CN107034214A - 一种ctcf蛋白可结合dna片段及在ctcf活性检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种CTCF蛋白可结合的DNA片段,其包含一个或多个CTCF蛋白结合框,每个CTCF蛋白结合框的序列独立地为SEQ ID NO:1‑16中的一种;还涉及该DNA片段的应用;还涉及一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法,可直接针对性地检测细胞内CTCF的转录调控活性,而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量,从而使得能够更准确地分析CTCF作为转录因子在一些病理学发展中所起的作用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,更特别地,涉及一种CTCF蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。
背景技术
CTCF(CCCTC binding factor)即CCCTC结合因子由CTCF基因编码,是一类在真核生物中分布极其广泛的多功能转录因子,在基因转录水平发挥至关重要的作用,参与多种生物学功能的调控。CTCF历经了近3亿年的进化而没有发生明显改变,具有高度的保守性。
研究显示,CTCF蛋白可通过其特有的11个锌指结构与多种蛋白质和DNA结合,发挥其生物学功能。如CTCF可以激活或抑制启动子调节相关基因的转录,可以构成染色质隔离子和绝缘子,调节X染色体的功能,调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡。
CTCF蛋白结合位点的改变可能造成其活性的改变,引起细胞功能紊乱,最终导致疾病的发生,甚至诱发恶性肿瘤。因此,检测CTCF的转录调控活性对于探知细胞内部的病理发生机制十分重要。然而,目前检测CTCF内源性活性仍然依靠Western Blot或qRCR等方法,虽然特异度高,但灵敏度低,而且操作复杂,检测到的只是CTCF蛋白含量的差异,并不能直接体现其活性的改变,而CTCF的活性与肿瘤的发生发展有着密切的关系,我们需要检测的不仅是CTCF的转录本或蛋白质含量,而是需要检测CTCF结合至有效位点以影响转录的活性。因此,找到一种简单可靠的检测内源性CTCF活性的方法对于CTCF的研究显得极为重要。
因此,需要设计一种新的用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法。
发明内容
发明人通过研究发现,CTCF蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性,其结合的DNA核心序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G)。
基于以上研究,本发明提供了一种CTCF蛋白可结合的DNA片段,其包含一个或多个CTCF蛋白结合框,所述CTCF蛋白结合框的序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G,如SEQ ID NO:1-16所示)。
优选地,当包含多个CTCF蛋白结合框时,每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间具有间隔序列,并且每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间的间隔序列为所述间隔序列为AT。
优选地,序列如SEQ ID NO:17所示。
本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。
本发明还提供了一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法,其包括以下步骤:
S1:将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞;
S2:通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内CTCF转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为衡量CTCF转录调控活性的指标。
优选地,所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统,包括重组质粒和对照质粒,并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框,所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框,所示荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。将CTCF转录调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。
优选地,所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与HindIII位点之间得到。
优选地,所述对照质粒为phRL-TK。
优选地,S1具体包括:
S11:将所述细胞培养至贴壁,并恢复形态;
S12:将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。
优选地,S2具体包括:
S21:转染后将细胞继续培养24-36小时,洗涤细胞;
S22:分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性;
S23:将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量CTCF转录调控活性的指标。
通过使用本发明的DNA片段和方法,可直接针对性地检测细胞内CTCF的转录调控活性,而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量,从而使得能够更准确地分析CTCF作为转录因子在一些病理学发展中所起的作用。
附图说明
图1为Kpn I与Hind III对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片;
图2为分别转染有pGL3-Basic和pGL3-Basic-CTCF-Luc的人胚肾细胞系293T、人结肠癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系HeLa、人前列腺癌细胞系PC-3细胞中的相对CTCF活性(即,萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图;
图3为分别转染有pcDNA3.1-Mock(即空载体)和pcDNA3.1-CTCF的人胚肾细胞系293T、人结肠癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系HeLa、人前列腺癌细胞系PC-3细胞中的相对CTCF活性(即,萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
1.构建CTCF蛋白可结合的DNA片段
发明人对CTCF进行研究分析,发现CTCF蛋白结合的DNA序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G),合成该DNA核心序列时,将这段DNA核心序列重复三次,以AT间隔,并连接至携带萤火虫荧光素酶的表达载体(pGL3.0-Basic)中,构建成功后,该荧光素酶报告基因表达载体即包含三个重复的CTCF蛋白结合的DNA核心序列,以AT碱基进行间隔,其序列如SEQ ID NO:9所示。
为保证载体构建的成功,在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端,本例在5’端加入Kpn I酶切位点的粘性末端(CATGG),在3’端加入Hind III酶切位点的粘性末端(TTCGA),序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。
通过从头合成的方法,分别合成该片段的两条寡核苷酸链,其序列分别如SEQ IDNO:10和11所示,这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含Kpn I酶切位点粘性末端和Hind III酶切位点粘性末端的双链DNA片段。100μl退火体系如下:Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl,余下为ddH2O。
充分混匀后,设置PCR仪程序进行退火反应,具体程序为:95℃退火2分钟(目的是让DNA oligo充分变性);每90秒下降1℃,降至25℃后结束反应。DNA退火产物用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定(由于DNA片段较小,电泳鉴定无法看到单一、特异的条带),测浓度后置冰上备用。
2.将CTCF蛋白可结合的DNA片段插入荧光素酶表达载体
用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司,Kpn I货号为1618,Hind III货号为1615)对上述pGL3-Basic空载体进行双酶切,20μl酶切体系如下:10x QuickCut Greenbuffer 2μl,Kpn I 1μl,Hind III 1μl,pGL3-Basic空载体1μg,余下为ddH2O。
充分混匀后,37℃酶切反应90分钟,用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况,然后切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司,货号为DP209),回收结束后测样品浓度,置冰上备用。
将退火得到的双链DNA连接至pGL3-Basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下:DNA连接酶(购自TAKARA公司,货号为6022)5μl,双链DNA片段与经双酶切的pGL3-Basic载体共5μl。为促进酶连成功率,将DNA片段与载体的摩尔比控制在10:1左右。充分混匀后,将酶连体系置于PCR仪中,16℃反应1小时,连接反应结束后得到重组质粒,置于冰上备用。
将重组质粒(含有CTCF蛋白结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体)转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化,具体方法如下:从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上解冻2-3分钟,待感受态细胞由固态刚刚变为液态时,立即加入上述连接好的重组质粒,轻轻混匀,冰上孵育20分钟,然后42℃热激60秒,在立即放至冰上静置2分钟,最后加入400μl不含抗生素的LB液体培养基(经过高压灭菌处理),放置于恒温摇床中复苏1小时,恒温摇床温度设置为37℃,转速为200转/分钟。取复苏后的菌液200μl均匀涂布于直径为5厘米含氨苄青霉素(重组质粒可耐受氨苄青霉素)的LB固体选择培养基中。在37℃条件下吸收10分钟后,倒置于37℃恒温培养箱中过夜。12小时后可见少量菌落长出,挑取单菌落至5-7ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中,放置于恒温摇床中摇菌扩增,恒温摇床温度设置为37℃,转速为200转/分钟,8-12小时后提取质粒,质粒提取结束后用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司,Kpn I货号为1618,Hind III货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定,本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker,泳道4和5显示为阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序,确认DNA片段已整合至pGL3-Basic载体上.至此,含有CTCF蛋白结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体(以下均表示为pGL3-Basic-CTCF-Luc)构建成功。
3.pGL3-Basic-CTCF-Luc转染细胞
本发明实施例采用人胚肾细胞系293T、人结肠癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系HeLa、人前列腺癌细胞系PC-3进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞293T、LoVo、HeLa和PC-3均匀种植在24孔板内,每孔约10万个细胞,用10%胎牛血清,高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后,将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80%为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司,货号为TF20121201)。50μl转染体系如下:质粒0.5μg,Neofect转染试剂0.5μl,余下为无血清培养基。
本实验中使用的质粒分别为:pGL3-Basic空载体、pGL3-Basic-CTCF-Luc、phRL-TK(带有海肾荧光素酶基因的载体)、pcDNA3.1(+)-CTCF(CTCF过表达质粒,以下简称为pcDNA3.1-CTCF)。
4.计算CTCF的活性
以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化,计算CTCF活性。具体实验方法如下:转染后的细胞继续培养24-36小时,再弃培养基上清,用1xPBS清洗细胞3次,每次5分钟,清洗细胞时注意操作轻柔,避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司,货号为GN201-01)进行检测。
本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性,将pGL3-Basic-CTCF-Luc重组质粒转染至细胞中,检测CTCF报告基因系统的活性,测定结果如图2所示,处理组(转染pGL3-Basic-CTCF-Luc)荧光活性明显高于对照组(转染pGL3-Basic空载体)。
本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测CTCF活性,将pcDNA3.1-CTCF转染至细胞,结果如图3所示,外源导入CTCF后,阳性处理组(转染pcDNA3.1-CTCF)荧光活性明显高于对照组(转染pcDNA3.1-Mock空载体)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120> 一种CTCF蛋白可结合DNA片段及在CTCF活性检测中的应用
<130> 1
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgcgaggag gcag 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgcgaggtg gcag 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgcgaggcg gcag 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgcgagggg gcag 14
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgcgtggag gcag 14
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgcgtggtg gcag 14
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgcgtggcg gcag 14
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccgcgtgggg gcag 14
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgcgcggag gcag 14
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgcgcggtg gcag 14
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccgcgcggcg gcag 14
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgcgcgggg gcag 14
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccgcggggag gcag 14
<210> 14
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccgcggggtg gcag 14
<210> 15
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccgcggggcg gcag 14
<210> 16
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccgcgggggg gcag 14
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccgcgagggg gcagatccgc gtggtggcag atccgcgggg aggcag 46
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cccgcgaggg ggcagatccg cgtggtggca gatccgcggg gaggcaga 48
<210> 19
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agcttctgcc tccccgcgga tctgccacca cgcggatctg ccccctcgcg gggtac 56
Claims (10)
1.一种CTCF蛋白可结合的DNA片段,其特征在于,包含一个或多个CTCF蛋白结合框,每个所述CTCF蛋白结合框的序列独立地选自SEQ ID NO:1-16。
2.根据权利要求1所述的DNA片段,其特征在于,当包含多个CTCF蛋白结合框时,每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间具有间隔序列,并且每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间的所述间隔序列为AT。
3.根据权利要求2所述的DNA片段,其特征在于,序列如SEQ ID NO:17所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的DNA片段在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。
5.一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将包含权利要求1-3中任一项所述的DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞;
S2:通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内CTCF转录调控活性。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统,包括重组质粒和对照质粒,并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框,所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框,所述荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与Hind III位点之间得到。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述对照质粒为phRL-TK。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法,其特征在于,S1具体包括:
S11:将所述细胞培养至贴壁,并恢复形态;
S12:将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,S2具体包括:
S21:转染后将细胞继续培养24-36小时,洗涤细胞;
S22:分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性;
S23:将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到的值,作为衡量CTCF转录调控活性的指标。
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CN106399461A (zh) * | 2016-09-14 | 2017-02-15 | 妙顺(上海)生物科技有限公司 | 一种荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法 |
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- 2017-03-29 CN CN201710197381.0A patent/CN107034214B/zh active Active
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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