CN103074370A - 肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体 - Google Patents

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戴一凡
陈凌懿
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Abstract

本发明公开了一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体,该转基因载体含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增强子、2kb猪的α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、猪的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域,且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因-嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆,以构建高瘦肉率的Follistatinmus转基因猪。

Description

肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体。
背景技术
猪肉作为中国人民的主要肉类食品,保证全国人民有充足的、优质的猪肉供应是关系到人民日常生活的重要事件。而随着人口的增长和人民生活水平的提高,除了对猪肉的需求量增加以外,对猪肉的质量和口感的要求也提高了。因此,有必要建立和改良中国自己的猪的品种,改善猪肉口感和质量,以满足人民群众的生活需求。
Follistatin是由肌肉细胞分泌到血液中的一种糖蛋白,它可与抑制肌肉生长的Myostatin结合,从而拈抗Myostatin的功能,进而促进肌肉的生长。已在小鼠和猴中通过实验证明,将表达Follistatin的腺病毒群(Adeno-associated Virus)注射到肌肉中,可有效地促进肌肉的生长,不仅提高了肌肉的重量,还增强了肌肉的力量(Haidet A.M.et al.″Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administrationof myostatin inhibitors.″Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105:4318-4322;Kota,J.et al.“Follistatin gene delivery enhances muscle growth and strength in nonhuman primates”.SciTransl Med,2009.1,6ra15)。基于这些数据,我们预期在猪的骨骼肌中过表达Follistatin可提高猪的瘦肉率,并可改善肌肉的品质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
转基因载体含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增强子、2kb猪的α-骨骼肌肌动蛋白(α-skeletal actin)基因的启动子、猪的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因(bGH)的3’端不翻译区域,且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因--嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素(Zeocin)基因(见图2)。
2kb的α-骨骼肌肌动蛋白(α-skeletal actin)的启动子可保证下游的基因在骨骼肌中特异表达,而且MCK增强子也具有肌肉组织特异性的增强子活性,可特异地促进下游基因的高表达。在此转基因载体中表达的是猪自身的Follistatin基因,所以从食品安全的角度讲,对消费者的健康没有任何影响。此外,本发明在嘌呤霉素和博莱霉素抗性基因的两端还加入LoxP序列,这样,在Follistatin基因整合到基因组DNA后,如有需要,本发明可通过表达Cre蛋白,诱导LoxP序列的重组,以除去抗性基因,进一步保障转基因动物的食品安全性。
本发明所构建的在肌肉组织特异表达猪Follistatin的转基因载体pML34的全序列如SEQ ID No:1所示。其中,第10-1044碱基为猪Follistatin编码区,第1064-1277碱基为bGH 3’端不翻译区,第1453-1486碱基为LoxP,第1842-2513碱基为嘌呤霉素抗性基因,第2571-2942碱基为博莱霉素(Zeocin)抗性基因,第2952-2985碱基为LoxP,第4459-4809碱基为MCK增强子,第4905-6838碱基为猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子。
本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆,以构建高瘦肉率的Follistatinmus转基因猪。
附图说明
图1是本发明的技术流程图。
图2是本发明构建的pML34转基因载体的示意图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:插入LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段,构建pZT1。
将pCDNA3.1(myc-His)a载体(Invitrogen)用PvuII酶切,酶切体系为2μg质粒DNA,3μl 10×buffer,2μl PvuII酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出3.3kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤为,将紫外光下切下目的DNA条带装入1.5ml离心管中,称重后加入3倍体积的溶胶液,55℃保温10分钟,使琼脂糖凝胶完全融化;融化的凝胶待温度降至室温后,将混合液转入附柱中,10,000g离心1分钟,倒掉流出液;加入650μl漂洗缓冲液,10,000g离心1分钟,倒掉流出液;吸附柱再次离心,10,000g离心,1分钟,倒掉流出液;将吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中,加入50μlddH2O,放置1分钟,10,000g离心1分钟收集纯化产物.
从pSNAP载体用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段,酶切体系为3μg质粒DNA,3μl 10×buffer,2μl EcoRV酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出1.7kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pCDNA3.1(myc-His)a(PvuII)和LoxP-Puro-Zeo-LoxP(EcoRV)连接,连接反应中加入2μl载体,6μl插入片段,1μl 10×buffer,1μl T4DNA连接酶,16℃温浴16小时。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。取一管50μl的Trans5α感受态细胞置于冰上,待其融化后,向其中加入4μl上述连接产物,轻弹混匀,后于冰上孵育30分钟;42℃热击30秒,后冰上静置10分钟;加入500μl无抗性的LB液体培养基,37℃震荡培养1小时;4,000rpm离心5分钟,吸走,保留100μl左右的培养基,用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄和博莱双抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37℃温箱培养16小时。
克隆生长出来后,挑单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中,37℃震荡培养12小时,提取质粒DNA,用EcoRI酶切鉴定,阳性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性,得到的克隆即为pZT1。
实施例2:插入猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段,构建pZT20。
将pZT1用PvuI和NdeI双酶切,酶切体系为2μg质粒DNA,3μl 10×buffer,1.5μl PvuI酶,1.5μl NdeI酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出4.0kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
通过全基因合成(Invitrogen)得到2kb长度的猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段,用PvuI和NdeI双酶切,酶切体系为3μg质粒DNA,3μl 10×buffer,1.5μlPvuI酶,1.5μl NdeI酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出2kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pZT1(PvuI/NdeI)和猪α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA(PvuI/NdeI)连接,连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上,除了只用博莱霉素进行抗性筛选。
克隆生长出来后,挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中,37℃震荡培养12小时,提取质粒DNA,用EcoRI酶切鉴定,阳性克隆中可得到3.8kb和2.0kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性,得到的克隆即为pZT20。
实施例3:插入MCK增强子DNA片段,构建pML7。
将pZT20用PvuI酶切,酶切体系为2μg质粒DNA,3μl 10×buffer,1.5μl KpnI酶,1.5μl NdeI酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出5.9kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
pZT20载体的去磷酸化,35μl pZT20(PvuI),4μl 10×buffer,1μl牛小肠碱性去磷酸化酶(CIP),37℃温浴1小时。然后将反应体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出5.9kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
通过PCR扩增得到MCK增强子DNA片段,PCR条件如下:1μl(约10ng)模板DNA pST181,引物1(gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物2(ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的终浓度均为0.5μM,dNTPs的终浓度为0.2mM,5μl 10×buffer,1μl HiFi Taq酶,加入ddH2O补足体积至50μl。PCR循环为,95℃,2分钟;接着是95℃,30秒,55℃,30秒,72℃,30秒,35个循环;72℃,5分钟;4℃,保温。然后将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出500bp大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
用PvuI酶切MCK增强子DNA片段,酶切体系为3μg DNA,4μl 10×buffer,3μlPvuI酶,加入ddH2O补足体积至40μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出500bp大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pZT20(PvuI/CIP)和MCK增强子DNA片段(PvuI)连接,连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上,除了只用博莱霉素进行抗性筛选。
克隆生长出来后,挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中,37℃震荡培养12小时,提取质粒DNA,用PvuI酶切鉴定,阳性克隆中可得到5.9kb和0.5kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性,得到的克隆即为pML7。
实施例4:插入猪Follistatin编码区域DNA片段,构建pML34。
将pML7用NdeI和PmeI双酶切,酶切体系为2μg质粒DNA,3μl 10×buffer,1.5μl PmeI酶,1.5μl NdeI酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出5.8kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
通过全基因合成(Invitrogen)得到猪Follistatin编码区域DNA片段,用NdeI和PmeI双酶切,酶切体系为3μg质粒DNA,3μl 10×buffer,1.5μl PmeI酶,1.5μl NdeI酶,加入ddH2O补足体积至30μl,37℃温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离,切出1.0kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。
将pML7(PmeI/NdeI)和猪Follistatin编码区域DNA片段(PmeI/NdeI)连接,连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上,除了只用博莱霉素进行抗性筛选。
克隆生长出来后,挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中,37℃震荡培养12小时,提取质粒DNA,用EcoRI酶切鉴定,阳性克隆中可得到5.0kb、1.5kb和0.2kb的三条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性,得到的克隆即为pML34。
Figure IDA0000102366750000011
Figure IDA0000102366750000021
Figure IDA0000102366750000031
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Figure IDA0000102366750000071
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Claims (1)

1.一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高猪瘦肉率的转基因载体,其特征在于,该转基因载体含有小鼠的肌酸激酶增强子、2kb猪的α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、猪的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域,且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因--嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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