターの 形質導入、および治療的に有用なレベルかつ細胞傷害性の免疫応答を導き出すこ とのないＦ．ＩＸの発現 本実施例で提供されるデータは、本発明の方法が、形質導入された細胞に対し 細胞傷害性の免疫応答の非存在下に免疫能力のあるおよび免疫能力のない双方の 対象で治療的導入遺伝子Ｆ．ＩＸの持続性の発現を提供することを立証する。さ らに、免疫能力のない動物の血清で達成されるタンパク質レベルは治療効を達成 するのに十分である。従って、血友病Ｂの者のような免疫能力のない患者でのｒ ＡＡＶベクターを介する筋細胞中でのヒトＦ．ＩＸの持続性発現は、その疾患の 患者にＦ．ＩＸを送達するのに有用である。 Ａ．精製されたｒＡＡＶの調製 以下のインビボ実験で使用されたｒＡＡＶベクターは、サイトメガロウイルス （ＣＭＶ）の前初期遺伝子プロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０の転写終 止シグナルの転写制御下にイントロンＩの一部分を包含するヒトＦ．ＩＸのｃＤ ＮＡを含有する発現カセットをもつ。ＡＡＶのＩＴＲ配列により隣接されるこの 発現カセットを含有し、かつＡＡＶタンパク質のコーディング配列を完全に欠く 当該ベクターを、以下のように構築した。 組換えＡＡＶを、フィッシャー(Fisher)ら、J．Virol.、70:520-532(1996)に より記述されたように、Ｅ１欠失アデノウイルスに感染したヒト胎児腎（２９３ ）細胞中へのＦ．ＩＸシスプラスミド（ｐＡＡＶ−ＦＩＸ）およびトランスに作 用するプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ［スクリモ ウスキ(A.W．Skulimowski)とサムルスキ(R.J．Samulski)、Method．Mol．Genet. 、7:7-12(1995)］のコトランスフェクションにより生じさせた。ｐＡＡＶ−ＦＩ Ｘはｐｓｕｂ２０１［スクリモウスキ(Skulimowski)とサムルスキ(Samu1ski)、 上に引用された］由来であり、かつ、ＡＡＶのＩＴＲ配列により隣接される、Ｃ ＭＶプロモーター／エンハンサー、イントロンＩの1.4kbの断片を包含するヒト Ｆ．ＩＸのコーディング配列［クラチ(S．Kurachi)ら、J．Biol．Chem.、270:52 76-5281(1995)］、およびＳＶ４０ポリアデニル酸化シグナルを含有する。ＡＡ Ｖのｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子機能はｐＡＡＶ／Ａｄによりトランスに供給し た。Ｅ１欠失アデノウイルスは、このヘルパーウイルスでのｒＡＡＶストックの 潜在的汚染を追跡するβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）もしくはアルカリホス ファターゼ（ＡＬＰ）レポーター遺伝子を含有した。細胞をトランスフェクショ ン48時間後に超音波処理により溶解し、そして放出されたｒＡＡＶ粒子を、フィ ッシャー(Fisher)ら、上に引用された、により記述されたように４回の塩化セシ ウム密度勾配遠心分離により精製した。 生じるｒＡＡＶ−Ｆ．ＩＸ粒子は1.37〜1.40g/mlの密度を有した。精製された ｒＡＡＶ−Ｆ．ＩＸの力価を、ＣＭＶプロモーターもしくはイントロンＩのいず れかの配列に特異的なプローブ、および既知濃度のｐＡＡＶ−Ｆ．ＩＸプラスミ ドＤＮＡの標準品を使用するスロットブロットハイブリダイゼーションにより測 定した。インビトロで細胞に形質導入するｒＡＡＶ−Ｆ．ＩＸの能力を、成長す るＨｅＬａ細胞に形質導入すること、およびｈＦ．ＩＸに特異的なＥＬＩＳＡ［ ウォルター(J．Walter)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、93:3056-3061(1996) ］で感染 後36時間の培養上清中のｈＦ．ＩＸの濃度を測定することにより確認した。ｒＡ ＡＶ−Ｆ．ＩＸ（10¹²〜10¹³ゲノム／ml）を、５％グリセロールを含有するＨＥ ＰＥＳ緩衝生理的食塩水、ｐＨ7.8中で−79℃で保存した。 精製されたｒＡＡＶ−Ｆ．ＩＸは、慣例的に、フィッシャー(Fisher)ら、上に 引用された、により記述されたように、２９３細胞の形質導入、次いでアルカリ ホスファターゼもしくはβ−ガラクトシダーゼについて染色することにより分析 された場合に、検出可能な量の汚染するアデノウイルスを欠いた。野生型ＡＡＶ は、10⁹ゲノムのｒＡＡＶ−Ｆ．ＩＸあたり１未満の感染単位で検出された。野 生型ＡＡＶについてのアッセイは以下のようであった。すなわち、チャンバース ライド上で成長された２９３細胞を、アデノウイルスおよび精製されたｒＡＡＶ −Ｆ．ＩＸのアリコートで共感染させ、そして感染後24時間に免疫蛍光染色のた め固定した。ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（ アメリカン リサーチ プロダクツ(American Research Products)、マサチュー セッツ州ベルモント）は一次抗体として、また、40倍希釈の抗マウスＩｇＧ（ダ コー コーポレーション(DAKO Corporation)、カリフォルニア州カーピンテリア ）は二次抗体としてはたらいた。 Ｂ．骨格筋中へのｒＡＡＶの導入 ｒＡＡＶの筋肉内注入のため選択されたマウスの系統は、Ｃ５７ＢＬ／６（チ ャールズ リバー ラボラトリーズ(Charles River Laboratories)、マサチュー セッツ州ウィルミントン）およびＢ６、１２９、Ｒａｇ１（ジャクソン ラボラ トリーズ(Jackson Laboratories)、メーン州バーハーバー）であった。雌性マウ ス（４〜６週齢）をケタミン（70mg /kg）およびキシラジン（10mg/kg）の腹腔内注入で麻酔し、そして１cmの長軸方 向の切開を下肢に作成した。ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水、 ｐＨ7.8中、動物あたり２×10¹¹もしくは１×10¹⁰ベクターゲノム）を、ハミル トンシリンジを使用して各脚の脛側骨前方筋（25μｌ）および大腿四頭筋（50μ ｌ）に注入した。切開を４−０ヴィクリル(Vicryl)縫合糸で閉鎖した。血液サン プルを、眼窩後静脈叢からミクロヘマトクリット毛細管(microhematocrit capil lary tube)中に７日間隔で収集し、そして、血漿をＥＬＩＳＡによりｈＦ．ＩＸ についてアッセイした（下のＣ部）。免疫蛍光染色（下のＤ部）およびＤＮＡ分 析（下のＦ部）のため、動物を選択された時間点で殺し、そして注入されたおよ び注入されない筋組織を切除した。組織をＯＴＣ包埋コンパウンド中に置き、液 体窒素冷却されたイソペンタン中で７秒間急速凍結し、そして直ちに液体窒素に 移した。 Ｃ．ＥＬＩＳＡによるヒトＦ．ＩＸの検出 マウス血漿中のヒトＦ．ＩＸ抗原を、ウォルター(Walter)ら、上に引用された 、により記述されたように、ＥＬＩＳＡにより測定した。このＥＬＩＳＡはマウ スＦ．ＩＸと交差反応しなかった。全てのサンプルを複製物(duplicate)で測定 した。注入されたマウス筋肉からのタンパク質抽出物を、ロイペプチン（0.5mg/ ml）を含有するリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中での筋肉の浸軟、次いで超 音波処理により調製した。 細胞破片を微小遠心分離により除去し、そしてタンパク質抽出物の10倍希釈物を ＥＬＩＳＡによりｈＦ．ＩＸについてアッセイした。ｒＡＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ （上の実施例１を参照）を注入された筋肉からの抽出物を陰性対象として使用し た。タンパク質濃度をバイオラッド(BIORAD)アッ セイ（バイオラッド(Bio-Rad)、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で測定した 。 Ｄ．免疫蛍光染色 組織切片の免疫蛍光染色を実施するため、筋組織の凍結切片（６μｍ）をＰＢ Ｓ、ｐＨ7.4中３％パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、ＰＢＳ中で５分間 すすぎ、メタノール中で10分間インキュベーションし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、 そしてその後、ＰＢＳ／３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１時間ブロッキ ングした。切片をその後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で1000倍希釈された、アフィニ ティ精製されたヤギ抗ヒトＦ．ＩＸ抗体（アフィニティ バイオロジカルズ(Aff inity Biologicals)）とともに一夜インキュベーションした。ＰＢＳ／１％ＢＳ Ａ中で３回洗浄（各10分）後、二次抗体を90分間適用した（ＦＩＴＣ結合ウサギ 抗ヤギＩｇＧ、ダコー コーポレーション(DAKO Corporation)、ＰＢＳ／１％Ｂ ＳＡ中で200倍希釈された）。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で３回の追加洗浄後、切片 を蒸留水中ですすぎ、風乾し、そしてフルオロマウント(Fluoromount)Ｇ検鏡固 定媒体（フィッシャー サイエンティフィク（Fisher Scientific)）で検鏡用に 作った。全てのインキュベーション段階は、一次抗体とのインキュベーション（ ４℃）を除いて室温でであった。同一のプロトコールを、切片を一次抗体として 500倍希釈のウサギ抗ヒトコラーゲンIV（ケミコン(Chemicon)、カリフォルニア 州テメキュラ）および二次抗体としてＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ（ダコー コ ーポレーション(DAKO Corporation)）で染色した場合に適用した。同時局所化(c o-localization)研究のため、ＦＩＴＣに結合されたヤギ抗ｈＦ．ＩＸ抗体（ア フィニティ バイオロジカルズ(Affinity Biologicals)）を抗 コラーゲンIV抗体と同時に適用し、そしてローダミン結合抗ウサギＩｇＧ（ケミ コン(Chemicon)）を使用してコラーゲンIV−抗体複合体を検出した。蛍光顕微鏡 検査をニコンＦＸＡ顕微鏡を用いて実施した。 Ｅ．ｈＦ．ＩＸに対する循環抗体についての試験 ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸを筋肉内注入されたＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿サンプルを 、ＥＬＩＳＡを使用してｈＦ．ＩＸに対する抗体の存在について試験した。マイ クロタイタープレートをヒトＦ．ＩＸ（0.1M炭酸水素ナトリウム、ｐＨ9.2中１ μｇ/ml）で被覆した。希釈血漿サンプル（16倍）を同一物で(in duplicate)適 用し、そしてｈＦ．ＩＸに対する抗体を、2000倍希釈のワサビペルオキシダーゼ 結合抗マウスＩｇＧ（ザイメッド(Zymed)、カリフォルニア州サンフランシスコ ）で検出した。緩衝液条件はウォルター(Walter)ら、上に引用された、に記述さ れたようであった。抗ｈＦ．ＩＸのレベルを、最終濃度１μｇ/mlに希釈された モノクローナルマウス抗ｈＦ．ＩＸ（ベーリンガー マンハイム(Boehringer Ma nnheim)）との吸光度値の比較により推定した。抗ｈＦ．ＩＸの存在を立証する ウェスタンブロットを、ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim))を二次抗体として使用し、そ れによりＥＣＬ試薬（アマーシャム(Amersham)）でのｈＦ．ＩＸ−抗体複合体の 検出を可能にすることを除いて、ダイ(Dai)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、9 2:1401-1405(1995)により概説されたように実施した。マウス血漿の希釈は500倍 であった。 Ｆ．ＤＮＡ分析 ゲノムＤＮＡを、サンブルック(Sambrook)ら、Molecular Cloning:ALaborator y Manual、コールド スプリング ハーバー プレス(Co1d Spring Harbor Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)によ り哺乳類の組織について記述されたように、注入された筋組織から単離した。応 用の実施例３に記述されたように、ＰＣＲ反応を、ｒＡＡＶのタンデム反復の先 頭と末尾の結合部を増幅するために実施した。前向き(forward)プライマー００ ５［配列番号４］はＳＶ４０ポリアデニル酸化シグナル（塩基対位置8014〜8033 ）をアニーリングし、また、逆向き(reverse)プライマー０１３［配列番号２］ および０１７［配列番号３］はＣＭＶプロモーター（塩基対位置4625〜4606およ び4828〜4809）に結合する。ＰＣＲ反応を、1.5mM塩化マグネシウムおよび0.5μ Ｍのプライマー対００５／０１３もしくは００５／０１７を包含する100μｌの 総反応体積中の100ngのゲノムＤＮＡを使用して実施した。最初の変性段階（94 ℃４分間）の後、35周期の以下のプロフィルを実施した。すなわち、94℃で１分 間の変性、52℃で１分間のアニーリング、72℃で90秒間の伸長（最終周期の間は 10分）。ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａクローニングキット（インヴィトロジェン(Invit rogen)、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してクローニングした（ＤＮＡ 配列分析のため）。サザンブロットハイブリダイゼーションを、ＣＭＶプロモー ター（ＰＣＲ断片へのハイブリダイゼーションのため）、もしくはｒＡＡＶ−Ｆ ．ＩＸに存在するようなｈＦ．ＩＸのイントロンＩ（ゲノムのマウスＤＮＡへの ハイブリダイゼーションのため）に特異的な、³²Ｐ−ｄＣＴＰランダムプライマ ー標識されたプローブを使用して実施した。 Ｇ．免疫能力のあるマウスでのｈＦ．ＩＸの発現の結果 免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６マウスにｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸを筋肉内注入し 、そして動物を注入後１ヶ月に殺した。注入された筋（脛側骨 前方筋および大腿四頭筋）からのタンパク質抽出物でのＥＬＩＳＡは、組織１mg あたり1.8〜2.1ngのｈＦ．ＩＸ（タンパク質１mgあたり40〜50ngのｈＦ．ＩＸ） の存在を立証した。筋組織におけるｈＦ．ＩＸの発現を、組織切片での免疫蛍光 研究により確認した。 免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６マウスにｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸを筋肉内注入し 、そして動物を注入後３ヶ月に殺した。第IX因子は注入された筋肉で検出されな かった。第IX因子は対照すなわちｒＡＡＶ−ｌａｃＺを注入された筋肉で検出さ れなかった。ヒトＦ．ＩＸの発現がＣ５７ＢＬ／６マウスの筋線維中で注入後３ ヶ月に検出された（注入部位あたり3.3×10¹⁰ベクターゲノム；倍率200倍）。Ｆ ．ＩＸは筋線維それ自身においてのみならず、しかしそれが蓄積するようである 線維の間の間隙の空間にも同様に存在することに注意せよ。 興味深いことに、この染色パターンは、ヒトコラーゲンIVに対するポリクロー ナル抗体（間隙の空間もまた染色した）で見られたものに同一であった。ｒＡＡ Ｖ−ｈＦ．ＩＸでの感染（注入部位あたり3.3×10¹⁰ゲノム）１ヶ月後の筋肉の 染色は、ヒトコラーゲンIVに対する抗体で良好に染色した（データは示されない ）。コラーゲンIVは最近、ヒトＦ．ＩＸの結合タンパク質として同定された［チ ュン(W.-F．Cheung)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、93:11068-11073(1996)］ 。 免疫能力のあるマウスでの初期実験は、注入された筋における高レベルの遺伝 子導入およびｈＦ．ＩＸの安定な発現にもかかわらず、ＥＬＩＳＡにより循環中 で有意の量のｈＦ．ＩＸを検出することが可能でなかったことを立証した。図８ を参照。さらなる実験は、これらの動物が循環する外来タンパク質に対する高力 価抗体を発生していたことを立証した。 例えば、同一の血漿サンプルをヒトＦ．ＩＸに対する抗体について試験した場合 、注入後第11日に開始する強い抗体応答が全ての注入された動物でみられた。図 ９を参照。ウェスタンブロット分析を使用して、高レベルの循環抗体が実験の期 間の間持続していたことが見出された。 この知見は、異なるベクターすなわちｈＦ．ＩＸを発現するアデノウイルスベ クターの異なる投与経路すなわち静脈内注入が、異なる免疫応答を遂げた、すな わちｈＦ．ＩＸに対する中和抗体の形成を引き起こさなかった、われわれの以前 に報告された経験（ウォルター(Walter)ら、上に引用された）とよい対照をなし た。 抗体形成を誘導するのに必要とされるタンパク質発現のレベルは、しかしなが ら極めて低い。ウェスタンブロットアッセイはＥＬＩＳＡより幾分より小さく感 受性であるが、しかし、注入後18日に始まる上昇する抗体力価であると思われる ものを証明する。かように、免疫能力のある動物において、初期の時間点での検 出可能なｈＦ．ＩＸ発現の非存在は筋肉でのｒＡＡＶ発現の生物学の結果である 一方、循環中での検出可能なＦ．ＩＸのその後の非存在は外来タンパク質に対す る抗体産生から生じる。にもかかわらず、血清の抗体応答は導入遺伝子を発現す る細胞に対し向けられた細胞傷害性の免疫応答を伴わなかった。実際、炎症も広 範囲の組織損傷も、上で論考された組織切片のいずれでもＨ＆Ｅ染色により分析 された切片でも観察されなかった（データは示されない）。これは、導入遺伝子 をもつ組換えアデノウイルスの骨格筋の注入により導き出された免疫応答［ダイ (Dai)ら、上に引用された；ヤン(Y．Yang)ら、Hum．Molec．Genet.、5:1703-171 2（1996）;シャオ(X．Xiao)ら、J．Virol.、70:8098-8108(1996)］とよい対照を なす。 Ｈ．免疫不全マウスにおけるｈＦ．ＩＸの発現 ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸを、リコンビナーゼ活性化遺伝子１中の突然変異についてホ モ接合であるＲａｇ１マウスの筋に送達させた。これらの動物は、従って、重篤 な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに機能的に同等であり、かつ、成熟Ｂもしく はＴ細胞を産生しない。動物あたり２×10¹¹個のｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸベクター ゲノムの用量は、マウス血漿中でのｈＦ．ＩＸの安定な発現をもたらした。図１ ０を参照。ヒトＦ．ＩＸは、最初に、注入後第２週にＥＬＩＳＡにより検出可能 であり、そしてその後徐々に上昇した。全ての動物での血漿レベルは、注入後５ ないし７週間でマウス血漿１mlあたり200ないし350ngのｈＦ．ＩＸの治療レベル のＦ．ＩＸの安定状態に達した。このレベルは実験の期間（注入後４ヶ月）の間 維持された。全体で１×10¹⁰個のｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸベクターゲノムを注入し た場合、発現は３ないし４倍より低かったが、しかし若干の動物についてなお治 療レベル（＞100ng/ml）に達した。図１１を参照。血漿中の正常の循環レベルの ４〜７％に相当するこれらのレベルは十分に治療範囲内であり、また、本発明の 方法が免疫不全を伴う疾患である血友病の治療に実行可能であることを立証する 。 Ｉ．ＤＮＡ分析の結果 注入された筋組織からのゲノムＤＮＡを注入後６ないし８週に単離した。導入 されたベクターＤＮＡの存在は、1.4kbのイントロンＩ配列全体を包含するベク ター構築物から1.8kbの断片を遊離するＥｃｏＲＶでの切断により立証された。 イントロンＩに特異的なプローブはこの断片にハイブリダイゼーションし、かつ 、注入されない動物からのマウスＤＮＡに交差ハイブリダイゼーションしなかっ た。切断されないＤＮＡは 高分子量ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションシグナルとして見えた。さらに、形 質導入された細胞に存在する組換えＡＡＶの先頭と末尾のコンカテマーの結合部 配列を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー（図１２）は、ＡＡＶ−Ｆ．Ｉ Ｘで形質導入された組織（免疫不全および免疫能力のある動物の脛側骨前方筋お よび大腿四頭筋）から単離された筋肉のＤＮＡからのこうした配列をうまく増幅 した。このＰＣＲ産物を、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーに特異的なプロー ブでのサザンブロットハイブリダイゼーションにより可視化した。プライマー対 ００５−０１３は1.0kbおよびより小さかった断片を生じ；プライマー対００５ −０１７は1.2kbおよびより小さかった断片を増幅した。期待されたように、こ れらのＰＣＲ反応は、これらのタンデム反復中に存在するＡＡＶゲノムの不正確 な結合［マクラフリン(S.K．McLaughlin)ら、J．Virol.、62:1963-1973(1988)］ のため、上に示された大きさの明確なバンドでなく、しかしむしろ予測されたよ うな最大の大きさをもつ一連の増幅産物をもたらした。不正確な結合は、クロー ニングされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定により確認されるような、結合部位で のＩＴＲ配列の変動性の欠失から生じる（データは示されない）。 Ｊ．ＰＣＲ研究 ＡＡＶゲノムの先頭と先頭および末尾と末尾の配置がウイルス複製の間に起こ り得る一方［バーンズ(K．I．Berns)、Microbiol．Rev.、54:316-329(1990)］、 先頭と末尾の配列は、より典型的には、潜伏感染の間に形質導入された細胞の染 色体ＤＮＡ中に組込まれているＡＡＶに関連する［マクラフリン(S.K．McLaughl in)ら、J．Virol.、62:1963-1973（1988）;トラチン(J.D．Tratschin)ら、Mol． Cell Biol.、5:3251-326 0（1985）;ムチカ(N．Muzcyka)、Current Topics in Microbiology and Immunol ogy、158:97-129(1992)］。 切断されないｒＡＡＶを注入された筋細胞のＤＮＡでのサザンブロットのデー タは、注入後６週の宿主細胞のゲノムＤＮＡ由来のｒＡＡＶのＤＮＡが高分子量 種として存在することを立証した。制限されたＤＮＡでみられるより大きなシグ ナル強度は、断片がゲノムＤＮＡの大部分から分離される場合に暴露する(unmas king)効果から生じるようである［シャオ(X．Xiao)ら、J．Virol.、70:8089-810 8(1996)］。この知見、すなわち高分子量ＤＮＡについてのハイブリダイゼーシ ョンシグナルの存在は、ＰＣＲのデータのように、形質導入の間に起こる組込み 事象と矛盾しない。この節およびＩ節で論考されたｒＡＡＶの組込み状態もまた 、導入遺伝子の安定性および持続性発現に寄与するようである。 実施例７−骨格筋細胞に投与されたｒＡＡＶを使用するＡｐｏＥの発現 以下の実施例は、本発明に従ったｒＡＡＶベクターの骨格筋への導入による、 別の治療的導入遺伝子産物すなわちアテローム硬化症の治療で有用なタンパク質 、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の持続性発現を立証する。再度、破壊的な ＣＴＬ応答の非存在が導入遺伝子産物の持続性発現を可能にする。 Ａ．ｒＡＡＶの構築 分泌性タンパク質ヒトＡｐｏＥをコードする組換えＡＡＶベクターを、Ｆ．Ｉ Ｘについて上述されたものに類似の様式で構築した。ＡｐｏＥのｃＤＮＡを、プ ラスミドｐＡｌｔｅｒＡｐｏＥ３（ｐｅンシルバニア大学レイダー(Radar)博士 の研究室により与えられた）からＸｂａＩ切断で削り出し、末端を平滑化し、そ してＮｏｔＩ切断されたｐＣＭＶＬａｃ Ｚ基幹(backbone)にクローニングした（図１３のベクター構築図を参照）。ｐＣ ＭＶＬａｃＺ中のｌａｃＺ遺伝子からの2062bpのＳｍａＩ／ＳａｃＩ断片を単離 し、そして新たなプラスミドのＳａｌＩ切断部位にスタッファーとして挿入した 。今やＣＭＶプロモーター、ＡｐｏＥのｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリアデニル酸化配 列および2062bpのスタッファーを含有したＡｐｏＥミニ遺伝子カセットを、Ｅｃ ｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断により単離し（全長：4.3kb）、そしてその後、Ｘ ｂａＩ切断されたｐＳｕｂ２０１基幹にライゲーションした。ＰＳｕｂＣＭＶＡ ｐｏＥ−２０６２ＲＯと呼称された最終産物を、ｒＡＡＶ．Ｆ．ＩＸにっいて上 述された処置に従ってｒＡＡＶ．ＡｐｏＥの製造においてシスプラスミドとして 使用した。 Ｂ．ｒＡＡＶ．ＡｐｏＥによるＡｐｏＥ発現のインビトロ分析 ６穴プレートに接種された８４−３１細胞に、２％ウシ胎児血清を含む２m1の ダルベッコ改変イーグル培地中２マイクロリットルの塩化セシウム精製されたｒ ＡＡＶ．ＡｐｏＥを感染させた。細胞を37℃に48時間保った。上清のアリコート をその後、ＡｐｏＥのウェスタンブロット分析のためウェルから取り出した。結 果は、ＡｐｏＥタンパク質が、ＡＡＶ．ＡｐｏＥに感染した８４−３１細胞の上 清中で明らかに検出可能であったことを示した。 Ｃ．ＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるｒＡＡＶ．ＡｐｏＥのインビボ発現 ｒＡＡＶ．ＡｐｏＥの2.5ないし５×10¹⁰個の粒子を、ＡｐｏＥノックアウト マウスの両側の前方脛側骨筋および大腿四頭筋に注入した（マウスあたりの総粒 子：５×10¹⁰ないし５×10¹¹）。持続性の局所的Ａｐ ｏＥ発現は、血漿の抗ＡｐｏＥ抗体の存在下でさえ、注入後第28日および第120 日に免疫蛍光により検出可能であった。 Ｄ．結論 本実験は、ＡｐｏＥノックアウトマウスへのベクターｒＡＡＶ−ＡｐｏＥの筋 肉内注入が、筋線維の形質導入および循環中の本質的な量の組換えタンパク質の 分泌につながることを立証する。破壊的なＣＴＬ免疫応答の非存在下での筋線維 中の導入遺伝子の持続性発現が、たとえ体液性免疫が分泌性タンパク質に対し導 き出されたとしても、達成された。 実施例８−霊長類における導入遺伝子発現 アカゲザルを麻酔し、前腕をクリップで留めかつ無菌的に準備し、そして0.5c mの切開を脛側骨前方筋の上の皮膚中に作成した。筋膜を同定し、そしてｒＡＶ ．ＣＭＶＬａｃＺ（実施例１で記述された）ウイルス懸濁液（10²ゲノム／mlの1 75マイクロリットル）を筋膜中に５〜７mm深さに注入した。14日後、筋生検を取 り出し、ＯＣＴ中で凍結し、薄片に切り、そしてＸ−ｇａｌ中で染色した。組織 切片を、ニコンＦＸＡ顕微鏡とインターフェースで連結されたライカＺ５００Ｍ Ｃ画像処理および分析システムを使用して定量的に分析した。Ｘ−ｇａｌの組織 化学は、注入部位の領域の大多数の筋線維における高レベルのβ−ガラクトシダ ーゼ発現を示した。注入の領域の224mm²の面積中の20パーセントの線維がβ−ガ ラクトシダーゼを発現した。ＡｐｏＥおよびＦ．ＩＸでの上述された結果を基礎 とすれば、発現は、細胞傷害性の免疫応答の非存在下に持続性であることが期待 される。これらのデータは、本発明に従った導入遺伝子の発現が、マウス以外の 動物、そしてとりわけ霊長類の動物で繰り返され得ることを支持する。 本発明の多数の改変および変法が上に同定された明細に包含され、かつ、当業 者に明らかであることが期待される。本発明の方法に対するこうした改変および 変更は、これに付属として付けられる請求の範囲の範囲に包含されると考えられ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｋ 37/26 38/28 37/24 38/43 37/36 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）がヘルパーウイルスによる汚染を本 質的に含まず、かつ骨格筋細胞に投与される、ｒＡＡＶに対する免疫応答を低下 させる薬物の製造のための細胞中でのその発現を制御する配列に操作可能に連結 される異種遺伝子を含むｒＡＡＶの使用。 ２．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）がヘルパーウイルスでの汚染を本質 的に含まず、かつ骨格筋細胞に投与される、導入遺伝子の発現を延長する薬物の 製造のための細胞中でのその発現を制御する配列に操作可能に連結される導入遺 伝子を含むｒＡＡＶの使用。 ３．導入遺伝子が分泌性タンパク質である、請求の範囲１もしくは２に記載の使 用。 ４．タンパク質が、第IX因子、ＡｐｏＥ、β−インターフェロン、インスリン、 エリスロポエチン、成長ホルモンおよび副甲状腺ホルモンから成る群から選択さ れる、請求の範囲３に記載の使用。 ５．ｒＡＡＶが、５’から３’へ、５’のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）、 異種プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル酸化配列、および３’のＡＡＶの ＩＴＲから成る、請求の範囲１ないし４のいずれかに記載の使用。 ６．導入遺伝子がジストロフィン遺伝子である、請求の範囲１もしくは２に記載 の使用。 ７．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）がヘルパーウイルスでの汚染を本質 的に含まず、また、導入遺伝子が細胞中で発現される、その発現を制御する配列 に操作可能に連結される導入遺伝子を含むｒＡＡＶを細胞中に導入する段階を含 む、細胞に対し向けられる細胞傷害性の免疫 応答の非存在下で骨格筋細胞中で導入遺伝子を発現する方法。 ８．導入遺伝子が分泌性タンパク質である、請求の範囲７に記載の方法。 ９．タンパク質が、第IX因子、ＡｐｏＥ、β−インターフェロン、インスリン、 エリスロポエチン、成長ホルモンおよび副甲状腺ホルモンから成る群から選択さ れる、請求の範囲８に記載の方法。 １０．ｒＡＡＶが、５’から３’へ、５’のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ） 、異種プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル酸化配列、および３’のＡＡＶ のＩＴＲから成る、請求の範囲７に記載の方法。