CN108823209B - 骨骼肌特异性启动子及应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于基因工程应用和生物技术领域。本发明提供了一种改造的骨骼肌特异性启动子2eMCK‑pMCK‑T208，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。将其与目的基因相连后，通过腹腔注射发现在心肌中经2eMCK‑pMCK‑T208启动表达的目的蛋白表达量比2eMCK‑pMCK低，表现为差异显著，而在骨骼肌中经2eMCK‑pMCK‑T208启动表达的目的蛋白表达量与2eMCK‑pMCK启动的相比，其差异不显著。本发明所公开的启动子能使外源基因在骨骼肌中高效特异性表达，不但可以提高猪肌肉品质，还可以降低因启动子特异性不高而带来的潜在危害。

Description

骨骼肌特异性启动子及应用

技术领域

本研究涉及属于基因工程应用和生物技术领域，涉及骨骼肌特异性启动子和miR-208 及应用，该改造启动子降低了目的基因在心肌中的表达水平，从而提高启动子组织特异性。

背景技术

在基因编辑技术越来越成熟的现在，使外源基因能够在体内特异性表达已成为基因编辑技术应用的一个亟待解决的问题。而我们利用转基因技术改善猪肌肉品质也遇到了类似的问题。

目前对外源基因进行肌肉特异性调控的启动子有许多。肌肉特异性unc45b有助于肌节肌球蛋白的折叠。斑马鱼肌肉特异性基因unc45b最小启动子503unc可以驱动斑马鱼肌肉组织中的基因表达(Berger and Currie 2013)。在哺乳动物中，肌肉肌酸激酶(MCK)基因在从成肌细胞向肌细胞分化过程中被激活，并且已经充当肌肉发育的标志并且驱动转基因小鼠中的转基因表达。MCK启动子在幼年蝌蚪和成年蛙中的骨骼肌高效转基因表达(Lim,Neff et al.2004)。肌营养不良蛋白启动子可以使外源基因在小鼠的骨骼肌的中表达，其恢复肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物(Anderson,De Repentigny et al.2006)。但是这些肌肉特异性启动子并不是骨骼肌特异性启动子，有些除了在骨骼肌中高效表达外，在心肌中也有较高的表达水平，例如MCK基因启动子。

miRNA是转录后调控元件，能够与mRNA 5’UTR区结合从而沉默或降解目的基因。大量的研究表明miRNA的表达具有组织特异性(Barad,Meiri et al.2004,Baskerville andBartel 2005)。MiR-208家族能调节心脏应激反应，是具有高度保守性以及心肌组织特异性的一类miRNA(van Rooij,Sutherland et al.2007,Montgomery,Hullinger et al.2011)，在心肌疾病的研究中起着重要作用。Wang等人的研究结果表明：90.9％AMI病人和100％症状发作4个小时内的AMI患者容易检测到miR-208a。这也说明，miR-208a可以作为早期A MI更敏感的标志物。心脏纤维化可导致心肌机械僵硬，从而导致其收缩功能出现障碍，而Satoh等人的数据表明miR208a是参与心脏纤维化和肥厚性生长的基因表达的基础。

目前所应用的肌肉特异性启动子并不仅仅只在骨骼肌中表达，其在心肌中也有较高水平的表达。而尽管miR-208在心肌疾病中的研究比较深入，但是关于miRNA在5’UTR区发挥作用并无相关报道。本发明利用miR-208心肌特异性和转录后水平调控的特点，将miR-208的种子序列与肌肉特异性启动子串联，以降低该启动子在心肌中的表达，从而提高启动子骨骼肌特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种骨骼肌特异性启动子，所述启动子命名为：2eMCK-pMCK- T208，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供SEQ ID NO.1所示的骨骼肌特异性启动子的应用，将该启动子与目的基相连，可启动目的基因在骨骼肌中的的特异性表达。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种骨骼肌特异性启动子2eMCK-pMCK-T208，所述启动子的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。

启动子2eMCK-pMCK-T208的应用，是将目的基因与2eMCK-pMCK-T208连接后，在骨骼肌中进行表达，本发明提供的启动子可用于提高目的基因在骨骼肌中的表达特异性。

含有启动子2eMCK-pMCK-T208的表达载体也属于本发明的保护内容。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明将肌肉特异性启动子与miR-208结合应用，改造成骨骼肌特异性启动子。该启动子相对于以往的肌肉特异性启动子而言，不仅具有较高的活性，而且在骨骼肌中的特异性较高。除此之外，该启动子片段较小，为以后利用转基因研究肌肉品质降低了难度。

附图说明

图1为pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP和pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EG FP转染小鼠后mCherry在心肌和骨骼肌中的表达情况示意图。

上图为心肌中mCherry的表达水平，下图为骨骼肌中mCherry的表达水平(**表示差异极显著，P<0.01；NC表示差异不显著，P>0.05)。

图2为pGL3-Basic、pGL3-Control以及pRL-TK真核表达载体示意图。

图3为pGL3-mCherry-EGFP载体信息示意图。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

胶回收试剂盒Gel Extraction Kit(购自Omega Bio-tek公司)、Fast Digest KpnⅠ、Fa st Digest XhoⅠ、Fast Digest AgeⅠ(购自于Fermentas公司)、T4Ligase(购自Fermentas 公司)、DNA纯化试剂盒(购自BioFlux)、感受态大肠杆菌(购自全式金)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)。

实施例1：

pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP载体的构建：

1)pGL3-mCherry-EGFP载体的构建

A.分别根据pCMV-C-EGFP、pGL3-Control和pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B载体序列设计引物扩增EGFP、SV40poly(A)和mCherry序列。引物见表1。

表1 EGFP、SV40poly(A)和mCherry引物

表1说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。

表2 PCR体系

PCR反应才程序:98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸2s，变性至延伸35个循环后，72℃延伸3min。

PCR产物纯化回收：将扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳20min 后紫外灯下将目的条带切下，放入1.5ml离心管中，然后经PCR产物纯化试剂盒，按其说明书回收纯化PCR产物，将回收产物保存至-20℃备用。

B.用HindIII和XbaI内切酶酶切pGL3-Control和EGFP片段，酶切体系见表3。

表3：双酶切体系

37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

回收产物连接：利用T4Ligase，将纯化后的EGFP片段连接与pGL3-Control载体连接。连接体系：2μl EGFP，0.5μl线性化pGL3-Control，1μl 10×Ligase Buffer，0.1μlT4Ligase，6.4μl ddH₂O。将混合体系放置22℃2h。

连接产物转化感受态大肠杆菌：从-80℃冰箱取出感受态大肠杆菌，冰上融化，用灭菌的枪头将连接产物加入到50μl感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再次冰浴 2-3min，然后向感受态中加入500μl无抗生素的也已培养基，于摇床中(37℃，180r) 摇45min。随后3000r离心3min，去450μl上清，用移液枪吹打使细菌完全悬浮，并将菌液涂布于含有100μg/ml氨苄的固体培养基上，37℃正置30min，再倒置12-16h。

筛选阳性克隆并测序鉴定：用灭菌枪头从平板中蘸取单克隆接入400μl含100μg/ml氨苄霉素的液体培养基中，放入220r、37℃摇床扩大培养6h。以菌液为模板，用插入载体的目的片段的引物对按扩增条件进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有目的条带表明该克隆可能为阳性菌。

将阳性菌送至奥克生物有限公司进行测序并对比。将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，该质粒命名为pGL3-EGFP。

C.用XhoI和BglII内切酶酶切pGL3-EGFP和poly(A)片段，酶切体系见表4。

表4：双酶切体系

37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

回收产物连接：利用T4Ligase，将纯化后的poly(A)片段连接与pGL3-EGFP载体连接。连接体系：2μl poly(A)，0.5μl线性化pGL3-EGFP，1μl 10×Ligase Buffer，0.1μlT4Ligase，6.4μl ddH₂O。将混合体系放置22℃2h。

连接产物转化感受态大肠杆菌：同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。

筛选阳性克隆并测序鉴定：同pGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。将构建好的质粒命名为pGL3-EGFP-A。

D.用XhoI和EcoRI内切酶酶切pGL3-EGFP-A和mCherry片段，酶切体系见表5。

表5：双酶切体系

37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

回收产物连接：利用T4Ligase，将纯化后的mCherry片段连接与pGL3-EGFP-A载体连接。连接体系：2μl mCherry，0.5μl线性化pGL3-EGFP-A，1μl 10×Ligase Buffer， 0.1μlT4Ligase，6.4μl ddH₂O。将混合体系放置22℃2h。

连接产物转化感受态大肠杆菌：同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。

筛选阳性克隆并测序鉴定：同pGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。将构建好的质粒命名为pGL3-mCherry-EGFP。

2)猪pGL3-T208-mCherry-EGFP载体的构建

根据猪THRAP1基因序列数据，设计引物。上游引物酶切位点为XhoⅠ，下游引物的酶切位点为AgeⅠ，以PK-15细胞基因组为模板扩增长78bp的miR-208的种子序列T208。引物见表6，PCR体系如见表7。

表6本发明设计的T208引物序列

表6说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。

表7 PCR扩增T208体系

PCR反应才程序:98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸2s，变性至延伸35个循环后，72℃延伸3min。

PCR产物纯化回收：与pGL3-mCherry-EGFP中PCR产物纯化回收过程一致。

用XhoⅠ和AgeⅠ内切酶酶切pGL3-mCherry-EGFP和T208，酶切体系见表8。

表8：双酶切体系

37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

回收产物连接：利用T4Ligase，将纯化后的T208片段连接与pGL3-mCherry-EGF P载体连接。连接体系：2μl T208，0.5μl线性化pGL3-mCherry-EGFP，1μl 10×LigaseBuffer，0.1μl T4Ligase，6.4μl ddH₂O。将混合体系放置22℃2h。

连接产物转化感受态大肠杆菌：同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。

筛选阳性克隆并测序鉴定：同pGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。

构建好的质粒命名为pGL3-T208-mCherry-EGFP。

2)pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP载体的构建：

(1)pGL3-2eMCK-pMCK载体的构建

A、根据猪MCK基因序列数据，设计引物pMCK-F、pMCK-R，上游引物酶切位点为N heⅠ，下游引物的酶切位点为XhoⅠ，以PK-15细胞基因组为模板扩增长1042bp的启动子截短片段pMCK；用NheⅠ和XhoⅠ内切酶酶切pGL3-Basic载体和pMCK，将酶切后的p MCK DNA片段利用T4Ligase连接pGL3-Basic载体中的NheⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，随后经转化、阳性鉴定、质粒提取获得载体，命名为pGL3-pMCK载体；

表9 pMCK启动子引物

表9说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。

B、根据猪MCK基因序列数据，设计两对引物，一对上游引物酶切位点为MluⅠ，下游引物的酶切位点为NheⅠ，另一对上游引物酶切位点为KpnⅠ，下游引物的酶切位点为M luⅠ，本步骤的上游引物酶切位点为MluⅠ，下游引物的酶切位点为NheⅠ；以PK-15细胞基因组为模板扩增长260bp的增强子片段eMCK；用MluⅠ和NheⅠ内切酶酶切pGL3-pMC K载体和eMCK，将酶切后的pMCK DNA片段利用T4Ligase连接pGL3-pMCK载体中的 MluⅠ和NheⅠ酶切位点之间，随后经转化、阳性鉴定、质粒提取获得载体，命名为pGL3- eMCK-pMCK载体；

表10 eMCK增强子引物

表10说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。

C、更换(B)中引物的酶切位点，上游引物酶切位点为KpnⅠ，下游引物的酶切位点为M luⅠ，以PK-15细胞基因组为模板扩增长260bp的增强子片段eMCK；用KpnⅠ和MluⅠ内切酶酶切pGL3-eMCK-pMCK载体和eMCK，将酶切后的pMCK DNA片段利用T4Ligase 连接pGL3-pMCK载体中的KpnⅠ和MluⅠ酶切位点之间，随后经转化、阳性鉴定、质粒提取获得载体，命名为pGL3-2eMCK-pMCK载体。

(2)pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP载体的构建

KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pGL3-T208-mCherry-EGFP载体和pGL3-2eMCK-pMCK载体，双酶切体系见表11。

表11双酶切体系

37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

利用T4Ligase，将2eMCK-pMCK片段与pGL3-T208-mCherry-EGFP载体连接。

连接体系：2.5μl 2eMCK-pMCK，1μl线性化pGL3-T208-mCherry-EGFP，1μl 10×Ligas e Buffer，0.1μl T4Ligase，5.4μl ddH₂O。将混合体系放置22℃2h。

连接产物转化感受态大肠杆菌：同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。

筛选阳性克隆并测序鉴定：同pGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。

该质粒命名为pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP。

3)对照组载体的构建：

用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pGL3-2eMCK-pMCK载体(目的条带2eMCK-pMCK)和pGL 3-mCherry-EGFP载体；

利用T4Ligase，将2eMCK-pMCK片段与线性化pGL3-mCherry-EGFP载体连接。产物转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒命名为pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP。

实施例3:

启动子特异性的鉴定

小鼠腹腔注射

(1)120μg质粒(pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP或pGL3-2eMCK-pMCK-T2 08-mCherry-EGFP)稀释于300μl 5％无菌葡萄糖液，震荡混匀。

(2)稀释、18μl HiGene于300μl 5％葡萄糖，震荡混匀。

(3)将稀释的HiGene加至质粒溶液中，立即震荡混匀，低速瞬时离心将液体甩至管底。

(4)室温静置20min。

(5)经腹腔注射入小鼠体内。

(6)48h收集小鼠心肌与腿肌，并于液氮中保存。

组织样RNA提取

Trizol法提取心脏、肌肉两种组织RNA，利用TAKARA公司的反转录试剂盒合成cDNA

RNA水平检测启动子特异性。

根据mCherry和EGFP基因序列，利用Primer 5.0设计定量引物，其中EGFP作为内参。

表12mCherry和EGFP的定量引物

采用Roche公司的LightCycler480Real-Time PCR Detection System，使用CWBIO公司的UltraSYBR Mixture进行定量PCR的扩增。使用LightCycler 480Software 1. 5软件，参照2-ΔΔCt方法，β-actin作为内参，ΔΔCt＝(Ct Target-Ctβ-actin)Apiece-(CtTarget–Ctβ-actin)Control。其中，Target为待检测基因的Ct值，Apiece为每个cDNA 样的Ct值与内参Ct值的差，Control是所有Apiece中ΔCt值最大的一个作为参考值。待检测cDNA样的各个待检测基因的相对表达倍数为2-ΔΔCt。

qPCR反应体系

qPCR反应才程序:95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸12s，变性至延伸40个循环后，54℃0.05s/℃，95℃1min。

申请人利用Excel对数据进行分析。再利用GraphPad Prism 5绘制柱形图，统计结果显示注射pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP的小鼠心脏中mCherry的表达量显著下降，与pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP相比下降了12倍，而腿肌中mCherr y的表达量无明显变化。结果见图1。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 骨骼肌特异性启动子及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1658

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctctgacc cgagttgccg cccagcctcc tccccctgcg ggtgggtgtg gacgcctccc 60

cagggccggg gctgtggctg cccttgtaag gaggtgaggc ctggggacac cagagaggcc 120

tggttataat taaccgggac acgtggccag cccgccccca acacctgccc ccgcccctgc 180

ccccatcccc agcgcctcgg gtctcccgga ggagacagcg agtagcgagc tctaaaaata 240

aactcccttt tctgcaagcc ggtacctgct ctgacccgag ttgccgccca gcctcctccc 300

cctgcgggtg ggtgtggacg cctccccagg gccggggctg tggctgccct tgtaaggagg 360

tgaggcctgg ggacaccaga gaggcctggt tataattaac cgggacacgt ggccagcccg 420

cccccaacac ctgcccccgc ccctgccccc atccccagcg cctcgggtct cccggaggag 480

acagcgagta gcgagctcta aaaataaact cccttttctg caagccacgc gtccacagag 540

tctcctcaac cccgagagcc ctgtgctctg acccgagttg ccgcccagcc tcctccccct 600

gcgggtgggt gtggacgcct ccccagggcc ggggctgtgg ctgcccttgt aaggaggtga 660

ggcctgggga caccagagag gcctggttat aattaaccgg gacacgtggc cagcccgccc 720

ccaacacctg cccccgcccc tgcccccatc cccagcgcct cgggtctccc ggaggagaca 780

gcgagtagcg agctctaaaa ataaactccc ttttctgcaa gcctgcaggc cctgtcccct 840

ccagcgtgga atcacccagt gtcactgggc cctgcgccgc ttctggcctg gctttgagtc 900

tgaatggccc ccctgggccc ggcctcgtgt cccccccact gccatcaagg agggaaaacc 960

cgctaagcac aggcatcagg gatcaggctg cccagctccc acctctgccc gggtcacagg 1020

ctccctgtag ccgggtgaca gtaggcaaat cacgcagcct ctctgggcca ctatttcctc 1080

ctctggagaa ccagacactt ggtccttctg ggatgatggc agggtttccc cagaagcagg 1140

gctcaggact ttgctggggt caaggccacc ctgggggcca aggagagact ggcggcctag 1200

cggagggcca ggggagggtg gtttctacgt gcctgggaca gcctctgaca cagtcccgtg 1260

gccccggcgg ggggccagct gtccccgcca gcccgactca gcacttggtc tggggaccag 1320

cttggtttgg gggtgggggg tgggcccagc ccctggggcg gcccatacaa ggccatgggg 1380

ctgggcgcaa ggcacgcctg ggttcagggt gggcacggtg cccaggcagc gaagcgagag 1440

cgcagctgcc ctccaccccc ctcctggcca gcggcccctc ctgaccaata gcacaacctg 1500

ggccccccct ataaaaggcc agggctgcag tcctgtcctt tgggtcagtg tcgcctccag 1560

gatacagacg ccccctcgag ttatactgcc ttcttgcttt aaagcaattg gtctaaaata 1620

tatgtaatcg tcttaattaa aaagttacag tagggttg 1658

Claims (3)

1.一种人工合成的骨骼肌特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的启动子在提高目的基因在猪或小鼠的骨骼肌中的表达特异性中的应用。

3.含有权利要求1所述启动子的表达载体。

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