CN107034214B

CN107034214B - 一种ctcf蛋白可结合dna片段及在ctcf活性检测中的应用

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Publication number: CN107034214B
Application number: CN201710197381.0A
Authority: CN
Inventors: 童强松; 郑丽端; 杨枫; 宋华杰; 叶霖; 李聃; 方二虎; 王晓静
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN107034214A

Abstract

本发明涉及一种CTCF蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个CTCF蛋白结合框，每个CTCF蛋白结合框的序列独立地为SEQ ID NO:1‑16中的一种；还涉及该DNA片段的应用；还涉及一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内CTCF的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析CTCF作为转录因子在一些病理学发展中所起的作用。

Description

一种CTCF蛋白可结合DNA片段及在CTCF活性检测中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种CTCF蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。

背景技术

CTCF(CCCTC binding factor)即CCCTC结合因子由CTCF基因编码，是一类在真核生物中分布极其广泛的多功能转录因子，在基因转录水平发挥至关重要的作用，参与多种生物学功能的调控。CTCF历经了近3亿年的进化而没有发生明显改变，具有高度的保守性。

研究显示，CTCF蛋白可通过其特有的11个锌指结构与多种蛋白质和DNA结合，发挥其生物学功能。如CTCF可以激活或抑制启动子调节相关基因的转录，可以构成染色质隔离子和绝缘子，调节X染色体的功能，调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡。

CTCF蛋白结合位点的改变可能造成其活性的改变，引起细胞功能紊乱，最终导致疾病的发生，甚至诱发恶性肿瘤。因此，检测CTCF的转录调控活性对于探知细胞内部的病理发生机制十分重要。然而，目前检测CTCF内源性活性仍然依靠Western Blot或qRCR等方法，虽然特异度高，但灵敏度低，而且操作复杂，检测到的只是CTCF蛋白含量的差异，并不能直接体现其活性的改变，而CTCF的活性与肿瘤的发生发展有着密切的关系，我们需要检测的不仅是CTCF的转录本或蛋白质含量，而是需要检测CTCF结合至有效位点以影响转录的活性。因此，找到一种简单可靠的检测内源性CTCF活性的方法对于CTCF的研究显得极为重要。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法。

发明内容

发明人通过研究发现，CTCF蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性，其结合的DNA核心序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G)。

基于以上研究，本发明提供了一种CTCF蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个CTCF蛋白结合框，所述CTCF蛋白结合框的序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G，如SEQ ID NO:1-16所示)。

优选地，当包含多个CTCF蛋白结合框时，每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间的间隔序列为所述间隔序列为AT。

优选地，序列如SEQ ID NO:17所示。

本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

S1：将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内CTCF转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为衡量CTCF转录调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所示荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。将CTCF转录调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。

优选地，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与HindIII位点之间得到。

优选地，所述对照质粒为phRL-TK。

优选地，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

优选地，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量CTCF转录调控活性的指标。

通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内CTCF的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析CTCF作为转录因子在一些病理学发展中所起的作用。

附图说明

图1为Kpn I与Hind III对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染有pGL3-Basic和pGL3-Basic-CTCF-Luc的人胚肾细胞系293T、人结肠癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系HeLa、人前列腺癌细胞系PC-3细胞中的相对CTCF活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图；

图3为分别转染有pcDNA3.1-Mock(即空载体)和pcDNA3.1-CTCF的人胚肾细胞系293T、人结肠癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系HeLa、人前列腺癌细胞系PC-3细胞中的相对CTCF活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建CTCF蛋白可结合的DNA片段

发明人对CTCF进行研究分析，发现CTCF蛋白结合的DNA序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G)，合成该DNA核心序列时，将这段DNA核心序列重复三次，以AT间隔，并连接至携带萤火虫荧光素酶的表达载体(pGL3.0-Basic)中，构建成功后，该荧光素酶报告基因表达载体即包含三个重复的CTCF蛋白结合的DNA核心序列，以AT碱基进行间隔，其序列如SEQ ID NO:17所示。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入Kpn I酶切位点的粘性末端(CATGG)，在3’端加入Hind III酶切位点的粘性末端(TTCGA)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如SEQ IDNO:18和19所示，这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含Kpn I酶切位点粘性末端和Hind III酶切位点粘性末端的双链DNA片段。100μl退火体系如下：Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl，余下为ddH₂O。

充分混匀后，设置PCR仪程序进行退火反应，具体程序为：95℃退火2分钟(目的是让DNA oligo充分变性)；每90秒下降1℃，降至25℃后结束反应。DNA退火产物用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定(由于DNA片段较小，电泳鉴定无法看到单一、特异的条带)，测浓度后置冰上备用。

2.将CTCF蛋白可结合的DNA片段插入荧光素酶表达载体

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述pGL3-Basic空载体进行双酶切，20μl酶切体系如下：10x QuickCut Greenbuffer 2μl，Kpn I 1μl，Hind III 1μl，pGL3-Basic空载体1μg，余下为ddH₂O。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链DNA连接至pGL3-Basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下：DNA连接酶(购自TAKARA公司，货号为6022)5μl，双链DNA片段与经双酶切的pGL3-Basic载体共5μl。为促进酶连成功率，将DNA片段与载体的摩尔比控制在10:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于PCR仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有CTCF蛋白结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体)转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化，具体方法如下：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上解冻2-3分钟，待感受态细胞由固态刚刚变为液态时，立即加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育20分钟，然后42℃热激60秒，在立即放至冰上静置2分钟，最后加入400μl不含抗生素的LB液体培养基(经过高压灭菌处理)，放置于恒温摇床中复苏1小时，恒温摇床温度设置为37℃，转速为200转/分钟。取复苏后的菌液200μl均匀涂布于直径为5厘米含氨苄青霉素(重组质粒可耐受氨苄青霉素)的LB固体选择培养基中。在37℃条件下吸收10分钟后，倒置于37℃恒温培养箱中过夜。12小时后可见少量菌落长出，挑取单菌落至5-7ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于恒温摇床中摇菌扩增，恒温摇床温度设置为37℃，转速为200转/分钟，8-12小时后提取质粒，质粒提取结束后用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker，泳道4和5显示为阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认DNA片段已整合至pGL3-Basic载体上.至此，含有CTCF蛋白结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体(以下均表示为pGL3-Basic-CTCF-Luc)构建成功。

3.pGL3-Basic-CTCF-Luc转染细胞

本发明实施例采用人胚肾细胞系293T、人结肠癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系HeLa、人前列腺癌细胞系PC-3进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞293T、LoVo、HeLa和PC-3均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为TF20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，Neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pGL3-Basic空载体、pGL3-Basic-CTCF-Luc、phRL-TK(带有海肾荧光素酶基因的载体)、pcDNA3.1(+)-CTCF(CTCF过表达质粒，以下简称为pcDNA3.1-CTCF)。

4.计算CTCF的活性

以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算CTCF活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xPBS清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为GN201-01)进行检测。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性，将pGL3-Basic-CTCF-Luc重组质粒转染至细胞中，检测CTCF报告基因系统的活性，测定结果如图2所示，处理组(转染pGL3-Basic-CTCF-Luc)荧光活性明显高于对照组(转染pGL3-Basic空载体)。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测CTCF活性，将pcDNA3.1-CTCF转染至细胞，结果如图3所示，外源导入CTCF后，阳性处理组(转染pcDNA3.1-CTCF)荧光活性明显高于对照组(转染pcDNA3.1-Mock空载体)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种CTCF蛋白可结合DNA片段及在CTCF活性检测中的应用

<130> 1

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgcgaggag gcag 14

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgcgaggtg gcag 14

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgcgaggcg gcag 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgcgagggg gcag 14

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgcgtggag gcag 14

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgcgtggtg gcag 14

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgcgtggcg gcag 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgcgtgggg gcag 14

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgcgcggag gcag 14

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgcgcggtg gcag 14

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgcgcggcg gcag 14

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccgcgcgggg gcag 14

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccgcggggag gcag 14

<210> 14

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccgcggggtg gcag 14

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccgcggggcg gcag 14

<210> 16

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccgcgggggg gcag 14

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccgcgagggg gcagatccgc gtggtggcag atccgcgggg aggcag 46

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccgcgaggg ggcagatccg cgtggtggca gatccgcggg gaggcaga 48

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agcttctgcc tccccgcgga tctgccacca cgcggatctg ccccctcgcg gggtac 56

Claims

1.一种CTCF蛋白可结合的DNA片段，其特征在于，包含多个CTCF蛋白结合框，每个所述CTCF蛋白结合框的序列独立地选自SEQ ID NO:1-16，每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间的所述间隔序列为AT，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:17所示。

2.权利要求1所述的DNA片段在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。

3.一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将包含权利要求1所述的DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内CTCF转录调控活性。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所述荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与Hind III位点之间得到。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对照质粒为phRL-TK。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到的值，作为衡量CTCF转录调控活性的指标。