CN103382505B - 利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因确定核心启动子的方法，包括以下步骤：步骤1：构建含7段不同长度MSTN基因5′调控区片段的pGL3-basic-MSTNpro重组体；步骤2：进行目标细胞的培养和铺板；配制步骤1所述pGL3-basic-MSTNpro与脂质体的混合物，用海肾荧光素酶载体pRL-TK为内参，进行细胞共转染；步骤3：用双荧光素酶报告基因进行荧光素酶活性检测。

Description

利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，尤其是一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MSTN基因核心启动子的方法。

背景技术

真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在特异高效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。

肌生长抑制素（Myostatin，又称为GDF8）是转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的一员，是控制骨骼肌生成的关键调节因子，与肌肉生长和肉质有着密切的关系，利用其基因调控区的相关元件构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法。

发明内容

技术要求

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，它具有灵敏度高、检测速度快等优点，并克服转染效率对结果的影响。

本发明是这样实现的：利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，包括以下步骤：

步骤1：根据牛MSTN基因5′调控区序列设计7组两端引物，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得7个不同长度MSTN基因5′调控区片段；对7个不同长度MSTN基因5′调控区片段进行酶切及纯化；再将7个不同长度MSTN基因5′调控区片段与所述的载体质粒的连接；然后筛选重组子；

步骤2：进行目标细胞的培养和铺板；配制步骤1所述pGL3-basic-MSTNpro重组体与脂质体的混合物，以海肾荧光素酶载体pRL-TK为内参，扎克进行细胞转染；

步骤3：用双荧光素酶报告基因进行荧光素酶活性检测；将步骤2所得的共转染后的细胞；经培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取20μl细胞裂解液于酶标板中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。

步骤3中所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。

所述的双荧光素酶活性检测所采用的工作液是通过promega 试剂盒配制获得。

步骤1所述的7对引物，引物P1的上游引物的序列是5′- CGGGGTACCTATCCAACTCCAGGACC-3′，引物P1的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCCAGCAGGACTACTCACA-3′；引物P2的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACC GATCTAATACTGCTCCGC-3′，引物P2的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCGTGGTAGTCATCGTCTT -3′；引物P3的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACC CTGCTCCCAGACCTTACC-3′，引物P3的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCCTGGCGTGGTAGTCATCG-3′；引物P4的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACCGTGTTCACAATGCTCCGAT-3′，引物P4的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGTTCCGTCCTGGCGTGGTAG-3′；引物P5的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACCGCAACTTTAGGATAGGA-3′，引物P5的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCGTGGTAGTCATCGTCTT-3′；引物P6的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACCGACTTGTGACAGACAGGGTT-3′，引物P6的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGGGCGTGGTAGTCATCGTC -3′；引物P0的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACC GTTTGGCTTGGCGTTA -3′，引物P0的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGGGCGTGGTAGTCATCG-3′。

步骤1中，PCR反应的反应条件为:95℃变性3min，95℃循环30s，61℃退火30s，72℃延伸90s，进行30个循环，72℃最终延伸7min。

步骤1中，7个不同长度MSTN基因5′调控区片段与所述载体质粒的连接采用DNA连接试剂盒，进行连接反应。

步骤1中所述的筛选重组子具体方法，取连接产物直接转化感受态大肠杆菌；经过含有氨节青霉素的LB培养基中培养；从培养平板上随机挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用；最后经过酶切、PCR、测序鉴定。

有益效果

本发明设计了7对引物用于扩增不同长度MSTN基因5′调控区片段，将产物用于构建荧光素酶报告基因载体后、进行细胞转染及其启动子活性检测。便于对牛MSTN基因启动子的调控方式及调控元件进行研究。本发明的方法具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。本发明使用的pGL3-Basic报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入启动子的启动活性，并且比较启动子的强弱，能灵活检测不同长度MSTN基因5′调控区片段的启动子活性，还能够克服转染效率对结果的影响。

附图说明

图1为本发明中的7个不同长度MSTN基因5′调控区片段克隆产物的电泳示意图；

图2为本发明中的7个含有不同长度MSTN基因5′调控区片段和报告基因的重组质粒kpnⅠ和xhoⅠ双酶切检测的电泳示意图；

图3为本发明中的7个含有不同长度MSTN基因5′调控区片段和报告基因的重组质粒在C2C12和3T3-L1细胞中检测到启动活性示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明的实施例：利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，具体如下：

一、菌株、质粒以及试剂的准备。

菌株：大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连Takara公司；

细胞系：小鼠C2C12细胞和3T3-L1细胞购自中科院上海细胞库；

质粒：报告载体pGL3-Basic、pRL-TK购自Promega公司。

试剂来源：2×PCR Taq Mix购自天根公司；

T4 DNA Ligase、无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Takara公司；

限制性内切酶kpnⅠ、xhoⅠ、血液DNA提取试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工；

荧光素酶检测试剂盒 Dual-Luciferase®Reporter Assay System购自Promega公司；

LipofectamineTM 2000 购自Invitrogen公司；

DMEM/HIGH GLUCOSE培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司；

OPTI-MEM培养基购自Gibco公司；

其他试剂均为国产分析纯。

试剂配制：

100mM CaCl2溶液：高压蒸汽灭菌20min，4℃储存。

Amp（100 mg/ml）：称取Ampicillin 5g，加50ml超纯水溶解，0.22μm过滤除菌后，按1 ml/份分装，-20 ℃保存。

IPTG贮存液（0.1 M）：称取IPTG 0.6g，用超纯水溶解定容至25 ml，-20℃冷冻保存。

X-gal（20mg/ml）：称取0.4gX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)粉末，溶于二甲基甲酰胺，定容至20ml。0.22μm过滤除菌后，按1 ml/份分装于1.5ml离心管，用铝箔封裹避光保存于-20℃。

LB液体培养基：称取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，置于100ml三角瓶中，加入95ml超纯水溶解，调pH值至7.0，加超纯水至总体积为100ml，121 ℃高压灭菌30 min，冷却至室温，临用时加入抗生素，氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml。

LB固体培养基：称取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，细菌用琼脂1.5g置于100ml三角瓶中，加入95ml超纯水溶解，调pH值至7.0，加超纯水至总体积为100ml，高压灭菌后冷却至45℃左右，加入抗生素(100μg/ml)，摇匀后倒入培养皿。

SOC培养基：称取胰蛋白胨2g，酵母提取物0.5g，加0.05%的NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl2，20 mM葡萄糖配制成100 ml。

PBS缓冲液：KCl 0.29，KH2P040.2g，NaCl 8.0g，Na2HP04·12H20 2.88g，溶于900ml超纯水中，调pH值至7.0-7.2，定容至1000ml，121 ℃高压灭菌30 min后4℃保存。

100倍浓度细胞培养用双抗：青霉素1.0×106IU，链酶素lg，0.9％的生理盐水定容至100ml，0.22 μm过滤除菌后-20℃分装保存，使用时以100倍浓度稀释。

二、重组质粒的构建

步骤一、不同长度MSTN启动子片段重组质粒的构建

1.根据牛MSTN基因5′调控区序列设计7组两端引物，引物特征如表1：

表1 用于PCR扩增的引物信息

注：S、上游引物；A、下游引物

2.以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增。

反应条件为：95℃变性3min，95℃循环30s，61℃退火30s，72℃延伸90s，进行30个循环，72℃最终延伸7min。

3.反应结束后，取5μl反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

（1）加入1.5g的琼脂糖至100ml TAE电泳缓冲液中

（2）微波炉中加热使琼脂糖完全溶解，溶液冷却至60℃（手背接触三角瓶壁不烫手），加入Genview染料，使终浓度为0.5μg/ml，轻轻摇匀。

（3）倒胶，厚度为0.3~0.5cm，然后放置好梳子

（4）待胶冷却后，轻轻拔掉梳子，置于电泳槽中，加电泳缓冲液至完全覆盖胶面

（5）上样，电泳，稳压100V，30-40min

（6）取出凝胶，在紫外灯下检查凝胶，并用凝胶成像系统记录结果

4.试剂盒凝胶回收PCR产物。

（1）PCR产物中加入500μl溶胶液Ⅱ，充分混匀。

（2）56℃水浴至胶熔化，将所得溶液转移至吸附柱中，800orpm室温离心30秒，弃上清。

（3）将吸附柱中加入700μl漂洗液，900orpm室温离心30妙，弃上清。

（4）重复上述步骤一次

（5）将吸附柱于12000rpm室温离心2分钟，除去残留的漂洗液，将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

（6）取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部分滴加20μlddH2O，室温静置1分钟。12000rpm室温离心1分钟洗脱DNA，收集管中溶液。

步骤二、7个不同长度MSTN基因5′调控区片段的酶切及纯化

1.琼脂糖凝胶纯化后的PCR产物与pGL3-Basic载体同时进行kpnⅠ、xhoⅠ双酶切，双酶切体系：

质粒（或PCR产物） l ug

kpnⅠ 1ul

xhoⅠ 1u

10×BSA Buffer B 2 ul

混匀，37℃ 酶切4-6h

2.再次回收以备连接使用

步骤三:连接反应。

酶切产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化，通过T4 DNA Ligase将MSTN基因启动子目的片段连接到pGL3-Basic载体。连接体系：

10×Ligation Buffer 2 ul

T4DNA Ligase 1 ul

目的片段酶切回收产物 16 ul

pGL3-Basic酶切回收产物 1ul。

混匀反应液，16℃连接过夜。

步骤四:筛选重组子。

1.取目的片段与克隆载体的连接产物转化DH5α菌株。转化过程：

取全部连接产物轻轻加入至100μl感受态细菌中，冰中放置30min，每隔5min轻轻晃动离心管一次，42℃水浴加热60-75S，冰浴5 ~10min，加入890μl 37℃预热的SOC培养基，37℃恒温振荡培养60min。涂布于预先涂布氨苄青霉素的LB平板培养基中培养过夜。

2.经过含有氨节青霉素的LB培养基中选择培养。从转化子的平板上随即挑取10个白斑于含氨苄青霉素的LB液体培养基中进行单菌落培养，37℃下以200 r/min摇菌14h。用碱裂解法提取质粒，进行酶切、PCR、测序鉴定。

3.上述测序正确的重组质粒大量扩增，经质粒小量提取试剂盒抽提后用于后续实验。提取方法如下：

1)含pMD-19T-MSTN质粒的菌液1 ml加400 ml LB培养基，37 ℃振荡培养过夜。

2) 8000r/min离心2 min，尽量弃净上清。

3)加250μl溶液I，振荡混匀。

4)加250μl溶液II，颠倒混匀10次，室温静置4-5min。

5)加350μl溶液III，颠倒混匀10次，室温静置2min。

6) 12000r/min离心10 min。

7)吸上清至纯化柱，静置2min，8000r/min离心30s，弃收集管中液体。

8)加500μl buffer HB，8000r/min离心30s，弃收集管中液体。

9)加700μl DNA wash buffer，9000r/min离心30s，弃收集管中液体。

10)重复上述步骤一次。

11) 弃收集管中液体，12000r/min离心2 min，室温下晾干纯化柱内剩余液体。

12)将纯化柱置于一新的离心管，加100μlddH2O水，室温静置5 min，12000r/min离心2min。

13)收集离心得到的液体，分装，-20℃保存。

三、检测牛MSTN基因启动子活性

1．细胞培养与铺板

小鼠成肌细胞C2C12与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1分别在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，静置与37℃，5% CO2培养箱中。

取对数生长期C2C12细胞及3T3-L1细胞分别用台盼蓝计数，以1×105/孔分别接种于24孔细胞培养板，37℃，5% CO2培养箱中培养，待细胞长到80%融合时，开始转染。

2. pGL3-Basic-MSTN-pro/pRL-TK/脂质体共转染。具体方法如下：

（1）弃原培养基，PBS缓冲液清洗2遍，每孔加500μl无血清OPTI-MEM培养基。

（2）将750ng报告质粒pGL3-Basic-MSTN-promoter与60ng pRL-TK用50μl无血清OPTI-MEM培养基稀释，室温孵育5min；

（3）取脂质体lipofectamineTM 2000 2μl同样用50μl无血清OPTI-MEM培养基稀释，室温静置5min；

（4）轻轻混匀上述质粒和脂质体，室温静置20min；

（5）弃24孔板中原培养基，PBS缓冲液清洗2遍，每孔加500μl无血清OPTI-MEM培养基。

（6）将质粒与脂质体混合液，逐滴滴入细胞孔中，并轻轻摇板混匀，置于37℃，5%CO2培养箱中培养孵育；

（7）5h后换10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE细胞培养基继续培养，24h后细胞裂解液裂解细胞，进行双荧光素酶活性分析。

对照组pGL3-Basic空载体以同样方式转染。

3．荧光素酶活性检测

转染24h后，弃培养基，冷的1×PBS清洗两次，每孔加100μlPLB，室温下轻摇细胞15min，使细胞裂解。取20μl裂解产物上清液，加入100μlLARⅡ，用多功能化学发光仪检测pGL3-Basic-MSTN-promoter的萤火虫荧光素酶活性，标记为M1。再加入100μl1×Stop & Glo，检测pRL-TK的海肾荧光素酶活性，标记为M2，M1/M 2即为被检测质粒的相对荧光素酶活性，实验组相对阴性对照组M 1 /M 2 值的倍数即为MSTN的启动活性。每次实验设2复孔，同一转染实验重复4次，取其平均值。

结果

分别将pGL3-Basic-MSTN-pro重组质粒与内参照pRL-TK质粒共转染C2C12细胞和3T3-L1细胞，同时将pGL3-contre作为对照同步转染。24h后进行双荧光素酶检测。由检测结果可知，在转染24h后，重组载体pGL3-Basic-MSTN-pro1在C2C12细胞中具有启动子活性，为pGL3-Basic空载体的21.12倍，在3T3-L1细胞中也具有启动子活性，为空载体的7.71倍，重组载体pGL3-Basic-MSTN-pro2在C2C12细胞中启动子活性为pGL3-Basic空载体的7.08倍，在3T3-L1细胞中启动子活性为空载体的3.35倍。pGL3-Basic-MSTN-pro3在C2C12细胞中启动子活性为pGL3-Basic空载体的14.53倍，在3T3-L1细胞中启动子活性为空载体的5.02倍。pGL3-Basic-MSTN-pro4在C2C12细胞中启动子活性为pGL3-Basic空载体的12.45倍，在3T3-L1细胞中启动子活性为空载体的5.36倍。pGL3-Basic-MSTN-pro5在C2C12细胞中启动子活性为pGL3-Basic空载体的3.88倍，在3T3-L1细胞中启动子活性为空载体的3.27倍。pGL3-Basic-MSTN-pro6在C2C12细胞中启动子活性为pGL3-Basic空载体的2.8倍，在3T3-L1细胞中启动子活性为空载体的3.35倍。pGL3-Basic-MSTN-pro7重组质粒在C2C12细胞中的启动子活性大于3T3-L1细胞中的活性。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州大学

<120> 利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法

<130> nm:

<160> 16

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P1的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P1。

<400> 1

CGGGG TACCT ATCCA ACTCC AGGAC C 26

<210> 2

<211> 27

<212>

<213>人工序列

<220>

<223> 引物P1的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P1。

<400> 2

CCGCT CGAGC CAGCA GGACT ACTCA CA 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>引物P2的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P2。

<400> 3

CGGGG TACCG ATCTA ATACT GCTCC GC 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>引物P2的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P2。

<400> 4

CCGCT CGAGC GTGGT AGTCA TCGTC TT 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P3的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P3。

<400> 5

CGGGG TACCC TGCTC CCAGA CCTTA CC 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P3的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P3。

<400> 6

CCGCT CGAGC CTGGC GTGGT AGTCA TCG 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P4的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P4。

<400> 7

CGGGG TACCG TGTTC ACAAT GCTCC GAT 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P4的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P4。

<400> 8

CCGCT CGAGT TCCGT CCTGG CGTGG TAG 28

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P5的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P5。

<400>9

CGGGG TACCG CAACT TTAGG ATAGG A 26

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P5的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P5。

<400> 10

CCGCT CGAGC GTGGT AGTCA TCGTC TT 27

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P6的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P6。

<400> 11

CGGGG TACCG ACTTG TGACA GACAG GGTT 29

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P6的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P6。

<400> 12

CCGCT CGAGG GCGTG GTAGT CATCG TC 27

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P0的上游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P0。

<400> 13

CGGGG TACCG TTTGG CTTGG CGTTA 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据GenBank中登录的牛肌生长抑制素基因（MSTN）序列（NM_001001525），采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P0的下游引物序列，用于克隆MSTN基因5′调控区片段P0。

<400> 14

CCGCT CGAGG GCGTG GTAGT CATCG 25

Claims (6)

1.一种利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：根据牛MSTN基因5′调控区序列设计7组两端引物，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得7个不同长度MSTN基因5′调控区片段；对7个不同长度MSTN基因5′调控区片段进行酶切及纯化；再将7个不同长度MSTN基因5′调控区片段与载体质粒连接；然后筛选重组子；步骤1所述的7对引物，引物P1的上游引物的序列是5′- CGGGGTACCTATCCAACTCCAGGACC-3′，引物P1的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCCAGCAGGACTACTCACA-3′；引物P2的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACC GATCTAATACTGCTCCGC-3′，引物P2的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCGTGGTAGTCATCGTCTT -3′；引物P3的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACC CTGCTCCCAGACCTTACC-3′，引物P3的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCCTGGCGTGGTAGTCATCG-3′；引物P4的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACCGTGTTCACAATGCTCCGAT-3′，引物P4的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGTTCCGTCCTGGCGTGGTAG-3′；引物P5的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACCGCAACTTTAGGATAGGA-3′，引物P5的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGCGTGGTAGTCATCGTCTT-3′；引物P6的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACCGACTTGTGACAGACAGGGTT-3′，引物P6的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGGGCGTGGTAGTCATCGTC -3′；引物P0的上游引物的序列为：5′- CGGGGTACC GTTTGGCTTGGCGTTA -3′，引物P0的下游引物的序列为：5′- CCGCTCGAGGGCGTGGTAGTCATCG-3′；

步骤2：进行目标细胞的培养和铺板；配制步骤1所述pGL3-basic-MSTNpro重组体与脂质体的混合物，以海肾荧光素酶载体pRL-TK为内参，再进行细胞转染；

步骤3：用双荧光素酶报告基因进行荧光素酶活性检测；将步骤2所得的共转染后的细胞；经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取20μl细胞裂解液于酶标板中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。

2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，其特征在于：步骤3中所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。

3.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，其特征在于：所述的双荧光素酶活性检测所采用的工作液是通过promega 试剂盒配制获得。

4.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，其特征在于：步骤1中，PCR反应的反应条件为:在95℃变性3min，再在95℃循环30s，然后在61℃退火30s，再在72℃延伸90s，进行30个循环，最后在72℃最终延伸7min。

5.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，其特征在于：步骤1中，7个不同长度MSTN基因5′调控区片段与所述的载体质粒的连接采用DNA连接试剂盒，进行连接反应。

6.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性的方法，其特征在于：步骤1中所述的筛选重组子具体是，取连接产物直接转化感受态大肠杆菌；经过含有氨节青霉素的LB培养基中选择培养；从培养平板上随机挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用；最后经过酶切、PCR、测序鉴定。