CN111560388A - 一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因合成技术领域，公开了一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用，抗坏血酸合成的基因DNA序列为SEQ ID NO：1；本发明还提供一种利用所述促进番茄抗坏血酸合成的基因构建的表达载体，促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因在鉴定MIOX功能上的具有实际的应用意义。本发明从遗传转化方面证明肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能；通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性；通过调控抗坏血酸生成量是提高植物抗逆性的又一条可行途径，在植物抗逆育种中将会发挥重要作用。

Description

一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用
技术领域
本发明属于基因合成技术领域，尤其涉及一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用。
背景技术
目前，AsA在生物体中具有重要的抗氧化作用和代谢功能。在植物中，AsA与植物的抗逆性有关。一般，提高植物体内的AsA含量，能增强植物耐寒冷、高温、干旱和盐碱等逆境的能力。在动物中，AsA是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质。AsA能防治坏血病；可以促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血；具有抗氧化作用，能阻断致癌物亚硝胺的生成，阻止癌细胞扩散，降低外来致癌物在体内的活性，从而起到防治癌症的作用；能够改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病；具有抗衰老作用，维生素A、E及维生素C的共同作用，可促进皮下组织代谢，改善皮肤供血状况，防止皮肤过早出现皱褶；还可以增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。但是，人类和其他一些哺乳动物自身已经丧失了合成能力(Chatterjee,1973；Victoriano and Miguel,2004)，必须从食物中摄取，新鲜水果和蔬菜富含抗坏血酸。早在1933年就鉴定出AsA的分子结构，目前人们提出了AsA生物合成的三条途径：甘露糖/L-半乳糖途径(Wheeler et al.,1998)、半乳糖醛酸途径(Agius et al.,2003)、古洛糖途径(Wolucka and Montagu,2003)。
MIOX不含有亚铁原子，催化四个电子只氧化一个电子到产物D-葡萄糖醛酸。拟南芥基因组测序计划的完成使得研究者能够在植物中找到与猪肌醇氧酶基因同源的序列。经过搜索，在拟南芥第1、2、4、5染色体上找到4个与这个基因同源的开放阅读框。2007年王海光等研究了水稻肌醇加氧酶基因，实时定量PCR表明水分胁迫下OsMIOX基因上调表达，且在旱稻中的表达量显著高于水稻。认为水稻肌醇加氧酶基因在植物水分胁迫中起着分子应答的作用，并且推测ABA可能诱导OsMIOX的表达(王海光，2007)。2008年Endres超量表达MIOX，使其酶活性提高了30多倍，并且超量表达MIOX后，MI总是处于量很少的状态，饲喂MI实验也表明超量表达MIOX比对照积聚更少的MI，原因就是超量表达MIOX提高了MIOX酶活性。由于肌醇是抗坏血酸合成的底物，MIOX是否对抗坏血酸合成具有促进作用有待进一步研究。
番茄(Solanum lycopersicon.)系茄科番茄属一年生或多年生草本植物，起源于南美洲秘鲁、厄瓜多尔、玻利维亚等地，是一种高营养、高价值、风味较好的食用作物，也是世界上主栽蔬菜之一。番茄中含有丰富的柠檬酸、苹果酸，所以呈酸性环境，而AsA有较强的还原性，性质不稳定，易被空气中的氧气氧化，极易受温度、pH值、光等因素的影响，在碱性条件下易破坏，在酸性条件下较稳定。故在同样条件下，番茄中AsA的保存率比其它蔬菜要高许多(冯彦博，2002)。目前所研究的大部分番茄品种AsA含量在10-30mg/100g。
鉴于抗坏血酸在生物体中的重要功能，亟需要明确MIOX在抗坏血酸生物合成中的作用，本专利鉴定番茄MIOX基因在抗坏血酸生物合成中的功能。
综上所述，现有技术存在的问题是：番茄中抗坏血酸生物合成是由多基因控制的，MIOX是否参与抗坏血酸的合成？MIOX在其他植物物种中的作用功能并不一致，在番茄中的具体功能是什么？番茄中抗坏血酸生物合成是否存在肌醇途径？这些都是未知的问题。
现有技术还不能明确抗坏血酸肌醇合成途径，缺乏合成酶基因MIOX、并鉴定该基因在抗坏血酸生物合成中功能的方法。
解决上述技术问题的难度：番茄抗坏血酸合成代谢受多基因位点控制，属于数量性状，且不同栽培环境影响抗坏血酸合成积累，测定条件影响抗坏血酸测定准确度，因此抗坏血酸合成代谢研究存在一定的技术难度。另一方面，甘露糖半乳糖途径被认为是抗坏血酸合成的主效途径，MIOX基因是否参与抗坏血酸合成代谢调控，以及该基因参与调控的效应可能低于主效途径，一定程度上增加了本专利的技术难度。
解决上述技术问题的意义：番茄果实中AsA含量高，且由于在人类饮食中番茄是常见的蔬果，提高番茄抗坏血酸含量有重要的意义。人类由于确实抗坏血酸合成的能力，必须从新鲜水果蔬菜中摄取抗坏血酸。随着人们生活水平地提高，人们更加重视水果蔬菜中的营养价值，如维生素C等含量。番茄中调控抗坏血酸积累的机理研究处于起步阶段。因此，全面了解抗坏血酸的生物合成途径及相关的调控过程，进而更有效地提高番茄中抗坏血酸的水平，对于加深植物抗坏血酸合成基础科学问题的认识和提高人们营养健康水平都具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因及应用。
本发明是这样实现的，一种促进番茄抗坏血酸合成的基因，该基因为MIOX基因；所述促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因DNA序列为SEQ ID NO：1。
GAGAAAATGACTATTCTCATTGAGCAGCCTGAATTTGGATCACAAGTGGAGGAGAAAAAAGTCTCATTCAATGCCAATGAACTTATTTTGGATGGTGGATTTATGGTACCAAAGACATTGTCTTCTCAAGATGAAATATTTGAAGTGCCAGACATAAATGCATTTGGTCAATCATTTAGGGATTATAATGTAGAAAGTGAGAGACAAAAATCAGTGGAAGAATTTTATAGGGTTCAACACATTAATCAAACATATGACTATGTGAAAAAAATGAGAAAAGAATATGGAAAATTGAACAAAATTGAAATGAGTATTTGGGATTGTTGTGAACTTTTGAATGATGTAGTTGATGATAGTGATCCTGATTTGGATGAACCACAAATTGAGCATTTGTTACAAACTGCTGAAGCTATTAGAAAAGATTATCCAAATGAAGATTGGCTTCATTTGACCGGCCTCATTCACGACCTAGGTAAAGTACTTCTTCATCCAAGTTTTGGAGGGCTTCCTCAATGGGCTGTTGTTGGAGACACATTTCCTCTTGGTTGTGCTTTTGATGAATCAATTGTTCACCACAAGTATTTTAAGGAAAATCCAGACATCAACAACAATATTTATAATACAAAAAATGGTGTATATGAAGAAGGTTGTGGACTTGACAAAGTTGTTATGTCATGGGGACATGATGATTATATGTATTTAATTGCAAAGGAAAATAAAACTACTCTTCCTTCTGCTGCTTTATTTGTCATACGTTACCACTCTTTCTATGCATTACATAGATCAGGAGCATATACACACTTGATGAATGAGGAGGACAAAGAGAACATGAAGTGGCTCAACATTTTTAATAAATATGATTTATATAGCAAGAGTAAAGTTCGAATTGATGTGGAAAAAGTCAAGCCATACTATCTCTCTCTTATCGAAAAGTATTTTCCAACAAAGCTGAGGTGGTAATTGAATCCATGG
本发明另一目的在于提供一种利用所述促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因构建的表达载体，该载体构建基于pMV2载体构建超量表达载体(pMV2载体及构建方法参照张廷艳博士学位论文，2014，华中农业大学)。
本发明另一目的在于提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：
第一步，利用Primer 5设计全长基因引物，在PCR仪中以番茄AC的cDNA为模板扩增获得目的片段；将PCR产物链接到pEASY-B载体(北京全式金公司产品)上，连接产物热激法转化大肠杆菌，50mg/L Km抗性平板筛选阳性克隆，挑选阳性克隆，在37℃摇床上以200r/min震荡培养过夜，用基因特异性引物经PCR检测后挑选阳性克隆测序验证；
第二步，挑选克隆进行测序，选择正确的克隆摇菌抽提质粒；Xbal和KpnI双酶切重组质粒1.5h；
第三步，切胶利用胶回收试剂盒回收得到目的片段，利用T4连接酶将目的片段连接到用Xbal和Kpn I双酶切后的pMV2载体上；连接产物热激法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，用35S结合基因反向特异性引物对单克隆进行PCR阳性检测，挑取阳性克隆摇菌提质粒，双酶切验证正确后通过电击法转入农杆菌感受态C58细胞中；
第四步，挑选阳性克隆，在28℃摇床上以150r/min震荡培养过夜，利用载体上35S加基因反向特异性引物同样对菌液进行PCR阳性检测；阳性克隆加甘油后混匀保存在-70℃低温冰箱。
本发明另一目的在于提供一种所述促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因在鉴定MIOX功能上的应用，所述应用方法包括：
以番茄为材料，用农杆菌介导转化法将MIOX超量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古洛糖途径和肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能；通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性；
并进行转基因番茄植株AsA含量的测定、测定MI对SlMIOX酶活性的影响、逆境下基因表达量分析、抗氧化胁迫能力检测。
进一步，所述转基因番茄植株AsA含量的测定方法包括：
步骤一，在每一株番茄的同一部位取6-8片叶片，液氮速冻，用液氮磨成粉末，并称取质量，分成三份(叶片每份0.2g左右，果实每份1g左右)，用0.1％的偏磷酸提取；
步骤二，样品混合物10000r/min离心10min，上清液通过微孔滤膜过滤，上样100ul测定AsA含量，加入等体积DTT室温反应15min，测定总AsA的含量，每份样品测三次；
步骤三，采用SB-Aq C18柱，流动相使用pH值为4.5，0.2mol.l-1的乙酸缓冲液，流速为1.0ml.min-1，测定波长为254nm；
步骤四，利用AsA标样制作标准曲线。
进一步，所述测定MI对SlMIOX酶活性影响的方法包括：
采用化学试剂MI饲喂；
MI浓度为0.25mM，同样以蒸馏水作为对照；第一个三组培养在0.25mM MI中，第二个三组培养在蒸馏水中；饲喂24h后，用液相色谱法测量叶片的AsA含量。
进一步，所述逆境下基因表达量分析方法包括：
步骤1，选取饱满大小一致的番茄A57种子，统一催芽，然后播在72孔的穴盘中，放在温室培养，待长至三叶一心时处理；72孔穴盘每两条共12株设置一个处理；
步骤2，高温处理：40℃处理9h；低温处理：4℃处理12h；PEG处理：洗掉根上的基质，放在9％PEG溶液中处理9h；高盐处理：洗掉根上的基质，放在150mM NaCl溶液中处理9h；
步骤3，步骤1的材料经步骤2处理完后，用液氮速冻；提取番茄总RNA，进行RT-PCR分析。
进一步，所述抗氧化胁迫能力检测方法包括：
(1)电导率测定：
a.百草枯(MV)处理：选择大小一致，饱满的转基因植株T1代以及对照A57种子，统一催芽，然后播种在72孔穴盘中，每个株系播两条；放在温室中培养，一个月后处理，处理前先用PCR检测出转基因后代阳性植株，拔掉阴性植株；选择整齐，生长一致的番茄幼苗浸入百草枯溶液中，连续光照36h；设置两个百草枯浓度：0.15mM和0.30mM；
b.选取处理过的番茄幼苗同一部位叶片，称取0.5g，加蒸馏水20ml，使叶片完全浸没，重复三次；摇床上摇24h，在20-25℃恒温下用电导仪测定溶液电导率；测过电导率之后，再放入100℃沸水浴15min，以杀死植物组织，取出来自然冷却，在20-25℃恒温下用电导仪测定煮沸电导率；
(2)DAB染色：
a.取MV和水处理过的番茄离体叶片浸泡于浓度为1mg/mL的DAB溶液(pH3.8)，将材料置于常温黑暗环境24h处理；
b.将叶片取出转移至含有96％的乙醇三角瓶中，并置于沸水浴10min，以便去除叶绿素；
c.弃除乙醇溶液，向三角瓶中加入适量干净的96％的乙醇浸泡叶片，直到浮色脱去，并将脱色的叶片保存在96％的乙醇溶液中；
d.观察脱色后叶片上活性氧爆发；
(3)番茄叶片H2O2荧光染色鉴定：
植物体内H2O2的生成可通过2’,7’-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(H2DCFDA)或3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色进行鉴定；
收集MV处理一周的番茄叶片，置于50mL离心管中并加入25μM H2DCFDA浸泡，置于黑暗环境15min，然后用20mM，pH 6.0的磷酸钾缓冲液冲洗；将番茄不同株系叶片分别制作临时切片，使用蔡司可视化荧光信号ApoTome显微镜。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供了一种促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因及应用，以番茄为材料，用农杆菌介导转化法将MIOX超量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古洛糖途径和肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能，得到抗逆性提高的高含Vc番茄材料。通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，从而增加植物对氧逆境的抗性。超量表达MIOX基因能够使得番茄叶片中抗坏血酸含量从490ug/g提高至590ug/g，使得果实中抗坏血酸含量从220ug/g提高至360ug/g，说明MIOX基因在番茄抗坏血酸合成代谢中发挥重要的调控作用(见实施例图4)。因此调控抗坏血酸生成量是提高植物抗逆性的又一条可行途径，在植物抗逆育种中将会发挥重要作用。
本发明表明SlMIOX正义转基因植株能增加基因表达量；超量表达SlMIOX可以提高番茄植株的抗坏血酸含量；可提高番茄中的MIOX酶活性；可提高果实可溶性固形物含量；转SlMIOX株系具有更强的氧化逆境的耐受能力。
附图说明
图1是本发明实施例提供的促进番茄抗坏血酸合成的基因测定分析流程图。
图2是本发明实施例提供的SlMIOX在番茄不同组织中的表达分析示意图；
图中：1、根；2、茎；3、幼叶；4、成熟叶；5、幼花；6、成熟花；7、幼果；8、绿熟果；9、破色果；10、红熟果。
图3是本发明实施例提供的SlMIOX正义转基因植株的RT-PCR分析示意图；
图中：CK、A57；lines 7-24、transgenic plants。
图4是本发明实施例提供的SlMIOX超量转基因系叶片和果实中AsA含量柱状图。
图5是本发明实施例提供的SlMIOX超量转基因系饲喂肌醇之后AsA含量分析柱状图。
图6是本发明实施例提供的各逆境下SlMIOX的表达分析示意图；
图中：CK、正常条件下；HT、高温；LT、低温；PEG、PEG胁迫；NaCl、盐胁迫。
图7是本发明实施例提供的SlMIOX超量转基因系的抗氧化性示意图。
图8是本发明实施例提供的SlMIOX超量转基因系的AsA合成代谢相关基因的表达量示意图。
图9是本发明实施例提供的SlMIOX超量转基因系农艺性状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术还不能明确抗坏血酸肌醇合成途径，缺乏来合成酶基因MIOX、并鉴定该基因在抗坏血酸生物合成中功能的方法。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因及应用，下面结合附图和实施例对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供一种促进番茄抗坏血酸合成的基因，为MIOX基因，DNA序列为SEQ ID NO：1。
本发明提供一种利用所述促进番茄抗坏血酸合成的基因构建的表达载体。
本发明提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：
第一步，利用Primer 5设计全长基因引物，在PCR仪中以番茄AC的cDNA为模板扩增获得目的片段；将PCR产物链接到pEASY-B载体(北京全式金公司产品)上，连接产物热激法转化大肠杆菌，50mg/L Km抗性平板筛选阳性克隆，挑选阳性克隆，在37℃摇床上以200r/min震荡培养过夜，用基因特异性引物经PCR检测后挑选阳性克隆测序验证。
第二步，挑选克隆进行测序，选择正确的克隆摇菌抽提质粒；Xbal和KpnI双酶切重组质粒1.5h。
第三步，切胶利用胶回收试剂盒回收得到目的片段，利用T4连接酶将目的片段连接到用Xbal和Kpn I双酶切后的pMV2载体上；连接产物热激法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，用35S结合基因反向特异性引物对单克隆进行PCR阳性检测，挑取阳性克隆摇菌提质粒，双酶切验证正确后通过电击法转入农杆菌感受态C58细胞中。
第四步，挑选阳性克隆，在28℃摇床上以150r/min震荡培养过夜，利用载体上35S加基因反向特异性引物同样对菌液进行PCR阳性检测；阳性克隆加甘油后混匀保存在-70℃低温冰箱。
本发明提供一种所述促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因在鉴定MIOX功能上的应用，所述应用方法包括：
以番茄为材料，用农杆菌介导转化法将MIOX超量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古洛糖途径和肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能。通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性。
并进行转基因番茄植株AsA含量的测定、测定MI对SlMIOX酶活性的影响、逆境下基因表达量分析、抗氧化胁迫能力检测。
在本发明实施例中，所述转基因番茄植株AsA含量的测定方法包括：
步骤一，在每一株番茄的同一部位取6-8片叶片，液氮速冻，用液氮磨成粉末，并称取质量，分成三份(叶片每份0.2g左右，果实每份1g左右)，用0.1％的偏磷酸提取。
步骤二，样品混合物10000r/min离心10min，上清液通过微孔滤膜过滤，上样100ul测定AsA含量，加入等体积DTT室温反应15min，测定总AsA的含量，每份样品测三次。
步骤三，采用SB-Aq C18柱，流动相使用pH值为4.5，0.2mol.l-1的乙酸缓冲液，流速为1.0ml.min-1，测定波长为254nm。
步骤四，利用AsA标样制作标准曲线。
在本发明实施例中，所述测定MI对SlMIOX酶活性影响的方法包括：
采用化学试剂MI饲喂。
MI浓度为0.25mM，同样以蒸馏水作为对照。第一个三组培养在0.25mM MI中，第二个三组培养在蒸馏水中。饲喂24h后，用液相色谱法测量叶片的AsA含量。
在本发明实施例中，所述逆境下基因表达量分析方法包括：
步骤1，选取饱满大小一致的番茄A57种子，统一催芽，然后播在72孔的穴盘中，放在温室培养，待长至三叶一心时处理。72孔穴盘每两条共12株设置一个处理。
步骤2，高温处理：40℃处理9h。低温处理：4℃处理12h；PEG处理：洗掉根上的基质，放在9％PEG溶液中处理9h。高盐处理：洗掉根上的基质，放在150mM NaCl溶液中处理9h。
步骤3，步骤1的材料经步骤2处理完后，用液氮速冻。提取番茄总RNA，进行RT-PCR分析。
在本发明实施例中，所述抗氧化胁迫能力检测方法包括：
(1)电导率测定：
a.百草枯(MV)处理：选择大小一致，饱满的转基因植株T1代以及对照A57种子，统一催芽，然后播种在72孔穴盘中，每个株系播两条。放在温室中培养，一个月后处理，处理前先用PCR检测出转基因后代阳性植株，拔掉阴性植株。选择整齐，生长一致的番茄幼苗浸入百草枯溶液中，连续光照36h。设置两个百草枯浓度：0.15mM和0.30mM。
b.选取处理过的番茄幼苗同一部位叶片，称取0.5g，加蒸馏水20ml，使叶片完全浸没，重复三次。摇床上摇24h，在20-25℃恒温下用电导仪测定溶液电导率。测过电导率之后，再放入100℃沸水浴15min，以杀死植物组织，取出来自然冷却，在20-25℃恒温下用电导仪测定煮沸电导率。
(2)DAB染色：
a.取MV和水处理过的番茄离体叶片浸泡于浓度为1mg/mL的DAB溶液(pH3.8)，将材料置于常温黑暗环境24h处理。
b.将叶片取出转移至含有96％的乙醇三角瓶中，并置于沸水浴10min，以便去除叶绿素。
c.弃除乙醇溶液，向三角瓶中加入适量干净的96％的乙醇浸泡叶片，直到浮色脱去，并将脱色的叶片保存在96％的乙醇溶液中。
d.观察脱色后叶片上活性氧爆发。
(3)番茄叶片H2O2荧光染色鉴定：
植物体内H2O2的生成可通过2’,7’-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(H2DCFDA)或3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色进行鉴定。
收集MV处理一周的番茄叶片，置于50mL离心管中并加入25μM H2DCFDA浸泡，置于黑暗环境15min，然后用20mM，pH 6.0的磷酸钾缓冲液冲洗；将番茄不同株系叶片分别制作临时切片，使用蔡司可视化荧光信号ApoTome显微镜。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
如图1所示，本发明实施例提供的促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因，以番茄为材料，用农杆菌介导转化法将MIOX超量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古洛糖途径和肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能；通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性。
1)、植物材料：番茄实验品种A57由本实验室保存。番茄耐盐品种LA2711由番茄遗传中心(Tomato Genetic Research Center，TGRC)提供。
2)、转基因番茄植株AsA含量的测定
抗坏血酸分为还原型抗坏血酸AsA和氧化型抗坏血酸DHA。抗坏血酸含量的测定采用液相色谱法，参照Rizzolo等(1984)的方法。在每一株番茄的同一部位取6-8片叶片，液氮速冻，用液氮磨成粉末，并称取质量，分成三份(叶片每份0.2g左右，果实每份1g左右)，用0.1％的偏磷酸提取。样品混合物10000r/min离心10min，上清液通过微孔滤膜过滤，(测叶片需要用更多的偏磷酸稀释，果实可以不用稀释)，上样100ul测定AsA含量，加入等体积DTT室温反应15min，测定总AsA的含量，总AsA含量减去AsA含量即为DHA含量，每份样品测三次。采用SB-Aq C18柱，流动相使用pH值为4.5，0.2mol.l-1的乙酸缓冲液，流速为1.0ml.min-1。测定波长为254nm。利用AsA标样制作标准曲线。
3)、MI对SlMIOX酶活性的影响
采用化学试剂MI饲喂，参照方法同上。MI浓度为0.25mM，同样以蒸馏水作为对照。第一个三组培养在0.25mM MI中，第二个三组培养在蒸馏水中。饲喂24h后，用液相色谱法测量叶片的AsA含量。
4)、逆境下基因表达量分析
选取饱满大小一致的番茄A57种子，统一催芽，然后播在72孔的穴盘中，放在温室培养，待长至三叶一心时处理。72孔穴盘每两条共12株设置一个处理。处理方法参照孙卫红博士论文(2008)的方法，有所改动。高温处理：40℃处理9h；低温处理：4℃处理12h；PEG处理：洗掉根上的基质，放在9％PEG溶液中处理9h；高盐处理：洗掉根上的基质，放在150mMNaCl溶液中处理9h。以上材料处理完后，用液氮速冻。提取番茄总RNA，进行RT-PCR分析。
5)、抗氧化胁迫能力检测
5.1)电导率测定：
a.百草枯(MV)处理：选择大小一致，饱满的转基因植株T1代以及对照A57种子，统一催芽，然后播种在72孔穴盘中，每个株系播两条。放在温室中培养，一个月后处理，处理前先用PCR检测出转基因后代阳性植株，拔掉阴性植株。百草枯处理参照Cummins等(1999)的方法，选择整齐，生长一致的番茄幼苗浸入百草枯溶液中，连续光照36h。本发明设置了两个百草枯浓度：0.15mM和0.30mM。
b.参照李和生(2000)介绍的电导率测定方法，选取处理过的番茄幼苗同一部位叶片，称取0.5g，加蒸馏水20ml，使叶片完全浸没，重复三次。摇床上摇24h，在20-25℃恒温下用电导仪测定溶液电导率。测过电导率之后，再放入100℃沸水浴15min，以杀死植物组织，取出来自然冷却，在20-25℃恒温下用电导仪测定煮沸电导率。
5.2)DAB染色：
a.取MV和水处理过的番茄离体叶片浸泡于浓度为1mg/mL的DAB溶液(pH3.8)，将材料置于常温黑暗环境24h处理。
b.将叶片取出转移至含有96％的乙醇三角瓶中，并置于沸水浴10min，以便去除叶绿素。
c.弃除乙醇溶液，向三角瓶中加入适量干净的96％的乙醇浸泡叶片，直到浮色脱去(可将脱色的叶片保存在96％的乙醇溶液中)。
d.观察脱色后叶片上活性氧爆发。
5.3)番茄叶片H2O2荧光染色鉴定：植物体内H2O2的生成可通过2’,7’-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(H2DCFDA)或3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色进行鉴定。收集MV处理一周的番茄叶片，置于50mL离心管中并加入25μM H2DCFDA浸泡，置于黑暗环境15min，然后用20mM，pH6.0的磷酸钾缓冲液冲洗。将番茄不同株系叶片分别制作临时切片，使用蔡司可视化荧光信号ApoTome显微镜(激发，488nm；发射，525nm)。
实施例2：
抗坏血酸(AsA)即维生素C，一种水溶性的维生素，是普遍存在于植物组织的一种高丰度小分子物质，在生物体中具有极为重要的代谢和抗氧化功能。它与植物的抗逆性有关，也是保证人类健康所必需的营养物质，但是人类和大多数动物由于缺乏抗坏血酸生物合成途径的最后一步酶，丧失了合成能力，必须从新鲜蔬菜和水果中摄取。植物抗坏血酸生物合成途径的发现意味着我们可以通过基因工程调控植物抗坏血酸的合成，从而增加植物产品的营养价值，增强其本身对逆境的抗性。
1)、SlMIOX在番茄各组织中都有表达，但表达水平有差异，在根、幼叶、成熟叶、緑熟果、破色果、红熟果中表达量都不高，其中以根、緑熟果、破色果、红熟果最低，在茎、幼花、幼果中表达量最高，在成熟花中表达量其次。SlMIOX在番茄不同组织中的表达分析如图2所示。
2)、利用农杆菌介导的遗传转化方法将pBMIOX载体导入番茄实验品种A57中，得到PCR检测阳性植株。(番茄A57品种由华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验保存，种子可合法获取。农杆菌介导的番茄转化方法参照欧阳波博士学位论文《几种病程相关蛋白基因转化番茄的研究》，华中农业大学2002年博士学位论文)。
3)、提取SlMIOX正义转基因植株的RNA，进行RT-PCR，结果显示所有SlMIOX正义转基因植株基因表达量都比对照显著提高，说明SlMIOX正义转基因植株能增加基因表达量。SlMIOX正义转基因植株的RT-PCR分析如图3所示。
4)、对SlMIOX基因的正义转基因植株T0代的抗坏血酸含量测定结果表明超量表达SlMIOX可以提高番茄植株的抗坏血酸含量，其中叶片和果实的抗坏血酸含量最高的转基因株系分别比对照增加了38％和61％。SlMIOX超量转基因系叶片和果实中AsA含量如图4所示。
5)、对非转基因番茄材料A57进行逆境处理，RT-PCR结果表明SlMIOX在高温下表达量增加，在PEG水分胁迫下没有表达，在高盐下表达量降低，低温下与对照没有明显区别。SlMIOX表达受高温诱导。各逆境下SlMIOX的表达分析如图6所示。
6)、对SlMIOX正义转基因材料饲喂肌醇，发现SlMIOX正义转基因材料合成抗坏血酸能力比对照显著提高。这说明超量表达SlMIOX确实提高了番茄中的MIOX酶活性。SlMIOX超量转基因系饲喂肌醇之后AsA含量分析如图5所示。
7)、超量表达SlMIOX株系和对照植株经过百草枯抗氧化处理后，转基因株系叶片受损程度较对照轻，叶片电导率较低。通过DAB和H2DCFDA染色表明，超量表达SlMIOX株系叶片中积累的活性氧物质较对照低，表明转SlMIOX株系具有更强的氧化逆境的耐受能力。SlMIOX超量转基因系的抗氧化性如图7所示。
8)、在超量表达SlMIOX株系中，不仅SlMIOX基因自身表达量升高，在抗坏血酸合成途径其他基因也不同程度的上升，部分基因上升幅度非常显著，如SlGPP1基因上升达100倍，表明抗坏血酸积累可能来自于SlMIOX基因自身的表达，也可能来自于SlMIOX与其他途径基因的协同调控。SlMIOX超量转基因系的AsA合成代谢相关基因的表达量如图8所示。
9)、超量表达SlMIOX基因株系中，果实可溶性固形物含量有一定的提高，如在MIOX7超表达株系果实可溶性固形物含量从对照的5上升至6.1，上升幅度达22％。然而超量表达SlMIOX对果实的大小及纵横经有一定的抑制作用。SlMIOX超量转基因系农艺性状如图9所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用
<130> 2020S1761IWH
<141> 2020-06-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctcattca atgccaatga acttattttg gatggtggat ttatggtacc aaagacattg 60
tcttctcaag atgaaatatt tgaagtgcca gacataaatg catttggtca atcatttagg 120
gattataatg tagaaagtga gagacaaaaa tcagtggaag aattttatag ggttcaacac 180
attaatcaaa catatgacta tgtgaaaaaa atgagaaaag aatatggaaa attgaacaaa 240
attgaaatga gtatttggga ttgttgtgaa cttttgaatg atgtagttga tgatagtgat 300
cctgatttgg atgaaccaca aattgagcat ttgttacaaa ctgctgaagc tattagaaaa 360
gattatccaa atgaagattg gcttcatttg accggcctca ttcacgacct aggtaaagta 420
cttcttcatc caagttttgg agggcttcct caatgggctg ttgttggaga cacatttcct 480
cttggttgtg cttttgatga atcaattgtt caccacaagt attttaagga aaatccagac 540
atcaacaaca atatttataa tacaaaaaat ggtgtatatg aagaaggttg tggacttgac 600
aaagttgtta tgtcatgggg acatgatgat tatatgtatt taattgcaaa ggaaaataaa 660
actactcttc cttctgctgc tttatttgtc atacgttacc actctttcta tgcattacat 720
agatcaggag catatacaca cttgatgaat gaggaggaca aagagaacat gaagtggctc 780
aacattttta ataaatatga tttatatagc aagagtaaag ttcgaattga tgtggaaaaa 840
gtcaagccat actatctctc tcttatcgaa aagtattttc caacaaagct gaggtggtaa 900
ttgaatccat gg 912

Claims (10)

1.一种促进番茄抗坏血酸合成的基因，其特征在于，所述促进番茄抗坏血酸合成的基因DNA序列为SEQ ID NO：1。
2.一种利用权利要求1所述促进番茄抗坏血酸合成的基因构建的表达载体。
3.一种如权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括：
第一步，利用Primer 5设计全长基因引物，在PCR仪中以番茄AC的cDNA为模板扩增获得目的片段；将PCR产物链接到pEASY-B载体(北京全式金公司产品)上，连接产物热激法转化大肠杆菌，50mg/L Km抗性平板筛选阳性克隆，挑选阳性克隆，在37℃摇床上以200r/min震荡培养过夜，用基因特异性引物经PCR检测后挑选阳性克隆测序验证；
第二步，挑选克隆进行测序，选择正确的克隆摇菌抽提质粒；Xbal和KpnI双酶切重组质粒1.5h；
第三步，切胶利用胶回收试剂盒回收得到目的片段，利用T4连接酶将目的片段连接到用Xbal和Kpn I双酶切后的pMV2载体上；连接产物热激法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，用35S结合基因反向特异性引物对单克隆进行PCR阳性检测，挑取阳性克隆摇菌提质粒，双酶切验证正确后通过电击法转入农杆菌感受态C58细胞中；
第四步，挑选阳性克隆，在28℃摇床上以150r/min震荡培养过夜，利用载体上35S加基因反向特异性引物同样对菌液进行PCR阳性检测；阳性克隆加甘油后混匀保存在-70℃低温冰箱。
4.一种如权利要求1所述促进番茄抗坏血酸合成的基因在鉴定MIOX功能上的应用，其特征在于，所述应用方法包括：
以番茄为材料，用农杆菌介导转化法将MIOX超量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古洛糖途径和肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能；通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性；
并进行转基因番茄植株AsA含量的测定、测定MI对SlMIOX酶活性的影响、逆境下基因表达量分析、抗氧化胁迫能力检测。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转基因番茄植株AsA含量的测定方法包括：
步骤一，在每一株番茄的同一部位取6-8片叶片，液氮速冻，用液氮磨成粉末，并称取质量，分成三份(叶片每份0.2g左右，果实每份1g左右)，用0.1％的偏磷酸提取；
步骤二，样品混合物10000r/min离心10min，上清液通过微孔滤膜过滤，上样100ul测定AsA含量，加入等体积DTT室温反应15min，测定总AsA的含量，每份样品测三次；
步骤三，采用SB-Aq C18柱，流动相使用pH值为4.5，0.2mol.l-1的乙酸缓冲液，流速为1.0ml.min-1，测定波长为254nm；
步骤四，利用AsA标样制作标准曲线。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述测定MI对SlMIOX酶活性影响的方法包括：
采用化学试剂MI饲喂；
MI浓度为0.25mM，同样以蒸馏水作为对照；第一个三组培养在0.25mM MI中，第二个三组培养在蒸馏水中；饲喂24h后，用液相色谱法测量叶片的AsA含量。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述逆境下基因表达量分析方法包括：
步骤1，选取饱满大小一致的番茄A57种子，统一催芽，然后播在72孔的穴盘中，放在温室培养，待长至三叶一心时处理；72孔穴盘每两条共12株设置一个处理；
步骤2，高温处理：40℃处理9h；低温处理：4℃处理12h；PEG处理：洗掉根上的基质，放在9％PEG溶液中处理9h；高盐处理：洗掉根上的基质，放在150mM NaCl溶液中处理9h；
步骤3，步骤1的材料经步骤2处理完后，用液氮速冻；提取番茄总RNA，进行RT-PCR分析。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗氧化胁迫能力检测方法包括电导率测定，具体为：
a.百草枯处理：选择大小一致，饱满的转基因植株T1代以及对照A57种子，统一催芽，然后播种在72孔穴盘中，每个株系播两条；放在温室中培养，一个月后处理，处理前先用PCR检测出转基因后代阳性植株，拔掉阴性植株；选择整齐，生长一致的番茄幼苗浸入百草枯溶液中，连续光照36h；设置两个百草枯浓度：0.15mM和0.30mM；
b.选取处理过的番茄幼苗同一部位叶片，称取0.5g，加蒸馏水20ml，使叶片完全浸没，重复三次；摇床上摇24h，在20-25℃恒温下用电导仪测定溶液电导率；测过电导率之后，再放入100℃沸水浴15min，以杀死植物组织，取出来自然冷却，在20-25℃恒温下用电导仪测定煮沸电导率。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗氧化胁迫能力检测方法进一步包括DAB染色，具体包括：
a.取MV和水处理过的番茄离体叶片浸泡于浓度为1mg/mL的DAB溶液，将材料置于常温黑暗环境24h处理；
b.将叶片取出转移至含有96％的乙醇三角瓶中，并置于沸水浴10min，以便去除叶绿素；
c.弃除乙醇溶液，向三角瓶中加入适量干净的96％的乙醇浸泡叶片，直到浮色脱去，并将脱色的叶片保存在96％的乙醇溶液中；
d.观察脱色后叶片上活性氧爆发。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗氧化胁迫能力检测方法进一步包括番茄叶片H2O2荧光染色鉴定，具体包括：
植物体内H2O2的生成可通过2’,7’-二氯二氢荧光素乙酰乙酸或3,3’-二氨基联苯胺染色进行鉴定；
收集MV处理一周的番茄叶片，置于50mL离心管中并加入25μM H2DCFDA浸泡，置于黑暗环境15min，然后用20mM，pH 6.0的磷酸钾缓冲液冲洗；将番茄不同株系叶片分别制作临时切片。
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SHOAIB等: "Genome-wide analysis of Myo-inositol oxygenase gene family in tomato reveals their involvement in ascorbic acid accumulation" *
孙卫红: "番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及功能分析" *

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