CN103074370A - 肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体，该转基因载体含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增强子、2kb猪的α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、猪的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因-嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆，以构建高瘦肉率的Follistatinmus转基因猪。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体。
背景技术
猪肉作为中国人民的主要肉类食品，保证全国人民有充足的、优质的猪肉供应是关系到人民日常生活的重要事件。而随着人口的增长和人民生活水平的提高，除了对猪肉的需求量增加以外，对猪肉的质量和口感的要求也提高了。因此，有必要建立和改良中国自己的猪的品种，改善猪肉口感和质量，以满足人民群众的生活需求。
Follistatin是由肌肉细胞分泌到血液中的一种糖蛋白，它可与抑制肌肉生长的Myostatin结合，从而拈抗Myostatin的功能，进而促进肌肉的生长。已在小鼠和猴中通过实验证明，将表达Follistatin的腺病毒群(Adeno-associated Virus)注射到肌肉中，可有效地促进肌肉的生长，不仅提高了肌肉的重量，还增强了肌肉的力量(Haidet A.M.et al.″Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administrationof myostatin inhibitors.″Proc Natl Acad Sci U S A，2008.105：4318-4322；Kota，J.et al.“Follistatin gene delivery enhances muscle growth and strength in nonhuman primates”.SciTransl Med，2009.1，6ra15)。基于这些数据，我们预期在猪的骨骼肌中过表达Follistatin可提高猪的瘦肉率，并可改善肌肉的品质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
转基因载体含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增强子、2kb猪的α-骨骼肌肌动蛋白(α-skeletal actin)基因的启动子、猪的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因(bGH)的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因--嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素(Zeocin)基因(见图2)。
2kb的α-骨骼肌肌动蛋白(α-skeletal actin)的启动子可保证下游的基因在骨骼肌中特异表达，而且MCK增强子也具有肌肉组织特异性的增强子活性，可特异地促进下游基因的高表达。在此转基因载体中表达的是猪自身的Follistatin基因，所以从食品安全的角度讲，对消费者的健康没有任何影响。此外，本发明在嘌呤霉素和博莱霉素抗性基因的两端还加入LoxP序列，这样，在Follistatin基因整合到基因组DNA后，如有需要，本发明可通过表达Cre蛋白，诱导LoxP序列的重组，以除去抗性基因，进一步保障转基因动物的食品安全性。
本发明所构建的在肌肉组织特异表达猪Follistatin的转基因载体pML34的全序列如SEQ ID No：1所示。其中，第10-1044碱基为猪Follistatin编码区，第1064-1277碱基为bGH 3’端不翻译区，第1453-1486碱基为LoxP，第1842-2513碱基为嘌呤霉素抗性基因，第2571-2942碱基为博莱霉素(Zeocin)抗性基因，第2952-2985碱基为LoxP，第4459-4809碱基为MCK增强子，第4905-6838碱基为猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子。
本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆，以构建高瘦肉率的Follistatinmus转基因猪。
附图说明
图1是本发明的技术流程图。
图2是本发明构建的pML34转基因载体的示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：插入LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段，构建pZT1。
将pCDNA3.1(myc-His)a载体(Invitrogen)用PvuII酶切，酶切体系为2μg质粒DNA，3μl 10×buffer，2μl PvuII酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出3.3kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤为，将紫外光下切下目的DNA条带装入1.5ml离心管中，称重后加入3倍体积的溶胶液，55℃保温10分钟，使琼脂糖凝胶完全融化；融化的凝胶待温度降至室温后，将混合液转入附柱中，10,000g离心1分钟，倒掉流出液；加入650μl漂洗缓冲液，10,000g离心1分钟，倒掉流出液；吸附柱再次离心，10,000g离心，1分钟，倒掉流出液；将吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中，加入50μlddH2O，放置1分钟，10,000g离心1分钟收集纯化产物.
从pSNAP载体用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段，酶切体系为3μg质粒DNA，3μl 10×buffer，2μl EcoRV酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.7kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pCDNA3.1(myc-His)a(PvuII)和LoxP-Puro-Zeo-LoxP(EcoRV)连接，连接反应中加入2μl载体，6μl插入片段，1μl 10×buffer，1μl T4DNA连接酶，16℃温浴16小时。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。取一管50μl的Trans5α感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μl上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30分钟；42℃热击30秒，后冰上静置10分钟；加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃震荡培养1小时；4,000rpm离心5分钟，吸走，保留100μl左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄和博莱双抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37℃温箱培养16小时。
克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pZT1。
实施例2：插入猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，构建pZT20。
将pZT1用PvuI和NdeI双酶切，酶切体系为2μg质粒DNA，3μl 10×buffer，1.5μl PvuI酶，1.5μl NdeI酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.0kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
通过全基因合成(Invitrogen)得到2kb长度的猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，用PvuI和NdeI双酶切，酶切体系为3μg质粒DNA，3μl 10×buffer，1.5μlPvuI酶，1.5μl NdeI酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出2kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pZT1(PvuI/NdeI)和猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA(PvuI/NdeI)连接，连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上，除了只用博莱霉素进行抗性筛选。
克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中，37℃震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到3.8kb和2.0kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pZT20。
实施例3：插入MCK增强子DNA片段，构建pML7。
将pZT20用PvuI酶切，酶切体系为2μg质粒DNA，3μl 10×buffer，1.5μl KpnI酶，1.5μl NdeI酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出5.9kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
pZT20载体的去磷酸化，35μl pZT20(PvuI)，4μl 10×buffer，1μl牛小肠碱性去磷酸化酶(CIP)，37℃温浴1小时。然后将反应体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出5.9kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
通过PCR扩增得到MCK增强子DNA片段，PCR条件如下：1μl(约10ng)模板DNA pST181，引物1(gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物2(ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的终浓度均为0.5μM，dNTPs的终浓度为0.2mM，5μl 10×buffer，1μl HiFi Taq酶，加入ddH2O补足体积至50μl。PCR循环为，95℃，2分钟；接着是95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃，5分钟；4℃，保温。然后将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出500bp大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
用PvuI酶切MCK增强子DNA片段，酶切体系为3μg DNA，4μl 10×buffer，3μlPvuI酶，加入ddH2O补足体积至40μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出500bp大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pZT20(PvuI/CIP)和MCK增强子DNA片段(PvuI)连接，连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上，除了只用博莱霉素进行抗性筛选。
克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中，37℃震荡培养12小时，提取质粒DNA，用PvuI酶切鉴定，阳性克隆中可得到5.9kb和0.5kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pML7。
实施例4：插入猪Follistatin编码区域DNA片段，构建pML34。
将pML7用NdeI和PmeI双酶切，酶切体系为2μg质粒DNA，3μl 10×buffer，1.5μl PmeI酶，1.5μl NdeI酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出5.8kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
通过全基因合成(Invitrogen)得到猪Follistatin编码区域DNA片段，用NdeI和PmeI双酶切，酶切体系为3μg质粒DNA，3μl 10×buffer，1.5μl PmeI酶，1.5μl NdeI酶，加入ddH2O补足体积至30μl，37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.0kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pML7(PmeI/NdeI)和猪Follistatin编码区域DNA片段(PmeI/NdeI)连接，连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上，除了只用博莱霉素进行抗性筛选。
克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中，37℃震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到5.0kb、1.5kb和0.2kb的三条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pML34。
Claims (1)
1.一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体，其特征在于，该转基因载体含有小鼠的肌酸激酶增强子、2kb猪的α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、猪的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因--嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。
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|---|---|---|---|---|
| CN104651365A (zh) * | 2015-01-29 | 2015-05-27 | 东北农业大学 | 一个牛α-actin基因的启动子及其应用 |
| CN108823209A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-16 | 华中农业大学 | 骨骼肌特异性启动子及应用 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130501 |