CN112442506A - 一种拟南芥根肿病感病候选基因at2g35930及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述候选基因AT2G35930的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该基因的T‑DNA插入突变体材料比哥伦比亚型野生拟南芥更加抗根肿病，通过农杆菌侵染将带有增强型启动子的AT2G35930转化至拟南芥中，得到AT2G35930过表达拟南芥株系，结果发现AT2G35930的过表达会导致拟南芥对根肿病更易感，该表型具体产生是由于基因参与支持病原在植物根部的生长发育。本发明与根肿病关系密切，可将该基因及其在其他十字花科植物中的同源基因应用于十字花科植物育种，具有良好的应用前景。

Description

一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体的说，涉及一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930及其应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是十字花科模式植物，在植物基础科学中有重要研究意义。芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)归属于原生生物界，芸薹根肿菌门，芸薹根肿菌纲，芸薹根肿菌目，芸薹根肿菌属，由其引起的十字花科植物根肿病(clubroot)专一发生于十字花科植物根部，引起植物激素在不同发病阶段的异常变化，最终引起植物根部异常膨大，异常膨大的根无法吸收水分及营养物质，严重时发病株整株枯死。十字花科根肿病在世界上广泛分布，对十字花科作物的生产造成严重威胁。

在芸薹属作物种子市场，杂种具有很大优势，这也导致在育种工作倾向于选择显性抗性基因，但偏好选择的单显性基因遗传的抗性易被病原寄主共进化的过程克服而无法持久。感病基因是植物中广泛存在的能够参与促进植物感病或者支持病原与植物相容的基因。大致可根据参与感病的阶段分为三大类。第一大类在早期穿透之前支持感病，有角质层和细胞壁组成相关的一些基因；还有一些调节膜动态被病原利用帮助其吸器建成的植物基因，第二类是编码免疫信号途径的负调控因子的基因。抑制PTI和DTI过程及茉莉酸水杨酸的拮抗途径。抑制钙离子和脂类物质介导的免疫以及ETI。第三类是支持长效相容的基因，在植物中，有关糖转运，有关代谢物生物合成，参与内部复制，细胞扩张，可以提高代谢产出潜力的基因，支持病毒复制的，均属此类。这些感病基因大部分在植物中担任着一定功能，但被病原利用以支持感病性。相对抗病基因，感病基因的丧失往往意味着植物与病原之间微妙的平衡被打破，产生的是类似于非寄主性的抗性表型。共进化无法修复这样的扰乱。故而感病基因的缺失可以提供一个更加广谱，持久的不易被病原克服的抗性。

启动子功能原件预测显示AtPUB23的启动子中含有多个激素响应原件，拟南芥数据库中GO注释显示该基因参与植物防御响应，蛋白自体泛素化，蛋白泛素化，几丁质响应和干旱胁迫响应，研究表明AtPUB23可以作为PTI的负调控因子而归类于第二类感病基因。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的提供了一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930，所述候选基因AT2G35930的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供了一种所述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930在调控植物抗病功能中的应用。

进一步地，本发明还提供了一种所述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930在制备转基因植物中的应用。

进一步地，本发明还提供了一种含有所述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930的生物材料。

进一步地，所述生物材料为表达载体、表达盒、宿主细胞或工程菌。

进一步地，所述生物材料在调控植物抗病功能中的应用。

进一步地，所述生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明具有的有益效果是：本发明提供的拟南芥AT2G35930序列如SEQ ID No.1所示。通过病原注射接种，发现AT2G35930的T-DNA插入突变体材料比野生哥伦比亚型拟南芥更加抗病，通过农杆菌侵染将带有增强型启动子的AT2G35930转化至哥伦比亚型拟南芥中，得到AT2G35930过表达拟南芥株系，抗病性分析实验表明，拟南芥AT2G35930的过量表达可以促进根肿菌侵染拟南芥根部引起的根部肿大。结果显示，拟南芥AT2G35930与十字花科根肿病关系密切，将该基因及其在其他十字花科植物中的同源基因应用于十字花科植物育种，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为AT2G35930在哥伦比亚型野生拟南芥被根肿菌侵染后24h(24hai)和48h(48hai)与未侵染的对照组的表达分析图；

图2为拟南芥AT2G35930的CDS克隆PCR电泳图：其中M为DNA marker，1-4泳道为目的片段扩增产物；

图3为AT2G35930过表达载体示意图：其中，A图为CDS序列的插入位置图；B图为启动子的插入位置图；

图4为T-DNA插入突变体材料的纯合株筛选PCR结果图：左边为筛选标准图；右为本实施例4的电泳胶图。其中，M为DNA marker，1、2、8、9泳道为纯合株，3、4、5、6、10、11、12泳道与野生型wt泳道一致，7为杂合体泳道。

图5为病原接种后突变体植株和对照植株生长状况比较图：其中，A为野生型拟南芥接种1mL营养液的阴性对照，B为野生型拟南芥接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液的阳性对照，C为salk_063470突变体植株接种1mL营养液的阴性对照，D为salk_063470突变体植株接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液，植株均在接种后21d拍摄；

图6为病原接种后21天(21d)salk_063470突变体植株和对照植株的根部病状比较图：wt-mock为野生型拟南芥接种1mL营养液的阴性对照，wt-ck为野生型拟南芥接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液的阳性对照，salk_063470-mock为salk_063470突变体植株接种1mL营养液的阴性对照，salk_063470为salk_063470突变体植株接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液，图像均在接种后21d拍摄；

图7为病原接种后该基因过表达植株和突变体材料与对照植株病情指数调查分析的柱状图；

图8为AT2G35930启动子与GUS融合表达载体转化拟南芥阳性植株各组织化学染色示意图，A为幼苗，B为叶片，C为角果，D为根组织，E为花序；

图9为突变体材料salk_063470及野生型拟南芥病原接种后21d膨大根部切片图：A、B、E、F为野生型拟南芥，C、D、G、H为salk_063470，A、C标尺为200μm，B、D标尺为100μm，E、F、G、H标尺为50μm。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，实施例中未作详细描述的技术手段属于本领域专业技术人员熟知的常规技术。实施例只用于说明本发明，但不限制本发明的范围，任何本领域的技术人员在不付出创造性劳动的情况下，以本发明的实施例为基础所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930，该基因从哥伦比亚型野生拟南芥中克隆得到的基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了上述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930在调控十字花科植物根肿病中的应用，下面对其进行具体描述。

实施例1实时荧光定量PCR

1、种植足量的哥伦比亚型野生拟南芥，生长3周左右，接种病原作为处理组。(具体步骤见下述实施例5)。

2、实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR分析病原侵染拟南芥后的24h与48h，AT2G35930表达量的变化：取处理(接种病原后24h和48h)及对照组野生型拟南芥各自至少10株进行混合取材，洗根做好标记后，迅速置入液氮中固定，全部取材完成后，提取总RNA并反转录合成cDNA后，进行qRT-PCR分析。qRT-PCR分析所用引物通过Primer Premier 6设计，如表1所示。反应体系为15μL：7.5μL的SYBR Green Master Mix，正反向引物各0.3μL，模板1μL，5.9μL双蒸水。qRT-PCR反应流程：95℃：30s,40个循环(95℃：5s，55℃：45s)。通过熔融曲线确定反应的特异性，内参基因为Atactin4，基因的相对表达量通过2^-ΔCt方法计算。(取样时设三次生物学重复)

结果显示AT2G35930基因在拟南芥被根肿菌侵染后24h和48h差异表达，如图1，在48h与对照组相比，上调表达。

表1拟南芥植株qRT-PCR分析所用引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		35930-F	TCCTCCGTTCTTCCTTTGT(SEQ ID No.2)
35930-R	TAGCCATTTCTCGATGCTG(SEQ ID No.3)
		AtActin7-F	GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG(SEQ ID No.4)
AtActin7-R	CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA(SEQ ID No.5)

实施例2 AT2G35930过表达载体的构建

1、pBI121载体双酶切

BamHⅠ和XbalⅠ双酶切，电泳分离大片段条带，割胶回收；

2、Trizol法提RNA

野生型拟南芥根组织取样，Trizol法提RNA：计算样品数，准备相应的研钵研棒和小铁勺，锡箔纸包好180℃烘4-5h；1.5mL离心管(RNAFree)，RNAFree的枪和枪头，液氮，离心管板，121℃，高压蒸汽灭菌40min。取相应数量离心管，做好编号；通风橱中每管加1mLTrizol，放冰上；从液氮中取样品至预冷的研钵中，加液氮研磨3-5次至粉末状，移入Trizol，充分震荡涡旋；于通风橱加入200mL三氯甲烷，剧烈震荡15s，冰上5min；4℃，12000rpm，离心10min，600μL上清液移入新的1.5mL离心管中，加入1倍体积异丙醇颠倒混匀，-20℃静置30min；4℃，12000rpm，离心10min，去上清；加入1mL预冷的DEPC水溶解的75％乙醇，4℃，12000rpm，离心10min，倒掉上清；空离20sec，吸出液体，通风厨中晾干。加入50μLDEPC水溶解RNA沉淀，测定浓度备用。

3、cDNA的制备

Takara反转录试剂盒去基因组DNA：体系包含2.0μL 5xgDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser，1.0μg/μL Tatal RNA，6.0μL RNAFree ddH2O，42℃金属浴2min；反转录：反应体系包含10μL上述得到的去基因组DNA产物，4.0μL 5xPrimerscript Buffer，1.0μLPrimerscript RT Enzyrne Mix，1.0μL RT Primer Mix，4.0μL RNase Free ddH₂O，37℃，20min，85℃反应5sec，-20℃保存备用。

4、设计特异引物(引物序列信息见表2)高保真KOD酶扩增AT2G35930的CDS序列，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，长度符合，且只有单一片段的PCR产物进行产物纯化(图2)。

5、同源重组连接

上述线性化载体和PCR扩增纯化的片段同源重组连接：用诺唯赞的单片段同源重组试剂盒C112进行，体系为：4μL 5xCEⅡBuffer，2μL ExaseⅡ，200ng双酶切回收的线性化载体，20ng AT2G35930的CDS片段，ddH₂O补齐至20μL；37℃反应30min。

转化大肠杆菌，培养所得菌液PCR验证，并提取目的质粒测序验证(引物见表3)，验证比对成功的质粒电转法转化农杆菌感受态，转化成功的菌液菌液PCR有条带扩大体积培养；提取质粒测序验证(其载体图谱见图3，图3的A图为CDS序列的插入位置图；图3的B图为启动子的插入位置图)，验证成功的菌液保存菌种并留母液4℃储藏备用。

表2异源表达载体构建所用引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		35930Oe-F	GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCCGGAGGAATAATGGA(SEQ ID No.6)
35930Oe-R	GGACTGACCACCCGGGGATCCGCAGGGATATGCAAGAATCA(SEQ ID No.7)

实施例3拟南芥浸花法转化及阳性转化株的筛选

1、浸花法转化拟南芥

经过测序验证的上述菌液以及pBI121空载体质粒的农杆菌GV3101菌液作为母液，浸花法转化拟南芥，步骤如下：含有目的载体的农杆菌菌液500μL，加入200mL含卡那霉素和利福平的液体LB中(50mg/L)，28℃，200rpm摇菌30h左右至OD600为1.2；8000rpm离心10min得到农杆菌沉淀，200mL 5％(质量分数)蔗糖重悬菌液；加入Silwet-77至终浓度200μL/L，28℃200rpm震荡2min；野生型拟南芥去掉开放花及角果，花蕾浸入菌液30sec，吸干多余菌液，25℃保湿暗培养24h，以后正常培养，一周后重复浸花一次。

2、配制卡那霉素播种培养基

2.22g的MS粉，10g的蔗糖2M的NaOH调pH至5.8，加入4g的琼脂粉121℃高压蒸汽灭菌20min，超净工作台中，冷却到50-60℃，加入卡那霉素至终浓度为75mg/L，倒固体平板培养基。

3、阳性转化株的筛选

在拟南芥筛选培养基上播种浸花得到的拟南芥种子T1代，步骤如下：10％(质量分数)次氯酸钠消毒2min；75％(体积分数)乙醇清洗种子2min；无菌水冲洗5次，每次1min；播种于卡那霉素播种培养基上，封口，置于22℃培养间培养(16h光照，8h黑暗)，约两周后，移出长势健壮，叶色深绿的阳性植株，PCR检测验证(引物如表3)。

表3转基因拟南芥PCR检测所用引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		pBI121-Oe-F	CCACGTCTTCAAAGCAAGTG(SEQ ID No.8)
pBI121-Oe-R	TTGTAACGCGCTTTCCCAC(SEQ ID No.9)

实施例4 T-DNA插入突变体材料的筛选

1、DNA快速提取法提取DNA：装有组织的离心管中加入200μL的DNA提取缓冲液及磁珠，破碎仪破碎组织(65Hz，120s)；研磨后组织液全部转入1.5mL离心管，13000rpm离心8min；准备新的1.5mL离心管，每管加入100μL异丙醇，取100μL上清转入含等体积异丙醇的离心管中，温和的晃动约50次，室温静置5min；13000rpm离心6min，去上清；1mL70％(体积分数)乙醇洗涤沉淀两次(上下摇动20次，13000rpm离心3min，弃上清，重复一次；空离1min)，吸出液体，沉淀晾干5min，加入25-50μL的ddH₂O，-20℃备用。

2、三引物法PCR检测(引物见表4)：1.1xT3 Super Mix PCR反应体系如下：44μL的1.1xT3super Mix，2μL的Template，2μL的Primer F，2μL的Primer R；程序设定为98℃预变性2min 30sec，进入35圈循环扩增(98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸10sec)，最后72℃充分延伸2min保证片段完整的扩增；LP+RP引物扩增的PCR产物与RP+BP引物扩增的PCR产物混合均匀，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离。只含有单一小片段的纯合个体收种用于后续实验(图4)，其中，M为DNA marker，1、2、8、9泳道为纯合株，3、4、5、6、10、11、12泳道与野生型wt泳道一致，7为杂合体泳道。

表4 T-DNA插入突变体材料筛选所用引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		T-DNA-BP	ATTTTGCCGATTTCGGAAC(SEQ ID No.10)
Salk_063470-LP	CAGCATCTCTCATATATGTGATTGC(SEQ ID No.11)
		Salk_063470-RP	CCGACAGTGGTCCCAAAGAT(SEQ ID No.12)

实施例5病原接种及病情指数调查

1、试剂配制

2％(质量分数)氯胺T：2g氯胺T溶于100mL ddH₂O，注意应现配现用。

盐酸万古霉素母液(50mg/mL)：超净工作台中，0.25g盐酸万古霉素溶于5mLddH₂O，过滤灭菌，分装于1.5mL离心管-20℃保存备用。

硫酸粘杆菌素母液(20mg/mL)：超净工作台中，0.2g盐酸万古霉素溶于10mLddH₂O，过滤灭菌，分装于1.5mL离心管-20℃保存备用。

头孢噻亏钠母液(250mg/mL)：超净工作台中，2.5g盐酸万古霉素溶于10mL ddH₂O，过滤灭菌，分装于1.5mL离心管-20℃保存备用。

抗生素工作液：100mL ddH₂O水中加入2μL盐酸万古霉素母液(50mg/mL)，5μl硫酸粘杆菌素母液(20mg/mL)，2.4μL头孢噻亏钠母液(250mg/mL)。

10％(质量分数)NaClO：10mL NaClO用90mL ddH₂O稀释。

50％(质量分数)蔗糖溶液：50g蔗糖溶于100mL ddH₂O。

霍格兰营养液：在超净工作台中，从网上购买配制好的A、B、C液，分别用1L无菌水溶解作为母液备用，使用的工作液为A、B、C的母液各10mL，溶于1L无菌水中备用。

2、病根的采集

病根采集时期很重要，需保证采集时发病达到休眠孢子大量产生的发病后期，合适时期的病根对孢子悬浮液的浓度和纯度影响极大，采集回来的病根洗净表面泥土，吸水纸擦干。室温腐熟2-3d后可提取休眠孢子。其余可以冻存于-20℃备用。(本实施例中所用病原材料均采集自江苏宜兴，生理小种类型为ECD28/31/31生理小种，即P4生理小种)

3、孢子悬浮液的制备(据杨佩文等的密度梯度离心法改良)(杨佩文等，2002)：

(1)收集来的病根洗净充分腐熟后，装满50mL离心管。

(2)用70％(体积分数)酒精处理1min，10％(质量分数)NaClO处理20min，无菌水冲洗3次。

(3)用榨汁机将根瘤榨成匀浆状，罐头瓶口固定八层纱布，进行第一次过滤。

(4)漏斗铺八层纱布，对滤液二次过滤。

(5)滤液收集于50mL的离心管中，配平至45mL后离心15min，去上清。

(6)加无菌水至40mL，4000rpm离心10min，去上清；重复一次。

(7)沉淀溶于5mL 50％(质量分数)的蔗糖溶液，3100rpm离心10min，上清及最外层趋于溶解的米白色沉淀移入新的50mL离心管。

(8)加无菌水至45mL；4000rpm离心10min，弃上清。

(9)沉淀溶于30mL无菌水，3100rpm离心10min；重复2～3次，至上清澄澈。

(10)得到的沉淀溶于10-15mL无菌水中(根据孢子沉淀的量酌情加水)，保存于4℃；或者直接进行表面消毒备用。

(11)孢子的表面消毒：

A.加入30mL 2％(质量分数)氯胺T晃匀，室温处理20min；

B.3100rpm离心7min，去上清，加入30mL无菌水，混匀；

C.3100rpm离心7min，去上清，加入30mL抗生素工作液，混匀；

D.25℃黑暗温育24h，3100rpm离心7min，去上清，加30mL无菌水混匀；

E.3100rpm离心7min，去上清；

F.加入10-15mL无菌水，2-10d内使用。

(12)血球计数板(型号1/400mm²)计数(每中格左上两条线上压线孢子计入总数)，测算孢子悬浮液浓度：

浓度(个/mL)＝(左上+左下+中+右上+右下)共计80小格内休眠孢子个数/80*400*104*稀释倍数

4、病原接种及水肥管理

野生型拟南芥及纯合突变体后代播种于育苗块上，过表达阳性植株后代及pBI121空载转化株后代播种于卡那霉素播种培养基上，对应做好标记，两周后根据随机区组设计原则移入灭菌基质，每品种共计36棵植株(三次重复，每重复12棵植株)，每次独立实验设独立的阳性对照(同等浓度与体积侵染野生型拟南芥Col-0)和阴性对照(同等体积无菌营养液接种野生型拟南芥和突变体拟南芥)，缓苗5-6d；此期间制备孢子悬浮液，消毒后的孢子悬浮液室温避光放置2-6d内使用；根据血球计数板计数的浓度用霍格兰营养液稀释孢子悬浮液至浓度为10⁷-5*10⁷个/mL；接种前浇足量水，用一次性的1mL注射器紧靠下胚轴位置向根部注射，每株1mL孢子悬浮液，一边注射一边搅拌孢子悬浮液保证休眠孢子分布均匀；接种后放回培养箱正常培养48h内不浇水，以后恢复正常管理，定期浇水一般无需补充营养液，21d后观察拍照记录根部发病情况。

5、GA/LA病情指数调查与分析

每棵植株拍照记录的照片用ImageJ处理计算最大叶长及肿根面积，根据公式计算每棵植株的GA/LA病情指数(Gravot et al.,2012；Gravot et al.,2016)，导入excel表格，计算平均值及标准误，t检验分析差异性，以柱形图将数据可视化，如图7所示,图7左边为过表达植株及pBI121空载转化植株病情在接种浓度分别为5*10⁶和10⁷浓度的两次独立实验中的病情指数，图7右边为AT2G35930突变体材料salk_063470与对照植株在接种浓度为10⁷～5*10⁷浓度间两次独立实验中的病情指数(每次实验设3次重复，每重复12株植株，*代表t-检验有显著性差异，**代表t-检验有极显著性差异，误差线为标准误)。

计算公式：GA/LA Disease Index＝肿根面积/(最大叶长)2*5000(Gravot etal.,2012；Gravot et al.,2016)

图5为病原接种后突变体植株和对照植株生长状况比较：图5的A为野生型拟南芥接种1mL营养液的阴性对照，图5的B为野生型拟南芥接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液的阳性对照，图5的C为salk_063470突变体植株接种1mL营养液的阴性对照，图5的D为salk_063470突变体植株接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液，植株均在接种后21d拍摄。图6为病原接种后21天(21d)salk_063470突变体植株和对照植株的根部病状比较图：wt-mock为野生型拟南芥接种1mL营养液的阴性对照，wt-ck为野生型拟南芥接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液的阳性对照，salk_063470-mock为salk_063470突变体植株接种1mL营养液的阴性对照，salk_063470为salk_063470突变体植株接种1mL根肿菌休眠孢子悬浮液，图像均在接种后21d拍摄。结果显示：AT2G35930的突变体材料salk_063470无明显副效表型(黄化，早衰，植株矮小等)(如图5所示)。且部分植株明显比野生型拟南芥更抗根肿病(如图6所示)，AT2G35930的突变体材料salk_063470在两次病原接种的独立实验中总体平均病情指数显著低于野生型，在野生型拟南芥中过表达该基因后，过表达植株表现出比pBI121空载更加感病，且感病性在较低浓度孢子悬浮液接种时病情指数与pBI121空载相比有极显著差异(图7)。

实施例6拟南芥AT2G35930时空表达模式分析

(1)1301载体用KpnⅠ和NcoⅠ双酶切，电泳分离大片段条带，割胶回收。

(2)野生型拟南芥快速提取DNA，在AT2G35930基因上游1500bp左右位置设计特异引物，高保真KOD酶扩增相应基因的启动子序列，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，长度符合，且只有单一片段的PCR产物进行产物纯化。

(3)上述线性化载体和PCR扩增纯化的片段同源重组连接。转化大肠杆菌菌液PCR验证，并提取目的质粒测序验证，验证比对成功的质粒电转法转化农杆菌感受态，转化成功的菌液菌液PCR有条带扩大体积培养；提取质粒测序验证，验证成功的菌液保存菌种并留母液4℃储藏备用，培养农杆菌进行烟草瞬时转化，验证启动子活性后，继续培养农杆菌浸花转化拟南芥；除草剂筛选阳性植株：拟南芥播种于基质中，培养箱中进行正常植株培养，待冒出两片小小的真叶时喷洒0.01％的除草剂Basta，连续喷洒三天，继续培养三天后阳性株叶色仍深绿，生长正常，移至新的基质中，继续培养。

(4)GUS染液基础液：分析天平称取0.78g NaH₂PO₄·2H₂O，0.71g Na₂HPO4，16.5g K₃[Fe(CN)₆]，21.9g K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O，溶于50mL无菌水中，加入100μL Triton-100及2mL0.5M PH＝8.0的EDTA，无菌水补齐至88mL。

GUS染液工作液：7.04mL基础液，800μL甲醛，X-gluc母液(100mg X-gluc溶于2mL二甲基甲酰胺)160μL。

(5)组织化学染色：取阳性转化拟南芥植株的根、茎、叶、花、角果、幼株进行组织化学染色，浸泡于GUS染液工作液中37℃染色48h，酒精漂洗脱色2-3d，期间不断更换酒精至叶片本身的绿色脱净。体式显微镜(LEICA MZ16 FA)拍照。

图8的A为幼苗、图8的B为叶片、图8的C为角果、图8的D为根组织、图8的E为花序的化学染色示意图，结果显示，组织化学染色观察到AT2G35930启动子在幼嫩植株，成熟植株中在叶基部，下胚轴，花萼片，角果基部，角果柄均有表达，但是在下胚轴GUS信号更加强烈(如图8所示)。拟南芥受到芸薹根肿菌侵染，严重者下胚轴及主根膨大，下胚轴膨大潜力更甚。而突变体材料下胚轴膨大程度比野生型小，表明启动子分析结果显示的表达特性与上述实施例4所得病株发病部位一致。

表4启动子扩增及融合载体检测引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		35930Pro-F	ACGAATTCGAGCTCGGTACCCCAACCAGAGAGAGCAGTAT(SEQ ID No.13)
35930Pro-R	TTACCCTCAGATCTACCATGGCGGAGGAATCTCGATCTCTTC(SEQ ID No.14)
		1301-sub-F	GAGCGCAACGCAATTAATGT(SEQ ID No.15)
1301-sub-R	TTGTAACGCGCTTTCCCAC(SEQ ID No.16)

实施例7突变体肿根内病原观察

冷冻切片样品固定和包埋：4％(质量分数)多聚甲醛溶液固定；材料移入30％(质量分数)蔗糖溶液，处理过夜；移入30％蔗糖/OCT＝1:1的混合液处理1h；更换新的纯OCT处理12h以上，锡箔纸叠好小立方体，倒入OCT，处理好的材料取出放入立方体内按方向摆好，-80℃超低温冰箱保存备用。

Thermo-Fisher冷冻切片机保持在-20℃切片，厚度10μm。封片与观察：载玻片贴合在切片上即可吸附，吸附了多张切片的玻片做好标记，用10％的甘油封片，在荧光显微镜白场光下观察，并摄取图片。

图9为突变体材料salk_063470及野生型拟南芥病原接种后21d膨大根部切片图，其中图9A、B、E、F为野生型拟南芥，图9的C、D、G、H为salk_063470，结果表明：与wt相比，AT2G35930的突变体材料salk_063470肿跟内病原极少达到休眠孢子时期。如图9所示，wt肿跟截面直径更大，且切面中皮层几乎2/3充满芸薹根肿菌病原体，半数以上细胞中充满了休眠孢子。而突变体只有1/4左右皮层细胞有病原定植且病原生物量少，只有极少数达到休眠孢子时期，寄主皮层细胞壁与野生型相比也有明显增厚。

以上所述为本发明较佳的具体实施方式，但在其基础上可以进行一些改进或修改，这对任何熟悉本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在本发明基础上所作的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 浙江大学

无锡迪茉得生物种业科技有限公司

<120> 一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccggag gaataatgga tgaagagatc gagattcctc cgttcttcct ttgtcctatc 60

tctttggaga tcatgaaaga tccagtgata gtctctaccg gaataaccta cgacagagac 120

agcatcgaga aatggctatt tgcaggcaag aaaaactcgt gtccggtcac caaacaagac 180

ataaccgacg cggatctcac cccgaatcac actctacgcc gtctcatcca atcttggtgc 240

accctaaacg cctcctacgg cgtcgagagg atccctaccc caagacctcc gatttgtaaa 300

tctgagatcg aaaagctcat tagagattca gcctcttccc atgaaaacca agtcaagtgt 360

ctcaaacgac ttcgtcagat tgtgtcggag aacgcgacca acaagcggtg tttagaggca 420

gcgggagtac cggagttctt ggccaacatc gtaagcaacg actcagaaaa tgggagtttg 480

accgacgaag ccctcaactt actttaccac ctcgagacct cagagacagt cctcaagaat 540

cttttaaaca acaagaaaga taacaatatc gtaaagtcgt tgacgaagat catgcagcgt 600

gggatgtacg agtccagagt ctatgccact ttgcttctca agaacattct cgaagtagcg 660

gatccaatgc agagtatgac tctcaagcca gaggttttca ctgaggtcgt ccagatcttg 720

gacgaccgga tctcgcagaa ggcgaccaaa gctgccatgc atatattggt gaacatatgc 780

ccatggggaa ggaacagaca caaggccgtg gaagctggag taatctctgt gatcatcgag 840

cttctcatgg acgagagctt cacatcagag aggagaggtc cagagatggc gatggtggtt 900

cttgatctgt tgtgtcagtg tgcggaggga cgagccgagt tcttgaacca cggagcagcc 960

atagcggtgg tgtgcaagaa gatacttagg gtttcacaga cagcaagcga tagagcggtt 1020

agggttttgt tgtcggtggg aaggttctgc gcaacgcctg ctttgttgca cgagatgtta 1080

cagttggggg ttgtagcgaa gctttgtctt gtgcttcaag taagctgtgg aggtaagacc 1140

aaagagaagg caaaggagtt gcttaagttg cacgctaggg tctggaagga ctcgccttgt 1200

ctcccaaaaa acatgattct tgcatatccc tgc 1233

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgttc ttcctttgt 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagccatttc tcgatgctg 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaactggaa tggtgaaggc tg 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgattggata cttcagagtg agga 24

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagaacacgg gggactctag aatgtccgga ggaataatgg at 42

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactgacca cccggggatc cgcagggata tgcaagaatc a 41

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccacgtcttc aaagcaagtg 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgtaacgcg ctttcccac 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attttgccga tttcggaac 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcaccccgaa tcacactcta c 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagcatctct catatatgtg attgc 25

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgaattcga gctcggtacc ccaaccagag agagcagtat 40

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttaccctcag atctaccatg gcggaggaat ctcgatctct tc 42

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagcgcaacg caattaatgt 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttgtaacgcg ctttcccac 19

Claims (7)

1.一种拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930，其特征在于，所述候选基因AT2G35930的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930在调控植物抗病功能中的应用。

3.一种权利要求1所述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930在制备转基因植物中的应用。

4.一种含有权利要求1所述拟南芥根肿病感病候选基因AT2G35930的生物材料。

5.根据权利要求4所述生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达载体、表达盒、宿主细胞或工程菌。

6.根据权利要求4所述生物材料在调控植物抗病功能中的应用。

7.根据权利要求4所述生物材料在制备转基因植物中的应用。

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