CN110343705A

CN110343705A - 一种调控番茄抗坏血酸积累的nbs-lrr基因及其应用

Info

Publication number: CN110343705A
Application number: CN201910774099.3A
Authority: CN
Inventors: 张余洋; 叶志彪; 郑伟; 张俊红; 张廷艳; 王涛涛; 欧阳波
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS‑LRR基因及其应用。本专利以参与重测序的番茄材料Ts265等为研究对象，利用全基因组关联分析得到与抗坏血酸积累相关的候选基因，构建超量和干涉载体并进行遗传转化。通过对转基因株系果实和叶片抗坏血酸含量分析，目标基因的表达量分析以及已知抗坏血酸合成途径和氧化还原代谢途径酶基因的表达量分析等，来鉴定候选基因的功能。本发明首次发现NBS‑LRR基因的表达能够调控番茄中抗坏血酸的积累，为后续调控番茄或相关作物中的抗坏血酸的含量提供理论指导。

Description

一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因及其应用。

背景技术

抗坏血酸(L-ascorbic acid，AsA)又称维生素C(VC)，是一种水溶性分子量小的六碳糖衍生物，并且是一种重要的抗氧化剂，普遍存在于所有真核生物的细胞中。在植物中，抗坏血酸含量很高可到达毫克级别，可以与谷胱甘肽一起参与消除植物自身产生的活性氧(ROS)。它不仅有抗氧化的作用，在许多研究中已证明，抗坏血酸在光保护，跨膜电子传输，细胞分裂，细胞膨大，细胞信号传导，植物激素如脱落酸，赤霉素，乙烯等生物合成酶的辅因子，在抵抗生物和非生物胁迫等方面都有重要的作用(Smirnoff 2000；Arrigoni and DeTullio 2002；Mirica and Klinman 2008；Foyer and Noctor 2011)。因此，抗坏血酸在植物的生长发育过程中是必不可少的。

抗坏血酸是人类生存必不可少的营养物质(Pastori et al 2003)。在人体内，抗坏血酸不仅参与胶原蛋白的合成，在一些流行病研究中还表明抗坏血酸对人类健康也有重要影响：抗坏血酸可能是一些常见的重大疾病，如心血管疾病、癌症和其它炎症性疾病的保护因子(Fahn and Cohen 1992；Berlett and Stadtman 1997；Carcamo et al 2002)。人类等灵长类动物和一些哺乳动物由于催化抗坏血酸生物合成的最后一个关键酶基因发生突变而丧失功能，它们自身无法合成抗坏血酸(Chatterjee 1973)，所以必须长期从饮食中获取以维持正常的身体机能，而蔬菜水果是人类摄取VC的主要来源(Li and Schellhorn2007)。

NBS-LRR是一种含有核苷酸结合位点(nucleotide-binding site，NBS)和富含亮氨酸重复序列的蛋白(leucine-rich-repeat，LRR)，它是植物中同源基因最多的一类抗病蛋白家族(Dangl and Jones 2001；Hulbert 2001)。NBS-LRR家族基因有三个典型结构域：TIR/CC、NBS和LRR。研究者依据N端是否有TIR(Toll/白细胞介素-1受体类似结构)结构把NBS-LRR基因家族划分成两个亚族：TNL和non-TNL亚家族。在拟南芥中有研究证明，NBS-LRR基因的NBS结构域识别和参与植物体信号传导的功能，是通过结合水解ATP和GTP来实现的(Meyers2003；Jupe 2012)。LRR结构域中有很多亮氨酸重复序列但它的保守性不是很强，作为病原物的识别体参与植物的抗病。随着多种植物基因组测序的完成，对于植物中NBS-LRR基因家族功能的研究工作也迅速展开。刘云飞等(2014)对番茄基因组中的252个NBS-LRR类抗病蛋白进行了分类，包括CNL(CC-NBS-LRR)，TNL(TIR-NBS-LRR)，CN(CC-NBS)，TN(TIR-NBS-LRR)，NL(NBS-LRR)和N(NBS)。同时还发现这类基因多数以基因簇的形式存在，在基因组上与Solyc09g064680串联重复的还有两个基因Solyc09g064610和Solyc09g064690，这三个基因的功能可能在植物体中的功能相似(刘云飞等2014)。目前研究者在植物中克隆了许多这类抗病基因，在番茄中也克隆了一些NBS-LRR基因，如Bs4、Prf、I-2、Mi-1、Mi-9、Sw-5、Hero等基因(Liu et al 2007)。对于NBS-LRR家族因的研究目前多集中在CNL和TNL两个亚家族，但对于NL亚族在这方面的研究很少，与番茄抗坏血酸含量相关的NL亚族基因未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因及其应用。

本发明是这样实现的，一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因，基因序列见SEQ ID NO.1。

如上所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用。

进一步，番茄组织中NBS-LRR基因的表达与抗坏血酸含量呈负相关。

进一步，所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄抗坏血酸合成代谢途径相关基因的表达。

进一步，所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄叶片中氧化代谢途径的cAPX、AO、tAPX和AOBP基因的表达。

进一步，所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄果实中D-Man/L-Gal合成途径基因的表达。

进一步，所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄果实中肌醇途径MIOX基因的表达。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本专利以参与重测序的番茄材料Ts265等为研究对象，利用全基因组关联分析得到与抗坏血酸积累相关的候选基因，构建超量和干涉载体并进行遗传转化。通过对转基因株系果实和叶片抗坏血酸含量分析，目标基因的表达量分析以及已知抗坏血酸合成途径和氧化还原代谢途径酶基因的表达量分析等，来鉴定候选基因的功能。

本发明首次发现NBS-LRR基因的表达能够调控番茄中抗坏血酸的积累，为后续调控番茄或相关作物中的抗坏血酸的含量提供理论指导。

附图说明

图1是抗坏血酸关联分析曼哈顿图；

图2是候选基因在差异材料中的表达量分析；

图3是SlNBS-LRR基因结构和保守结构域分析；

图4是干涉转基因株系中SlNBS-LRR的表达分析；

图5是SlNBS-LRR转基因株系叶片中AsA合成代谢相关基因的表达分析；

图6是SlNBS-LRR转基因株系叶片中AsA合成代谢相关基因的表达分析；

图7是SlNBS-LRR干涉株系红熟期果实中AsA合成代谢相关基因的表达分析；

图8是SlNBS-LRR干涉株系红熟期果实中AsA合成代谢相关基因的表达分析；

图9是SlNBS-LRR干涉转基因株系叶片AsA含量测定；

图10是SlNBS-LRR干涉转基因株系果实AsA含量测定；

图11是SlNBS-LRR转基因株系及野生型发芽种子在1/2MS培养基及含有10μM MV的1/2MS培养基上生长两周后的表型；

图12是SlNBS-LRR转基因株系及野生型发芽种子在1/2MS培养基及含有10μM MV的1/2MS培养基上生长两周后的相对主根长；

图13是SlNBS-LRR转基因株系及野生型发芽种子在1/2MS培养基及含有10μM MV的1/2MS培养基上生长两周后的相对株高；

图14是SlNBS-LRR转基因株系及野生型发芽种子在1/2MS培养基及含有100mMNaCl的1/2MS培养基上生长两周后的表型；

图15是SlNBS-LRR转基因株系及野生型发芽种子在1/2MS培养基及含有100mMNaCl的1/2MS培养基上生长两周后的相对主根长；

图16是SlNBS-LRR转基因株系及野生型发芽种子在1/2MS培养基及含有100mMNaCl的1/2MS培养基上生长两周后的相对株高。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因及其应用，具体如下各实施例所示。本发明涉及植物材料：重测序的番茄材料Ts265、Ts128、Ts228和A57等，用来克隆基因片段，提取DNA、RNA和番茄遗传转化。

实施例1目标基因的筛选

本专利利用全基因组重测序数据和测序材料果实材料抗坏血酸含量关联分析，在6号和9号染色体得到了相关性显著的主效SNP，并在主效SNP上下50Kb的范围内候选了6个基因。抗坏血酸关联分析曼哈顿图见图1，候选基因列表见下表1。

表1.候选基因列表

用实时荧光定量PCR技术，对6个候选基因在抗坏血酸含量高低差异番茄材料中的相对表达量进行了测定，结果见图2。结果表明，Solyc09g064680的表达量和抗坏血酸含量呈线性关系。对Solyc09g064680基因结构进行分析，结果如图3，根据基因结构分析，Solyc09g064680属于番茄NBS-LRR家族中NL亚族中的一员(NBS-LRR)。NBS-LRR基因由茄科基因组网站(https://solgenomics.net/search/locus)公开获取，其中基因序列登录号为：Solyc09g064680。序列见SEQ ID NO.1。

实施例2

1.干涉载体的构建

用Gateway方法构建干涉载体，在设计好的引物前加上表达载体上的位点attB1和attB2一半的序列。用Taq酶进行两轮PCR扩增。第一轮扩增用基因特异引物和A57cDNA为模板扩增，第二轮扩增用attB1(序列为：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT)和attB2(序列为：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)全位点序列做引物，以第一轮产物为模板扩增。两轮扩增的PCR体系和程序见表2和3。用凝胶回收试剂盒回收第二轮PCR产物，然后用BP酶连接干涉表达载体pHellsgate2，BP反应体系如下：pHellsgate 2质粒0.6μL，回收的基因片段1.9μL，BP酶0.5μL，反应混合液离心混匀后在25℃条件下反应4-5h。连接产物热激转化大肠杆菌方法如下：

1)连接产物和大肠杆菌感受态Trans-T1混匀后，冰浴半小时。

2)42℃水浴50s后继续冰浴2min。

3)加400μL空白LB培养基，37℃摇床复苏1h。

4)将复苏的大肠杆菌涂布在含有壮观霉素的LB培养基上，在37℃培养16-17h。

表2.第一轮PCR扩增反应体系

表3.第二轮PCR扩增反应体系

NBS-LRR基因干涉引物如下：

Fw：AAAAAGCAGGCTCCGAATCACATCTTCCCCATAT，见SEQ ID NO.2；

Rv：AGAAAGCTGGGTACGAGTCCCACGCAGTACTAAC，见SEQ ID NO.3。

挑取10-11个单克隆，37℃摇菌10h左右后进行菌液阳性检测。选取3个检测正确的阳性克隆继续摇菌扩繁，用质粒提取试剂盒提取质粒。然后用XbaⅠ和XhoⅠ分别进行单酶切检测，10μL酶切反应体系如下：Buffer R 1μL，质粒5μL，XbaⅠ/XhoⅠ0.5μL，ddH₂O 3.5μL；混匀后37℃恒温反应2h。凝胶电泳检测选取两种酶都能切出目的片段大小条带的质粒，电击转化农杆菌感受态C58。转化方法如下：

1)电转杯清洗用ddH₂O、75％乙醇和无水乙醇各清洗3遍。

2)30μL农杆菌感受态冻融后加1μL检测正确的载体质粒混匀。

3)将混好的质粒和农杆菌加人电转杯中后电击。

4)电击后立即加入500μL空白LB培养基，吸打混匀后加到离心管中，30℃摇床复苏3h左右。

5)将复苏后的农杆菌涂布在含有壮观霉素和利福平的LB培养基上，在30℃恒温箱中培养2-3d。

6)挑取10-11个单克隆，30℃培养过夜后进行菌液阳性检测。选取检测正确的阳性克隆保存农杆菌菌液，用于后期的遗传转化。

2.番茄遗传转化

转基因植株是用农杆菌介导的遗传方法获得的，侵染所用的农杆菌菌株为本实验室保存的C58，遗传转化受体是Ts265。遗传转化的方法参考欧阳波博士论文(欧阳波2003)。整个遗传转化的过程大概需要3个月的时间，具体方法如下：

1)取籽粒饱满的种子，先将种子用水浸泡半小时，再用75％酒精清洗30s，然后用50％的84消毒液浸泡15min，最后用灭菌水清洗种子3-4次。

2)将清洗好的种子接种在1/2MS培养基上，在25℃组培间培养一周左右，番茄的两片子叶展开。

3)将番茄子叶切成2-3片，放在KCMS培养基上暗培养1d；将活化的待转化农杆菌加入到LB培养基中30℃摇床培养12h。

4)将培养好的菌液加到15mL离心管中3000r/min离心5min收集菌体，用悬浮液重悬后侵染预培养1d的子叶4min左右，并用灭菌滤纸将菌液吸干，把子叶重新放回KCMS培养基上暗培养2d。

5)将暗培养的子叶转移到筛选培养基上，在25℃组培间培养半个月左右，子叶膨大且切口处有绿色芽点长出。

6)选取长有绿色芽点的外植体，转移至继代培养基上继续培养半个月左右。根据芽点的生长情况，可将继代培养的外植体的子叶切掉，把带有芽点的愈伤组织转移至新的继代培养基上继续培养。

7)将生长良好的芽点转移至生根培养基上诱导生根。

8)将根系发达的幼苗移栽到装有基质的钵子中，待其生长健壮即可移栽。

3.转基因番茄阳性检测

用Shorty buffer提取转基因番茄植株叶片总DNA，用载体上的一个引物CaMV35S和基因特异反向引物进行转基因植株阳性检测。PCR反应体系见表4。

表4.转基因植株阳性检测体系

PCR检测所用引物：

CaMV35S-Fw:ACGCACAATCCCACTATCCTTC，见SEQ ID NO.4；

NBSLRR-Rv:ACgAgTCCCACgCAgTACTAAC，见SEQ ID NO.5。

4.实时荧光定量PCR检测分析目标基因的表达

用实时荧光定量PCR检测分析转基因植株中目的基因的表达是否达到干涉效果、分析转基因植株目的基因对抗坏血酸合成代谢途径关键基因的表达是否会产生影响。具体方法如下：

首先提取Ts265和转基因植株叶片和红熟果实的RNA；然后根据反转录的实验方法将RNA反转录成cDNA，用番茄的内参基因β-actin的引物进行PCR检测反转录是否成功，测定cDNA浓度并将其稀释到100ng/μL左右；各基因的qPCR引物使用Primier5软件设计。最后进行实时荧光定量PCR检测分析。qPCR检测引物见表6。

提取RNA方法参照Invitrogen公司TRIzol试剂盒使用说明书。RNA反转录方法如下：反转录前要去除残余的DNA。

(1)去除残余的DNA

37℃恒温反应30min后，加1μL EDTA 65℃恒温反应10min使DNase失去活性。

(2)去除DNA后，RNA反转录cDNA的反应体系和反应温度见表5。

表5 RNA反转录反应体系和反应温度

表6.本专利所用qPCR引物序列

实时荧光定量PCR体系及程序见表7。

表7.实时荧光定量PCR体系和程序

分析目的基因在转基因植株中的表达情况如图4，SlNBS-LRR基因在干涉株系中的表达受到抑制。

分析已知的番茄抗坏血酸合成代谢途径主要基因在转基因植株叶片和果实的表达情况，结果如图5-8所示。结果显示在SlNBS-LRR基因干涉株系的叶片中合成途径的大多数酶基因都呈现上调表达，氧化代谢途径的cAPX表达升高，AO、tAPX和AOBP的表达受到了显著地抑制；在红熟果实中D-Man/L-Gal合成途径基因上调表达，肌醇途径MIOX的表达量与对照相比明显降低。

3.转基因植株抗坏血酸含量的测定

抗坏血酸含量的测定通常测定两种形态抗坏血酸：总抗坏血酸和还原态抗坏血酸参考Gillespie等的报道并加以改进(Gillespie and Ainsworth 2007)。具体方法如下：

1)取样后将样品用液氮速冻，研磨后称取样品于2mL离心管中(一般幼嫩叶片称取约0.1～0.2g，果实称取0.3～0.4g)，加1mL预冷的6％TCA后震荡混匀。

2)在冰上抽提15min，16000g低温离心15min，上清液待测定使用。

总抗坏血酸测定：

1)吸取20μL上清液于酶标板中，再加20mL 50mM的DTT(用PBS溶解)，离心混匀后在37℃下反应20min。

2)加10μL 0.5％的NEM(用水溶解)，瞬离后室温放置1min。

3)加入80μL The Color Reagent，瞬离混匀后37℃下反应1h，测定其在550nm波长下的吸光值。

还原态抗坏血酸测定：

1)吸取20μL上清液于酶标板中，再加30μL pH7.4的0.4M磷酸缓冲液。

2)加入80μL The Color Reagent，瞬离混匀后37℃下反应1h，测定其在550nm波长下的吸光值绘制标准曲线，将抗坏血酸标样配置成不同浓度，按照还原态抗坏血酸的测定方法测定它们在550nm波长下的吸光值并绘制标准曲线。pH 7.4的0.4M磷酸缓冲液的配置方法：先分别配0.4M的KH₂PO₄溶液和0.4M的K₂HPO₄溶液，然后再分别量取38mL KH₂PO₄溶液和162mL K₂HPO₄溶液混匀。The Color Reagent的配制方法：2.75倍体积的SolutionA(31％H₃PO₄，4.6％TCA和0.6％FeCl₃)和1倍体积的SolutionB(4％联吡啶，联吡啶用70％乙醇溶解)混匀。

参考Gillespie等报道的测定抗坏血酸的方法，用酶标仪测定转基因植株的叶片和果实中抗坏血酸的含量，结果如图9和图10所示。结果干涉SlNBS-LRR基因株系的叶片和果实中抗坏血酸含量都显著升高。

4.番茄幼苗期百草枯氧化胁迫实验及盐胁迫实验

百草枯氧化胁迫实验：在转基因番茄材料中选取3个T1代转基因株系以及对照Ts265番茄种子，经酒精和次氯酸钠消毒后接种在1/2MS培养基上，3-4d后选取发芽一致的种子，接种在0μM和10μM MV的1/2MS培养基上，每个培养基上接6株，每个系做三个重复。然后把它们培养在25℃组培间，15d后对它们的表型进行观察，测定株高和主根长。

盐胁迫实验：方法同上，将发芽一致的种子分别接种在0mM和100mM NaCl的1/2MS培养基上，15d后对它们的表型进行观察，测定株高和相对主根长。

百草枯氧化胁迫实验结果见图11-13；盐胁迫实验结果见图14-16所示。在1/2MS培养基上用百草枯和NaCl处理SlNBS-LRR干涉株系和对照Ts265的幼苗。结果经百草枯处理后，干涉系和对照长势都受到抑制，但是转基因系的相对主根长和株高显著高于对照。而NaCl处理后对照和转基因系没有差异。这一结果表明NBS-LRR干涉株系抗百草枯的能力增强，而耐盐性没有变化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1773

<212> DNA

<213> NBS-LRR(NBS-LRR)

<400> 1

atgtcaaaga gttgggaatt gttgcagaaa aaggtgtttc aaaataaatc ttgcctgtct 60

gaactgtacg atgtgagtct agaagttgca aaaagatgca aaggattgcc ccttgtggtc 120

atcttggtag ctggaataat aaaaaagaag atggaagaat catggtggca tgaggttaaa 180

gatgctatat attcctatct tggtgagtct gaagagtata gccgggggac tgtgcactta 240

agttatgata acttacccga ttatttaaag ccttgccttc tttacatggg gatgtttcca 300

gaggaccaca acatttcagc atctaatttg ataaatttat ggattgcgga aggtttcgtg 360

caagatgttg aatctggaag attggaggaa gcagctgaag gttacttgat ggatcttatt 420

agcagtaacg tgataatggt ttcaaaggga ggaagatata atggtaaagt caaatactct 480

caggttcatg atatagtact tcacttctgc ttggagagga gtagagaaga aaagtttatg 540

ttggctgtga aggggaatta tagcaacttc agactttccg attggaagga aagtcgagtg 600

agtttcagtt tcagtgatgg actttctgag attgcatcca aaacgcggaa gcccttccat 660

caacacttga ggtcactaag aatgacacta atcaaaggtg aagtttctaa ttggagtgca 720

ttcagacagt ttagtaaatt gagacttctt aaggttttga atttgagttc ccatagagtg 780

ggtcggttgt cgtcagctgc attgcaagca ctaattcacc tgaagtactt agcagtttct 840

gcaaggaaat tcaattttca tcccgaatca catcttcccc atatagaaac attaattgtg 900

ttgtgtccat tcagccgtac agtcttacca ccgatttttt ggaaaatgaa aacattaagg 960

catgttgaga ttaatgatgt tgtttttgat ttgaaaaaca acaagaaatg gatatcagaa 1020

gaatcctcta aattggaaaa tttgaggata ttaaagcaag ttgcaattaa aattggtgct 1080

gatgataatg tcgatgtatt actacggagg tgtcctaatc ttcaagaact tgaaatcggc 1140

atcttgtgcg atgaagattc tgtagagatt tgtcaattgg aaagtcttac ccagcttcaa 1200

atacttcgcc tttccattga ctcgttccag ttaaatgtat ccaagttacg cttgccttta 1260

catataaaaa agttagtact gcgtgggact cgtatagaaa gcatagtttc ttccattggg 1320

ggactaccaa gtcttgagta tctccaatta gtgcttccaa cttttattca attaaaagag 1380

tggtgcctcg gagatgtcac gttccataaa cttaagttgt tgaaattgga gtgtttaaac 1440

atctcaagat gggatgcctc tgaggaatct tttcccctgc ttgaaaggct tgttataaaa 1500

aaaggtcatg agctcgagga gatcccactt agctttgcag atattcaaac actgaaacaa 1560

attaagttgg ttcagtgcaa gaacaaatct ctgaaggctt cagctttgaa aattaaggaa 1620

gaagccgaag ctatcggagg aagcgacata attgacctca ttgtgaaaga taaaggattt 1680

gaagatgcaa agaagattat cactgcttta aaaggtaaag gcatatctgc aactgaagca 1740

gccgggtttt gctggggtgc aaaaggtggt tga 1773

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(NBS-LRR-F)

<400> 2

aaaaagcagg ctccgaatca catcttcccc atat 34

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(NBS-LRR-R)

<400> 3

agaaagctgg gtacgagtcc cacgcagtac taac 34

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(CaMV35S-Fw)

<400> 4

acgcacaatc ccactatcct tc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(NBSLRR-Rv)

<400> 5

acgagtccca cgcagtacta ac 22

Claims

1.一种调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因，基因序列见SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用。

3.根据权利要求2所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用，其特征在于：番茄组织中NBS-LRR基因的表达与抗坏血酸含量呈负相关。

4.根据权利要求2所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用，其特征在于：所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄抗坏血酸合成代谢途径相关基因的表达。

5.根据权利要求4所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用，其特征在于：所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄叶片中氧化代谢途径的cAPX、AO、tAPX和AOBP基因的表达。

6.根据权利要求4所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用，其特征在于：所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄果实中D-Man/L-Gal合成途径基因的表达。

7.根据权利要求4所述的调控番茄抗坏血酸积累的NBS-LRR基因在调控番茄抗坏血酸含量中的应用，其特征在于：所述应用表现为NBS-LRR基因影响番茄果实中肌醇途径MIOX基因的表达。