CN109714954A - 用于组织特异性表达的修饰的u6启动子系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于表达用以基于RNA干扰的基因治疗方法的微RNA(miRNA)的组织特异性启动子系统。在这些系统中，miRNA将抑制基因表达或使用微RNA替代天然miRNA表达。

Description

用于组织特异性表达的修饰的U6启动子系统
本申请要求2016年4月2日提交的美国临时申请号62/317,524的优先权权益，其以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于表达用于基于RNA干扰的基因治疗方法的微RNA(miRNA)的组织特异性启动子系统。在这些系统中，miRNA将抑制基因表达或使用微RNA替代天然miRNA表达。
通过参考序列表并入
本申请含有作为公开内容的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：50393A_SeqListing.txt；1,684,397字节—ASCII文本文件)，其以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是真核细胞中基因调节的机制，已被考虑用于医治各种疾病。RNAi是指由微RNA(miRNA)介导的基因表达的转录后控制。天然miRNA是小的(21-25个核苷酸)非编码RNA，其与同源信使RNA(mRNA)的3'非翻译区共享序列同源性和碱基对，尽管编码区中也可发生调节。miRNA和mRNA之间的相互作用指导细胞基因沉默机制降解靶mRNA和/或预防mRNA的翻译。RNAi途径概述于Duan(编),《肌肉基因治疗(Muscle Gene Therapy)》中第7章第7.3节,施普林格科学+商业媒体有限责任公司(Springer Science+Business Media,LLC)(2010)。
随着对天然RNAi途径的理解的发展，研究人员已设计人工miRNA，用于调节用于医治疾病的靶基因表达中。如在Duan(同上)的第7.4节所描述的，人工miRNA可从DNA表达盒转录。对靶基因特异的miRNA序列与在细胞中指导miRNA加工所需的序列一起转录。病毒载体如腺相关病毒已经用于将miRNA递送至肌肉[Fechner等人,《分子医学杂志(J.Mol.Med.)》,86:987-997(2008)]。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长约4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。存在多种血清型AAV。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。举例来说，AAV-1的完整基因组提供于基因库登录号NC_002077中；AAV-2的完整基因组提供于基因库登录号NC_001401和Srivastava等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,45:555-564{1983)中；AAV-3的完整基因组提供于基因库登录号NC_1829中；AAV-4的完整基因组提供于基因库登录号NC_001829中；AAV-5基因组提供于基因库登录号AF085716中；AAV-6的完整基因组提供于基因库登录号NC_00 1862中；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别提供于基因库登录号AX753246和AX753249中；AAV-9基因组提供于Gao等人,《病毒学杂志》,78:6381-6388(2004)中；AAV-10基因组提供于《分子治疗(Mol.Ther.)》,13(1):67-76(2006)中；AAV-11基因组提供于《病毒学(Virology)》,330(2):375-383(2004)中。AAVrh.74血清型的克隆描述于Rodino-Klapac.等人,《转化医学杂志(Journal ofTranslational Medicine)》5,45(2007)中。AAV-B1血清型的分离描述于Choudhury等人,《分子治疗(Mol.Therap.)》,24(7):1247-57,2016中。在AAV ITR内含有指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)结合导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶特性，其最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka,《当前微生物学和免疫学的话题(Current Topics in Microbiology and Immunology)》,158:97-129(1992)中评论。
AAV具有独特的特征，这使其作为将外源DNA递送至细胞的载体具有吸引力，例如，在基因治疗中。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。将AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建为可行的。此外，因为在AAV基因组的ITR内含有指导AAV复制和基因组衣壳化的信号中，所以基因组内部约4.3kb的部分或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可被外源DNA替代。为了产生AAV载体，可反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一个重要特征是它是极其稳定和健壮的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。
基于miRNA的疗法，包括miRNA抑制和miRNA替代，可用于医治许多疾病，如丙型肝炎病毒感染、肌营养不良症、神经变性疾病、外周神经病、慢性心力衰竭和心肌梗塞后重塑和癌症。此外，miRNA指导的基因表达调节可改善传统的基因治疗方法，其中载体有效负载是蛋白编码基因。系统递送的AAV载体优先转导肝脏，如果使用肝脏活性启动子，则导致该器官中的高水平转基因表达。如本文详细描述的，当使用肝特异性启动子时，肝特异性miR-122结合位点的插入降低肝脏中的转基因表达。
miRNA表达的过载在骨骼肌、肝脏和其它系统中具有潜在毒性。因此，需要开发较弱的启动子，其指导miRNA表达作为避免在基因治疗期间miRNA的高表达毒性的手段。举例来说，为AAV8介导的肝脏中丙型肝炎病毒(HCV)的RNAi治疗开发弱化的U6系统。该系统目前正在使用AAV进行RNAi治疗的第一次临床试验中进行测试。简而言之，支持该试验的临床前数据示出，由野生型(WT)U6启动子产生的shRNA有效地破坏HCV，但也在小鼠和猴子中引起肝细胞毒性。突变WT U6启动子中的重要残基通过弱化U6转录并且产生少16倍的shRNA，同时维持HCV破坏的效力来缓和这种情况(Suhy等人,《分子治疗》20:1737-49,2012；单剂量TT034在患有慢性丙型肝炎的患者中的安全性和有效性研究(Safety and Efficacy Studyof Single Doses of TT034in Patients with Chronic Hepatitis C)；clinicaltrial.gov,2013年7月8日)。在该实例中，靶器官是肝脏。本发明旨在避免肝脏，并且因此提供可用于基因治疗方法的弱化的骨骼肌特异性U6启动子系统。
发明内容
本发明提供修饰的U6启动子系统，用于以低水平组织特异性表达miRNA以避免毒性过载。修饰的U6启动子系统是包含U6启动子序列的核酸分子，所述U6启动子序列含有弱化其效力的突变。此外，miRNA有效负载含有置于miRNA成熟引导链内不同位置处的去靶miRNA结合序列。举例来说，本发明的核酸分子具有在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子，含有miR-122和miR-208结合位点的miRNA成熟引导链，以分别去靶肝脏和心脏中的miRNA的表达。
在概念验证研究中，将肝特异性miR-122靶序列插入载有荧光素酶或LacZ报道基因的AAV载体中。在这些载体中，普遍活性的U6启动子用于驱动两种基因的转录。缺乏miR-122位点的AAV载体在小鼠肝脏中导致极其高水平的荧光素酶或LacZ表达，而相同基因的转录分别在每个各自的编码基因中由载有miR-122结合位点的载体递送时降低50倍和70倍。这类系统尚未用于微RNA表达载体(参考文献PMID：21150938)。
本发明提供核酸分子，其包含修饰的U6启动子序列、包含至少一个去靶序列的miRNA成熟引导链序列和在5'端处的5-6个胸苷。本发明的核酸分子包含至少两个去靶序列、至少三个去靶序列、至少四个去靶序列、至少五个去靶序列或更多序列。除了组织特异性miRNA结合位点之外，DNA核酸序列还包含RNA聚合酶III的转录终止信号，其在5'端处包含五个胸苷或在5'端处包含六个胸苷。当转录成RNA时，这些胸苷以尿嘧啶的形式添加到转录物中。
“去靶序列”是期望在组织中被抑制的任何组织特异性miRNA的结合位点。举例来说，本发明提供核酸序列，其中去靶序列是任何天然miRNA的结合位点，例如miR-122、miR-208、miR-1、miR-206、miR-133、、miR-29a、miR-29b或miR-29c。
本发明的核酸分子包含弱化的修饰的U6启动子。举例来说，修饰的U6启动子至少包含近端序列元件(PSE)区域或远端序列元件(DSE)中的取代、插入或缺失。举例来说，修饰的U6启动子序列包含在PSE序列中在核苷酸-66处将胞嘧啶取代为胸苷、在核苷酸-57处将胞嘧啶取代为胸苷，并且在核苷酸-52处将胸苷取代为胞嘧啶。
本发明的核酸分子包含任何miRNA成熟引导链，其将抑制感兴趣的基因表达。举例来说，核酸分子包含miDUX4、miRNA-92、miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-19b-1、mi-RNA-26a、miRNA-122、miRNA-126、miRNA-335、let-7a和let-7b、miRNA-34(miR-34a)、miRNA-10b、miRNA-208、miRNA-499、miRNA-195、miRNA-29a、miRNA-29b或miRNA-29c的miRNA成熟引导链。核酸分子包含如SEQ ID NO：10-10912所述的miRNA成熟引导链中的任一个。本发明的核酸分子包含具有SEQ ID NO：1(miDUX4-1；mi405)或SEQ ID NO：2(miDUX-4-2；mi1155)的核酸序列的miDUX4的成熟引导链。
本发明的核酸分子包含miRNA的成熟引导链，其包含mir450(SEQ ID NO：10973)、mi1155mi70(SEQ ID NO：8482)、mi180(SEQ ID NO：8372)、mi181(SEQ ID NO：8371)、mi182(SEQ ID NO：8370)、mi185(SEQ ID NO：8367)、mi186(SEQ ID NO：8366)、mi187(SEQ ID NO：8365)、mi333(SEQ ID NO：8219)、mi334(SEQ ID NO：8218)、mi400(SEQ ID NO：8152)、mi405(SEQ ID NO：8147)、mi407(SEQ ID NO：8145)、mi1155(SEQ ID NO：7397)、mi1156(SEQ IDNO：7396)、mi1157(SEQ ID NO：7395)、mi1308(SEQ ID NO：7108)、mi1309(SEQ ID NO：7107)、mi1310(SEQ ID NO：7106)、mi1420(SEQ ID NO：6633)、mi1422(SEQ ID NO：6631)、mi1431(SEQ ID NO：6622)、mi1434(SEQ ID NO：6619)、mi1444(SEQ ID NO：6609)、mi1445(SEQ ID NO：6608)、mi1485(SEQ ID NO：6568)、mi1492(SEQ ID NO：6561)、mi1493(SEQ IDNO：6560)、mi1519((SEQ ID NO：10971)或mi1520(SEQ ID NO：10972)的核苷酸序列。这些序列与mi405和mi1155的成熟引导链相似地折叠。因此，本发明提供核酸分子，其中mir-208结合位点序列(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：66)和/或mir-122结合位点序列(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：67)可在与表1中的序列中所述的位置相似的位置处插入前述成熟引导链中的任一个的环中。
在示例性实施例中，本发明的核酸分子具有在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷。本发明的示例性核酸分子包含miDUX4的miRNA成熟引导链和至少一个去靶序列，例如在成熟引导链的环内、在成熟引导链的5'处端或在成熟引导链的3'端处插入miR-122(SEQ ID NO：5)或miR-208(SEQ ID NO：6)结合位点，如SEQ ID NO：10913-10968中的任一个所述的核酸序列。
本发明提供包含SEQ ID NO：1、2或10913-10968中的任一个的核酸序列的核酸分子。
在另一个实施例中，本发明提供包含本发明的核酸分子中的任一种的重组腺相关病毒(AAV)。AAV可为任何血清型，例如AAV-B1、AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开于例如WO01/83692中。还考虑其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic等人,《分子治疗(Molecular Therapy)》,22(11):1900-1909(2014)。本发明还提供包含本发明AAV中的任一种的组合物。此外，本发明提供作为自身互补AAV载体的重组AAV载体。
在另一个实施例中，本发明提供抑制细胞中基因表达的方法，其包含使细胞与包含本发明的核酸分子中的任一种的载体接触。举例来说，本发明提供抑制细胞中基因表达的方法，其包含使细胞与包含本发明的核酸分子中的任一种的重组AAV接触。本发明的其它实施例利用其它载体或质粒来递送本发明的核酸分子，例如其它病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、马相关病毒、甲病毒、痘病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒和牛痘病毒，以递送本发明的核酸分子。
本发明还提供抑制细胞中DUX4基因表达的方法，其包含使细胞与包含本发明的核酸分子中的任一种或组合物中的任一种的重组AAV接触。举例来说，方法用本发明的核酸分子进行，所述核酸分子包含在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有插入miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷，或者本发明的核酸分子包含SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列。
本发明提供包含本发明的任何核酸分子的重组AAV或本发明的组合物用于制备用于抑制细胞中DUX4基因表达的药物的用途。用于制备药物的AAV或组合物包含本发明的核酸分子，所述核酸分子包含在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有插入miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷，或者本发明的核酸分子包含SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列。
本发明还提供用于包含本发明的任何核酸分子的重组AAV或本发明的组合物用于抑制细胞中DUX4基因表达的组合物。用于制备药物的AAV或组合物包含本发明的核酸分子，所述核酸分子包含在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有插入miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷，或者本发明的核酸分子包含SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列。
本发明进一步提供将DUX4 miRNA编码DNA递送至有需要的动物的骨骼肌的方法，包含向动物给药包含SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列的重组AAV。
本发明还提供包含本发明的核酸序列的重组AAV用于将DUX4 miDNA编码核酸分子递送至有需要的动物的骨骼肌的用途。本发明提供包含SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列用于将DUX4 miDNA编码核酸分子递送至有需要的动物的骨骼肌的组合物。
在另一个实施例中，本发明提供医治面肩肱型肌营养不良症的方法，其包含给药包含本发明的核酸分子中的任一种的重组腺相关病毒或本发明的组合物中的任一种。举例来说，方法用本发明的核酸分子进行，所述核酸分子包含在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有插入miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷，或者用具有SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列的核酸分子进行。
在本发明的方法中的任一种中，重组AAV通过肌内注射、透皮转运或注射到血流中来给药。
本发明提供包含本发明的任何核酸分子的重组AAV或本发明的组合物用于制备用于医治面肩肱型肌营养不良症的药物的用途。用于制备药物的AAV或组合物包含本发明的核酸分子，所述核酸分子包含在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有插入miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷，或者用具有SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列的核酸分子进行。
在本发明的用途中的任一种中，药物被配制成用于通过肌内注射、透皮转运或注射到血流中给药。
本发明还提供用于包含本发明的任何核酸分子的重组AAV或本发明的组合物用于医治面肩肱型肌营养不良症的组合物。用于制备药物的AAV或组合物包含本发明的核酸分子，所述核酸分子包含在近端序列元件内具有取代的修饰的U6启动子、在成熟引导链的环内或在成熟引导链的5'或3'端处具有插入miR-122和/或miR-208结合位点的miDUX4的成熟引导链，和5-6个胸苷，或者用具有SEQ ID NO：10913-10968中的任一个的核酸序列的核酸分子进行本发明的组合物被配制成用于通过肌内注射、透皮转运或注射到血流中给药。具 体实施方式
本发明提供修饰的U6启动子系统，用于以低水平组织特异性的特异性表达miRNA以避免毒性过载。修饰的U6启动子系统是核酸分子，其包含修饰的U6启动子序列，具有在成熟引导链序列内插入的去靶序列的miRNA的成熟引导链。举例来说，肝特异性miR-122的结合位点和/或心脏特异性miR-208的结合位点在miRNA的成熟引导链的环内或在miRNA的成熟引导链的5'或3'端处插入，以分别去靶肝脏和心脏中的miRNA的表达。
修饰的U6启动子
本发明提供修饰的U6启动子系统，其反过来可导致miRNA引导的靶基因的抑制或miRNA的替代，这可导致靶基因的抑制或转录不足的miRNA的替代。野生型U6启动子(U6-1)如SEQ ID NO：3所述；而在PSE区域内具有取代的弱化的U6启动子如SEQ ID NO：4所述，如图1所示。
修饰的U6启动子系统是包含修饰的U6启动子的核酸分子，所述修饰的U6启动子在野生型U6启动子序列内包含至少一个取代、至少一个插入、至少一个缺失或其组合，其中修饰弱化启动子活性。修饰可在一个或多个元件中，例如远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)或TATA元件。举例来说，修饰是PSE核苷酸序列中的取代、插入或缺失。示例性修饰可用U6-2启动子、U6-7启动子、U6-8启动子或U6-9启动子的PSE核苷酸序列替代野生型U6-1启动子的PSE。
在本发明的实施例中，核酸分子包含U6核苷酸序列，其中PSE或DSE核苷酸序列具有弱化启动子活性的取代。举例来说，野生型U6启动子序列(SEQ ID NO：3)包含在PSE或DSE核苷酸序列内的1-10个取代或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-9个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-8个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-7个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-6个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-5个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-4个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-3个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的5-10个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的5-9个取代、或用PSE或DSE核苷酸序列的5-8个取代或在PSE或DSE核苷酸序列内的5-7个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的5-6个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的4-8个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的4-6个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-6个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-9个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的2-4个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的2-3个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-4个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-5个取代、或在PSE或DSE核苷酸序列内的4-5个取代。在一个实施例中，核酸分子包含在PSE或DSE核苷酸序列内的1个取代、2个取代或3个取代、4个取代、5个取代、6个取代、7个取代、8个取代、9个取代或10个取代。
在另一个实施例中，野生型U6启动子序列(SEQ ID NO：3)包含在PSE或DSE核苷酸序列内的1-10个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-9个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-8个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-7个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-6个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-5个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-4个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-3个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的5-10个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的4-8个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的6-9个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的2-4个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的2-3个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-4个插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-5插入、或在PSE或DSE核苷酸序列内的4-5个插入。在一个实施例中，核酸分子包含在PSE或DSE核苷酸序列内的1个插入、2个插入、3个插入、4个插入、5个插入、6个插入、7个插入、8个插入、9个插入或10个插入。
在另一个实施例中，野生型U6启动子序列(SEQ ID NO：3)包含在PSE或DSE核苷酸序列内的1-10个缺失或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-9个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-8个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-7个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-6个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-5个缺失或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-4个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的1-3个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的2-4个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的2-3个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-4个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的3-5个缺失、或在PSE或DSE核苷酸序列内的4-5个缺失。在一个实施例中，核酸分子包含在PSE或DSE核苷酸序列内的1个缺失、2个缺失、3个缺失、4个缺失、5个缺失、6个缺失、7个缺失、8个缺失、9个缺失或10个缺失。
去靶miRNA序列表达
本发明的启动子系统是包含miRNA的成熟引导链的核酸分子，其中去靶miRNA的结合位点在miRNA的成熟引导链的环内或在miRNA的成熟引导链的5'或3'端处插入。举例来说，为了启动骨骼肌中miRNA序列的表达并且去靶肝脏和心脏组织中的miRNA的表达，核酸分子包含miRNA的成熟引导链，其中肝特异性miR-122的结合位点和/或心脏特异性miR-208的结合位点在成熟引导链的环内或在miRNA的成熟引导链的5'或3'端处插入。miRNA-122的结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所述，miRNA-208的结合位点的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所述。
如果期望去靶骨骼肌中的miRNA的表达，则将miR-1、miR-206或miR-133的结合位点在miRNA的成熟引导链的环内或在miRNA的成熟引导链的5'或3'端处插入。
如果期望去靶骨骼肌、肝脏和/或心脏以外的组织中的表达，则可将不同miRNA转录物的结合位点在miRNA的成熟引导链内插入。举例来说，miR-142结合位点可用于去靶造血细胞中的转录物表达。miR-29a、miR-29b和/或miR-29c的结合位点可用于去靶正常组织中的miRNA表达并且靶向肿瘤组织中的miRNA表达。
可用于去靶组织中的miRNA表达的miRNA结合序列在本文中共同表示为“去靶序列”。本发明的核酸序列包含至少一个拷贝的去靶序列、或至少两个拷贝的去靶序列、或至少三个拷贝的去靶序列、或至少四个拷贝的去靶序列或至少五个拷贝的去靶序列。本发明的核酸分子包含1-5个拷贝的去靶序列、或1-4个拷贝的去靶序列、或1-3个拷贝的去靶序列或1-2个拷贝的去靶序列、或2-5个拷贝的去靶序列、2-4个拷贝的去靶序列、或2-3个拷贝的去靶序列、或3-5个拷贝的去靶序列、或3-4个拷贝的去靶序列、或4-5个拷贝的去靶序列。
去靶序列可在miRNA的成熟引导链的环内或在miRNA的成熟引导链的5'或3'端处插入。用于插入去靶序列的示例性位置在图4中陈述，并且包含miDUX4的成熟引导链(mi405(SEQ ID NO：10973)或mi1155(SEQ ID NO：10974)和miR-122结合位点(SEQ ID NO：5或SEQID NO：66)或miR-208结合位点(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：67)的示例性核酸提供于下表1中。
人和小鼠基因组中存在两个miR-208序列(miR-208a和miR-208b)。为了避免5U(pol III启动子终止序列)的运行，在以下示例性序列中，结合位点中的单个碱基突变为“c”(小写粗体“c”)。包括此改变是因为它为mir-208b创建完美的结合位点，但与mir-208a不匹配。
表1
miRNA的成熟引导链包含mi70(SEQ ID NO：8482)、mi180(SEQ ID NO：8372)、mi181(SEQ ID NO：8371)、mi182(SEQ ID NO：8370)、mi185(SEQ ID NO：8367)、mi186(SEQ ID NO：8366)、mi187(SEQ ID NO：8365)、mi333(SEQ ID NO：8219)、mi334(SEQ ID NO：8218)、mi400(SEQ ID NO：8152)、mi405(SEQ ID NO：8147)、mi407(SEQ ID NO：8145)、mi1155(SEQ IDNO：7397)、mi1156(SEQ ID NO：7396)、mi1157(SEQ ID NO：7395)、mi1308(SEQ ID NO：7108)、mi1309(SEQ ID NO：7107)、mi1310(SEQ ID NO：7106)、mi1420(SEQ ID NO：6633)、mi1422(SEQ ID NO：6631)、mi1431(SEQ ID NO：6622)、mi1434(SEQ ID NO：6619)、mi1444(SEQ ID NO：6609)、mi1445(SEQ ID NO：6608)、mi1485(SEQ ID NO：6568)、mi1492(SEQ IDNO：6561)、mi1493(SEQ ID NO：6560)、mi1519(SEQ ID NO：10971)或mi1520(SEQ ID NO：10972)的核苷酸序列。这些序列与类似于mir405和mir1155的成熟引导链折叠的mi405和mi1155的成熟引导链相似地折叠。因此，本发明提供核酸分子，其中mir-208结合位点序列(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：66)和/或mir-122结合位点序列(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：67)可在与表1中的序列中所述的位置相似的位置处插入前述成熟引导链中的任一个的环中。
感兴趣的miRNA
本发明的核酸分子可包含任何期望具有组织特异性表达的miRNA转录物序列的成熟引导链的序列。举例来说，在一个实施例中，考虑DUX4 miRNA的骨骼表达。示例性DUX4miRNA序列提供于国际专利申请号PCT/US2012/047999(WO2013/016352)和美国专利公开号US 201220225034中，其以全文引用的方式并入本文中。
miDUX4的两个实例是miDUX4-1(miDux405；SEQ ID NO：1)：和miDUX4-2(miDux1155；SEQ ID NO：2)。包含DUX4 miRNA和miR-122或miR-208的结合位点的示例性核苷酸序列提供于表1和SEQ ID NO：10913-10968中。
可使用本发明的核酸分子表达以下miRNA中的任一种：miR-122、miR-124、miR-142、miR-155、miR-21、miR-17-92、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-26a、miR-126、miR-335、let-7家族：let-7a和let-7b、miR-34(miR-34a)、miR-10b、miR-208、miR-499、miR-195、miR-29a、miR-29b和miR-29c。根据期望组织特异性和期望去靶，这些miRNA中的任一种可与不同去靶序列一起使用。
AAV
本发明的重组AAV基因组包含本发明的核酸分子和侧接核酸分子的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可来自任何可衍生重组病毒的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-B1、AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开于例如WO 01/83692中。还考虑其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic等人,《分子治疗》,22(11):1900-1909(2014)。如上文背景技术部分所述，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。为了启动骨骼肌特异性表达，可使用AAV1、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。
自身互补AAV(scAAV)载体也预期用于本发明。通过将载体大小减少至约2500个碱基对来产生scAAV载体，其包含2200个碱基对的独特转基因序列加上两个拷贝的145个碱基对ITR，其被包装为二聚体。scAAV具有重新折叠成双链DNA模板用于进行表达的能力。McCarthy,《分子治疗》,16(10):1648-1656,2008。
本发明的DNA质粒包含本发明的rAAV基因组。将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配成感染性病毒颗粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域中的标准，其中待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能被提供给细胞。rAAV的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可来自任何可衍生重组病毒的AAV血清型，并且可来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开于例如WO 01/83692中，其以全文引用的方式并入本文中。
产生包装细胞的方法是创建稳定表达AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。举例来说，包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因，以及选择标记，如新霉素抗性基因，整合到细胞的基因组中。已经将AAV基因组引入细菌质粒中，这通过如GC拖尾的程序(Samulski等人,1982,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,79:2077-2081)、添加含有限制性内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin等人,1983,《基因(Gene)》,23:65-73)或通过直接平端连接(Senapathy&Carter,1984,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,259:4661-4666)进行。然后用辅助病毒如腺病毒感染包装细胞系。该方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
rAAV产生的一般原理在例如Carter,1992,《生物技术近期述评(CurrentOpinions in Biotechnology)》,1533-539；和Muzyczka,1992,《当前微生物学和免疫学的话题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.,158:97-129)中评论。各种方法描述于Ratschin等人,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》,81:6466(1984)；Tratschin等人,《分子细胞生物学》5:3251(1985)；McLaughlin等人,《病毒学杂志》,62:1963(1988)；和Lebkowski等人,1988《分子细胞生物学》,7:349(1988)，Samulski等人(1989,《病毒学杂志》,63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和对应美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人,(1995)《疫苗(Vaccine)》13:1244-1250；Paul等人,(1993)《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》4:609-615；Clark等人,(1996)《基因治疗(Gene Therapy)》3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595中。前述文献在此以全文引用的方式并入本文中，特别强调与rAAV产生有关的文献的那些部分。
因此，本发明提供产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可为稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施例中，包装细胞是不为转化的癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人胚肾细胞)、MRC-5细胞(人胚成纤维细胞)、WI-38细胞(人胚成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
本发明的重组AAV(即，感染性衣壳化rAAV颗粒)包含rAAV基因组。实施例包括但不限于命名为“AAV.miDUX4.405”的rAAV，其包括编码DUX4miRNA hDux.mi405的基因组(由SEQID NO：1中陈述的DNA编码，和命名为“AAV.miDUX4.1155”的rAAV，其包括编码DUX4 miRNAhDux.mi1155的基因组(由SEQ ID NO：2中陈述的DNA编码)。在示例性实施例中，两种rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA，即，在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。可构建为包含本发明的核酸分子的rAAV的实例陈述于国际专利申请号PCT/US2012/047999(WO2013/016352)中，其以全文引用的方式并入本文中。
rAAV可通过本领域标准的方法纯化，如通过柱色谱法或氯化铯梯度。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括在例如Clark等人,《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,《分子医学方法(MethodsMol.Med.)》,69 427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657中公开的方法。
在另一个实施例中，本发明涉及包含本发明的rAAV的组合物。本发明的组合物包含药学上可接受的载体中的rAAV。组合物还可包含其它成分，如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对受体无毒，并且优选在采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。
在本发明的方法中待给药的rAAV的滴度将根据例如特定rAAV、给药方式、医治目标、个体和靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可通过本领域标准的方法确定。rAAV的滴度范围可为每毫升约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013至约1×1014或更多DNase抗性颗粒(DRP)。剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表达。
本发明考虑体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包含向有需要的动物(包括人类)给药有效剂量或有效多剂量的包含本发明的rAAV的组合物的步骤。如果在病症/疾病发展之前给药剂量，则给药是预防性的。如果在病症/疾病发展之后给药剂量，则给药是治疗性的。在本发明的实施例中，有效剂量是减轻(消除或降低)与正在医治的病症/疾病状态相关的至少一种症状、减缓或预防进展至病症/疾病状态、减缓或预防病症/疾病状态的进展、减少疾病的程度、导致疾病的缓解(部分或全部)，和/或延长存活的剂量。预期用本发明的方法预防或医治的疾病的实例是FSHD。
本发明还考虑组合疗法。如本文使用的组合包括同时医治和顺序医治两者。特别考虑本发明方法与标准医药医治(例如皮质类固醇)的组合，以及与新疗法的组合。
给药有效剂量的组合物可通过本领域标准的途径，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、口服、口腔、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到感染和/或正在医治的疾病状态和要表达DUX4 miRNA的一个或多个靶细胞/组织，本领域技术人员可选择和/或匹配本发明的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的一个或多个给药途径和一种或多种血清型。
本发明提供有效剂量的重组AAV和本发明组合物的局部给药和全身给药。举例来说，全身给药是给药到循环系统，使得整个身体受到影响。全身给药包括肠内给药，如通过胃肠道吸收和通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。
特别地，本发明的rAAV的实际给药可通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来实现。根据本发明的给药包括但不限于注射到肌肉、血流和/或直接注射到肝脏中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中已经证明足以提供可用于肌肉组织表达的载体，并且对可与rAAV共同给药的载体或其它组分没有已知的限制(尽管降解DNA的组合物应使用rAAV以正常方式避免)。可修饰rAAV的衣壳蛋白，使得rAAV靶向感兴趣的特定靶组织，如肌肉。参见，例如，WO 02/053703，其公开内容以引用的方式并入本文中。药物组合物可制备成可通过透皮转运递送至肌肉的注射制剂或局部制剂。许多用于肌内注射和透皮转运两者的制剂先前已经被开发，并且可用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于给药和处理。
为了肌内注射的目的，可采用佐剂如芝麻油或花生油或丙二醇水溶液，以及无菌水溶液。如果期望，则可缓冲这类水溶液，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。作为游离酸的rAAV溶液(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐可在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备rAAV的分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。在这方面，采用的无菌含水介质都可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，以便存在易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。举例来说，通过使用如卵磷脂的涂层、通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。
根据需要，通过将rAAV以所需量掺入带有上面列举的各种其它成分的适当溶剂中来制备无菌可注射溶液，然后过滤灭菌。通常，通过将灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。
用rAAV转导也可体外进行。在一个实施例中，从受试者中取出期望的靶肌肉细胞，用rAAV转导并且重新引入受试者。或者，可使用同基因或异基因肌肉细胞，其中这些细胞将不在受试者中产生不适当的免疫应答。
用于将转导细胞转导和重新引入受试者的合适方法是本领域已知的。在一个实施例中，可通过将rAAV与肌肉细胞组合(例如，在适当的培养基中)体外转导细胞，并且使用常规技术如Southern印迹和/或PCR，或通过使用选择标记来筛选具有感兴趣的DNA的那些细胞。然后可将转导的细胞配制成药物组合物，并且通过各种技术将组合物引入受试者，如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，或通过使用例如导管来注射到平滑肌和心肌中。
用本发明的rAAV转导细胞导致DUX4 miRNA的持续表达。因此，本发明提供向动物，优选人类给药/递送表达DUX4 miRNA的rAAV的方法。这些方法包括用一种或多种本发明的rAAV转导组织(包括但不限于如肌肉的组织、如肝脏和脑的器官，以及如唾液腺的腺体)。转导可用包含组织特异性控制元件的基因盒进行。举例来说，本发明的一个实施例提供转导由肌特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述控制元件包括但不限于衍生自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族，如衍生自myoD基因家族的控制元件[参见Weintraub等人,《科学(Science)》,251:761-766(1991)]；肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson,《分子细胞生物学》11:4854-4862(1991)]；衍生自人骨骼肌动蛋白基因[Muscat等人,《分子细胞生物学》,7:4089-4099(1987)]、心肌肌动蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人,《分子细胞生物学》,9:3393-3399(1989)]和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件；衍生自骨骼快速颤搐肌钙蛋白C基因、慢速颤搐心肌肌钙蛋白C基因和慢速颤搐肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导的核因子(Semenza等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,88:5680-5684(1991))；类固醇诱导的包括糖皮质激素应答元件(GRE)的元件和启动子(参见Mader和White,《美国国家科学院院刊》,90:5603-5607(1993))和其它控制元件。
肌肉组织是体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为它不是至关重要的器官并且易于接近。本发明考虑从转导的肌纤维中持续表达miRNA。
“肌肉细胞”或“肌肉组织”意指衍生自任何种类的肌肉(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)的细胞或细胞群。这类肌肉细胞可为分化的或未分化的，如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。
术语“转导”是用来指经由本发明的复制缺陷型rAAV将DUX4 miRNA体内或体外给药/递送到受体细胞，导致受体细胞表达DUX4 miRNA。
因此，本发明提供向有需要的患者给药有效剂量(或基本上同时给药的多个剂量或间隔给予的多个剂量)的编码DUX4 miRNA的rAAV的方法。
DUX4和面肩肱型肌营养不良症
肌营养不良症(MD)是一组遗传疾病。所述组的特征在于控制运动或呼吸的骨骼肌的进行性无力和退化。某些形式的MD在婴儿期或儿童期发展，而其它形式的MD直到中年或以后才可出现。病症在肌肉无力的分布和程度(某些形式的MD也影响心肌)、发病年龄、进展速度和遗传模式方面不同。
面肩肱型肌营养不良症(FSHD)是复杂的常染色体显性病症，其特征在于面部、肩部和四肢肌肉的进行性和不对称性无力。症状通常出现在成年期，其中大多数患者在三十岁之前示出临床特征。约百分之五的患者发展婴儿或青少年的症状，并且这些症状通常受到更严重的影响。临床表现可从轻度(一些有限的肌肉无力)到重度(轮椅依赖)。从历史上看，FSHD被分类为第三最常见MD，影响全球20,000个体中的一个。然而，最近的数据指示，FSHD是欧洲最常见的MD，表明其全球发病率可高达8,333分之1。
典型的FSHD病例(FSHD1A，迄今为止称为FSHD)与杂合染色体缺失相关，其减少人染色体4q35上3.3千碱基(kb)D4Z4重复序列的拷贝数。简单地说，正常个体在两个4q35等位基因上具有11-100个串联重复的D4Z4拷贝，而患有FSHD的患者具有一个正常和一个含有1-10个重复序列的收缩等位基因。此外，必须在特定的疾病允许染色体4q35背景(称为4qA)上发生FSHD相关D4Z4收缩。重要的是，由于FSHD相关缺失，没有基因完全丧失或结构突变。相反，与FSHD相关的遗传改变引起毒性DUX4基因表达，其损害肌肉。FSHD2(也称为FSHD1B)在表型上与FSHD1相同，与DUX4表达相关，并且需要4qA染色体背景。FSHD2与D4Z4重复序列收缩无关，而是由SMCHD1基因中的突变引起，所述SMCHD1基因是染色质调节因子，通常参与抑制4qA处的DUX4基因座。突变的SMCHD1蛋白不参加向4qA DUX4等位基因添加异染色质，从而允许DUX4基因表达。
在领先的FSHD发病机理模型中，提出D4Z4收缩引起允许DUX4基因表达的表观遗传改变。结果，以其他方式沉默或接近沉默的DUX4基因及其调节的基因的异常过表达最终可导致FSHD。该模型与示出正常4q35D4Z4重复序列具有异染色质特征的数据一致，而FSHD连接的D4Z4重复序列含有更多指示活性转录常染色质的标记。这些转录允许的表观遗传改变与完整的单体D4Z4缺失(即零重复序列)不导致FSHD的观察结果结合支持D4Z4重复序列具有潜在肌病开放阅读框(ORF)的假设，所述框在FSHD肌肉中异常表达。这个概念最初是在1994年考虑的，当时首次鉴定名为DUX4的D4Z4定位的ORF。然而，基因座具有未表达的假基因的一些特征，并且因此DUX4被简称为FSHD候选物。此后多年来，对FSHD相关基因的搜索主要集中在D4Z4重复序列之外，并且尽管这些研究中出现一些有趣的候选物，但没有一个基因与FSHD发展决定性相关。这种缓慢的进展导致DUX4在2007年重新出现为FSHD候选物。尽管截至2010年，研究人员继续强调其它基因作为候选物。参见，例如，Wuebbles等人,《国际临床与实验病理学杂志(Int.J.Clin.Exp.Pathol.)》，3(4):386-400(2010)强调FSHD区域基因1(frg1)。相反，Wallace等人,《分子治疗》,17(增刊1):S151(2009)；Wei等人,《分子治疗》,17(增刊1):S200(2009)；和Lemmers等人的来自2010年8月19日的《科学特快(Sciencexpress)》期刊的报道强调DUX4。Neguembor和Gabellini,《表观基因组学(Epigenomics)》,2(2):271-287(2010)是最近关于FSHD的评论文章。
DUX4在FSHD发病机理中的作用可解释如下。首先，D4Z4重复序列含有相同的DUX4编码区，并且D4Z4重复序列也具有较小的有义和反义转录物，包括一些类似的微RNA。在来自FSHD患者的活组织检查和细胞系中发现过表达的DUX4转录物和约50kDa的全长DUX4蛋白。这些数据与FSHD发病机理的转录去抑制模型一致。此外，与假基因不同，D4Z4重复序列和DUX4可能具有功能重要性，因为串联排列的D4Z4重复序列在至少十一种不同的胎盘哺乳动物物种(非胎盘动物缺乏D4Z4重复序列)中是保守的，其中在DUX4 ORF内发生最大的序列保守性。其次，过表达的DUX4对体内发育的低等生物的组织培养细胞和胚胎祖细胞是有毒的。至少部分地通过促细胞凋亡机制发生该毒性，指示DUX4转染细胞中的卡斯蛋白酶-3活化，以及在两细胞阶段注射DUX4 mRNA的发育停滞的非洲爪蟾胚胎中存在TUNEL阳性细胞核。这些发现与示出FSHD患者肌肉中存在一些促细胞凋亡蛋白(包括卡斯蛋白酶-3)的研究一致。除了刺激细胞凋亡之外，DUX4还可负面调节肌细胞生成。人DUX4潜在地通过干扰PAX3和/或PAX7来体外抑制小鼠C2C12成肌细胞的分化，并且当递送至斑马鱼或非洲爪蟾胚胎的祖细胞时引起发育停滞和一些肌肉标记的染色减少。最后，异常DUX4功能与FSHD患者肌肉中看到的潜在重要分子改变直接相关。具体地，全长人DUX4编码约50kDa的双同源域转录因子，并且在FSHD患者肌肉中可在升高的水平发现DUX4靶标。这些数据支持DUX4催化许多与维持正常肌肉完整性不相容的下游分子改变。
附图说明
图1示出野生型U6-1启动子(SEQ ID NO：3)和在PSE区域内具有突变的弱化的U6-1启动子(SEQ ID NO：4)。PSE区域在图1中加下划线。
图2A和2B陈述DUX4靶向miRNA的序列。在每个图中，顶部序列指示从中转录每个相应miRNA的DNA模板。在上图中，DNA模板miDUX4.405(miDUX4-1或mi405)是SEQ ID NO：1。在下图中，DNA模板miDUX4.1155(miDUX4-2；或mi1155)是SEQ ID NO：2。折叠的miRNA转录物示出为发夹结构。miDUX4.405折叠的miRNA是SEQ ID NO：8。miDUX4.1155折叠的miRNA是SEQID NO：9。成熟miDUX4.405和miDUX4.1155序列在通过宿主miRNA加工机制(包括Drosha、DGCR8、Dicer和Exportin-5)在靶细胞中加工后产生。灰色阴影的序列指示用于将每个miRNA克隆到U6T6载体中的限制位点。CTCGAG是XhoI位点，并且ACTAGT是SpeI位点(RNA中的CUCGAG和ACUAGU，其中U是尿嘧啶碱基)。红色序列指示成熟miRNA反义引导链，其最终有助于催化DUX4靶mRNA的切割。该序列在该图的miRNA发夹部分中也加下划线。灰色和黑色箭头分别指示Drosha和Dicer催化的切割位点。提供数字13、35、53和75用于定向。在(并且包括)35-53位之间的序列衍生自自然人mir-30a序列，除了39位处的A，其是G是正常的mir-30a序列。基于计算机模拟RNA折叠模型，将该核苷酸改变为A以促进miRNA环的折叠。茎的碱基(13位的5'和75位的3')也衍生自具有根据引导链的一级序列的一些修饰的mir-30a结构和序列。具体地，13位处的核苷酸可变化以帮助促进13和75位核苷酸之间所需的不匹配。假设这种凸起的结构促进适当的Drosha切割。
图3示出示例性的修饰的U6启动子系统。图A示出几种基于tMCK的系统，以表达miDUX4并且测试其在过表达V5示踪的DUX4的人成肌细胞中的功能。代表性西方示出我们最好的tMCK.miDUX4(Var1)，沉默的DUX4蛋白的水平与U6.miDUX4相当。图B示出弱化的U6启动子miDUX4发育。WT U6启动子驱动高水平的shRNA/miRNA表达，而弱化版本(wU6)产生约少16倍的转录物而不显著影响靶基因沉默。在荧光素酶测定中用miDUX4观察到类似的结果，其中海肾荧光素酶含有DUX4序列并且可被miDUX4沉默。
图4示出去靶心脏和肝脏中的miDUX4的策略。mir-122(肝脏)和mir-208(心脏)的完美结合位点在图中指示。有证据表明mir-122修饰的miDUX4对DUX4-荧光素酶靶具有功能，并且当mir-122结合位点包括在miDUX4序列中时，表达mir-122的肝细胞可抑制miDUX4沉默。
图5示出人DUX4 DNA序列(SEQ ID NO：7)。序列
SEQ ID NO：1(miDUX4.405或miDUX4-1)
SEQ ID NO：2(miDUX4.1155或miDUX4-2)
SEQ ID NO：10-10912、10971、10972：示例性miRNA成熟引导链核苷酸序列
SEQ ID NO：3野生型U6-1启动子
SEQ ID NO：4具有PSE区域内突变的弱化的U6-1启动子。
SEQ ID NO：5miR-122的结合位点(5'TATTTAGTGTGAT AATGGTGTTT 3')
SEQ ID NO：6-miRNA-208的结合位点(5'ACGAGCcTTTT GCTCGTCTTAT 3')
SEQ ID NO：8-miDUX4.405(miDUX4-1)折叠的miRNA
SEQ ID NO：9-miDUX4.1155(miDUX4-2)折叠的miRNA
SEQ ID NO：7-DUX4基因序列
SEQ ID NO：10913-10968包含miDUX4的成熟引导链和miR-122或miR-208的结合位点的示例性核酸序列(也示出于表1中)
SEQ ID NO：10969-miR-122的结合位点(5'UAUUUAGU GUGAUAAUGGUGUUU 3')
SEQ ID NO：10970-miR-208的结合位点(5'ACGAGCcUUUUU GCUCGUCUUAU 3')
SEQ ID NO：10973-miDUX4.405(miDUX4-1)成熟引导链核苷酸序列
SEQ ID NO：10974-miDUX4.1155(miDUX4-2)成熟引导链核苷酸序列
当成熟引导链序列在本文中作为DNA序列呈现时，本领域技术人员理解该DNA序列用作转录成RNA的模板，其中胸苷碱基被转变为尿苷碱基。实例
因此，通过以下实例说明本发明的方面和实施例。实例1描述肝脏和心脏去靶的、弱化的启动子系统。实例2描述用于确定DUX4 miRNA的miRNA表达的影响的荧光素酶测定。实例3描述编码DUX4 miRNA的rAAV载体。
实例1
肝脏和心脏去靶的、弱化的U6启动子系统
肌肉易受大量过剂量miRNA载体的损害。因此，开发修饰的U6启动子系统用于骨骼肌特异性miRNA表达。野生型U6启动子在所述近端序列元件中突变，如图1所示。该突变弱化U6转录并且在AAV8中产生少16倍的shRNA转录，同时维持用于医治肝炎的HCV破坏的效力，如Suhy等人,《分子治疗》20:1737-1749,2012中所述。在本实验中，包含该弱化的U6(wU6)系统的核酸分子驱动miDUX4并且使用荧光素酶测定体外达到显著的DUX4沉默，其中海肾荧光素酶含有DUX4序列。(图3B)。
然而，提出的弱化的U6启动子系统普遍具有活性并且为了达到最高水平的安全性，该启动子系统被进一步修饰以尽可能多地限制骨骼肌的表达。骨骼肌特异性表达的一个选择是使用AAV6载体，因为它主要在血管递送后转导骨骼肌、肝脏和心脏，并且在其它组织中显著更少。为了避免在肝脏和心脏中表达，修饰的U6启动子系统去靶那些组织中的miDUX4。为此，将mir-122和mir-208(肝脏和心脏特异性天然微RNA)的完美结合位点掺入在miDUX4转录物内的不同位置处，如图4所示。使用下文实例2中描述的DUX4-荧光素酶靶标，分别在肝脏和心脏中通过miR-122和miR-208RISC复合物破坏去靶的miDUX4转录物。
实例2
荧光素酶测定DUX4 miRNA表达的影响
测定DUX4靶序列在DUX4 miRNA存在下的表达。在96孔白壁测定板中的293细胞中进行脂质体2000转染。用20ng含有DUX4靶序列的海肾-萤火虫质粒和180ng各种DUX4 miRNA编码载体，包括来自实例1的U6T6驱动的miDux4.405或miDux4.1155载体转染140,000个细胞。24小时后执行荧光素酶测定。
从细胞中除去培养基，并且每孔添加20μl裂解缓冲液。将板在室温下放在振荡器上15分钟，然后添加50μl荧光素酶底物。在10分钟后进行第一次读数。接下来，添加50μl的Stop和Glo荧光素酶底物，并且在10分钟后进行第二次读数。将海肾表达除以萤火虫表达以计算相对表达。然后将相对表达归一化为用靶向eGFP的对照miRNA转染的细胞的表达。DUX4miRNA miDUX4.405和miDUX4.1155在降低转染细胞中荧光素酶蛋白表达方面最有效。使用下文实例1中描述的DUX4-荧光素酶靶标，分别在肝脏和心脏中通过mir-122和mir-208RISC复合物破坏去靶的miDUX4转录物。
实例3
产生编码DUX4微RNA的rAAV
通过在三种质粒(pAdhelper、AAV辅助细胞和含有miDUX4的rAAV基因组；下文详细描述)的HEK293细胞中共转染产生载体，然后进行细胞收获、载体纯化、滴定和质量控制测定。
质粒：pAdhelper含有腺病毒基因E2A、E4ORF6和VA I/II；AAV辅助质粒含有AAVrep2和cap6(例如，对于AAV血清型6制剂，衣壳基因将称为cap6)；rAAV质粒含有侧翼遗传元件的AAV反向末端重复序列(ITR)序列，以包装到载体中。对于AAV.miDUX4，这包括克隆在CMV.eGFP报道基因上游的U6.miDUX4。
转染：使用CaPO4以4:4:1的比例(每板20μg pAd辅助剂:20μg AAV辅助剂:5ugrAAV载体质粒将质粒转染到293细胞(Corning 10-Stack)中。
细胞收获：转染后四十八小时，收获细胞并且以5×106个细胞/毫升的密度重悬于20mM Tris(pH 8.0)、1mM MgCl2和150mM NaCl(T20M1N150)中。通过四次连续冷冻/解冻循环裂解细胞，并且在细胞裂解物澄清之前添加Benzonase核酸酶(AIC，储备：250U/ul)至终浓度90U/ml。
载体纯化和滴定：如前所述，将澄清的裂解物进行碘克沙醇步骤梯度纯化(Xiao,X等人,《病毒学杂志》72:2224-32)。将40％碘克沙醇层(含有rAAV)用无盐稀释缓冲液(pH根据血清型而变化)稀释5倍，并且应用于Hi-Trap HP-Q/S柱。用NaCl盐梯度洗脱后，合并峰1ml级分(通常3-5个)，用T20M1N200(pH 8.0)透析，然后无菌过滤并且补充0.001％Pluronic F68。载体被储存在-80℃。如前所述，使用Q-PCR滴定纯化病毒的vg(Schnepp和Clark,《分子医学方法》,69:427-443(2002))。

Claims (28)

1.一种核酸分子，其包含修饰的U6启动子序列、包含至少一个去靶序列的miRNA的成熟引导链和在5'端处的5至6个胸苷。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述去靶序列是miRNA-122或miRNA 208的结合位点。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述修饰的U6启动子序列至少包含近端序列元件(PSE)区域或远端序列元件(DSE)中的取代、插入或缺失。
4.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述修饰的U6启动子序列包含在PSE序列中在核苷酸-66处将胞嘧啶取代为胸苷、在核苷酸-57处将胞嘧啶取代为胸苷，并且在核苷酸-52处将胸苷取代为胞嘧啶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述miRNA的成熟引导链是miDUX4、miRN92、miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-19b-1、mi-RNA-26a、miRNA-126、miRNA-335、let-7a和let-7b、miRNA-34、miR-34a、miRNA-10b、miRNA-208、miRNA-499、miRNA-195、miRNA-29a、miRNA-29b或miRNA-29c。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述miRNA的成熟引导链包含SEQID NO：8482、SEQ ID NO：8372、SEQ ID NO：8371、SEQ ID NO：8370、SEQ ID NO：8367、SEQ IDNO：8366、SEQ ID NO：8365、SEQ ID NO：8219、SEQ ID NO：8218、SEQ ID NO：8152、SEQ IDNO：8147、SEQ ID NO：8145、SEQ ID NO：7397、SEQ ID NO：7396、SEQ ID NO：7395、SEQ IDNO：7108、SEQ ID NO：7107、SEQ ID NO：7106、SEQ ID NO：6633、SEQ ID NO：6631、SEQ IDNO：6622、SEQ ID NO：6619、SEQ ID NO：6609、SEQ ID NO：6608、SEQ ID NO：6568、SEQ IDNO：6561、SEQ ID NO：6560、SEQ ID NO：10971或SEQ ID NO：10972的核苷酸序列。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述miRNA的成熟引导链是miDUX4。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1、2或10913-10968中的任一个的核酸序列。
9.一种载体，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的载体，其中所述载体是质粒、腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、马相关病毒、甲病毒、痘病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒或牛痘病毒。
11.一种重组腺相关病毒，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的重组腺相关病毒，其中AAV是AAV6、AAV rh.74或AAV-B1。
13.一种组合物，其包含根据权利要求9或10所述的载体或根据权利要求11或12所述的重组腺相关病毒。
14.一种抑制细胞中基因表达的方法，其包含使所述细胞与包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物接触。
15.一种抑制细胞中DUX4基因表达的方法，其包含使所述细胞与包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物接触。
16.一种将DUX4 miRNA编码DNA递送至有需要的动物的骨骼肌的方法，其包含向所述动物给药包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物。
17.一种医治面肩肱型肌营养不良症的方法，其包含给药包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述重组腺相关病毒通过肌内注射、透皮转运、注射到血流中或注射到肝脏中来给药。
19.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的用途，其用于制备用以抑制细胞中基因表达的药物。
20.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的用途，其用于制备用以抑制细胞中DUX4基因表达的药物。
21.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的用途，其用于制备用以将DUX4 miRNA编码DNA递送至有需要的动物的骨骼肌的药物。
22.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的用途，其用于制备用以医治面肩肱型肌营养不良症的药物。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的用途，其中所述药物被配制成用于肌内注射、透皮转运或注射到血流中。
24.一种包含包括根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的组合物，其用于抑制细胞中的基因表达。
25.一种包含包括根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的组合物，其用于抑制细胞中的DUX4基因表达。
26.一种包含包括根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的组合物，其用于将DUX4 miRNA编码DNA递送至有需要的动物的骨骼肌。
27.一种包含包括根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子的重组腺相关病毒或根据权利要求13所述的组合物的组合物，其用于医治面肩肱型肌营养不良症。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于肌内注射、透皮转运或注射到血流中。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3077057A1 (en) * 2017-10-02 2019-04-11 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Mirna detargeting system for tissue specific interference
CN108823209B (zh) * 2018-07-18 2021-04-09 华中农业大学 骨骼肌特异性启动子及应用
MX2023002853A (es) 2020-09-11 2023-03-31 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de arni para inhibir la expresion de dux4, composiciones de dichos agentes, y metodos de uso.
US20220333115A1 (en) * 2021-04-15 2022-10-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for inhibition of expression of dynamin-1 variants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100186103A1 (en) * 2008-05-28 2010-07-22 University Of Massachusetts Isolation Of Novel AAV'S And Uses Thereof
WO2013016352A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-31 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
PT733103E (pt) 1993-11-09 2004-07-30 Targeted Genetics Corp Criacao de elevados titulos de vectores de aav recombinantes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
EP0932418B1 (en) 1996-09-06 2007-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
CA2302992C (en) 1997-09-05 2011-11-01 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US7056502B2 (en) 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
DK1453547T3 (en) * 2001-12-17 2016-12-05 Univ Pennsylvania ADENOASSOCATED VIRUS (AAV) SEROTYPE 8 SEQUENCES, VECTORS CONTAINING THESE AND APPLICATIONS THEREOF
AR051895A1 (es) * 2005-01-07 2007-02-14 Ard Of Higher Education On Beh Metodo para disparar la interferencia de arn
US8258286B2 (en) 2007-04-26 2012-09-04 University Of Iowa Research Foundation Reduction of off-target RNA interference toxicity
US8735064B2 (en) 2007-12-24 2014-05-27 Bergenbio As Methods for creating and identifying functional RNA interference elements
JP2013533847A (ja) 2010-04-23 2013-08-29 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ コレステロール関連障害のａａｖベースの治療
EP3118316A1 (en) 2010-09-02 2017-01-18 Université de Mons Agents useful in treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2012143401A1 (en) * 2011-04-18 2012-10-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Tissue-specific regulation of transgene expression
WO2013120038A2 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 Regents Of The University Of Minnesota Morpholino targeting dux4 for treating fshd
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
HRP20211563T1 (hr) 2013-07-11 2022-01-07 Modernatx, Inc. Pripravci koji sadrže sintetske polinukleotide koji kodiraju proteine srodne crispr-u i sintetske sgrna, te postupci njihove uporabe
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
DK3119797T3 (da) 2014-03-18 2021-03-15 Univ Massachusetts Raav-baserede sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af amyotrofisk lateralsklerose
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
WO2016014846A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100186103A1 (en) * 2008-05-28 2010-07-22 University Of Massachusetts Isolation Of Novel AAV'S And Uses Thereof
WO2013016352A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-31 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A GEISLER ET AL.: "microRNA122-regulated transgene expression increases specificity of cardiac gene transfer upon intravenous delivery of AAV9 vectors", 《GENE THERAPY》 *
DAVID A SUHY ET AL.: "Safe, Long-term Hepatic Expression of Anti-HCV shRNA in a Nonhuman Primate Model", 《MOLECULAR THERAPY》 *
杨伟等: "miR-208a在心脏疾病中的作用", 《广东医学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022046792A (ja) 2022-03-23
AU2017240236C1 (en) 2024-03-07
US20190136235A1 (en) 2019-05-09
AU2017240236A1 (en) 2018-10-18
KR102453187B1 (ko) 2022-10-07
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