CN112852834A

CN112852834A - 水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用

Info

Publication number: CN112852834A
Application number: CN202110367125.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋明; 张慧娟
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN112852834B

Abstract

本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用。本发明的目的在于为改良水稻抗病性和抗旱性提供一种新选择。本发明的技术方案是水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用。本发明通过实验验证了水稻OsPUB23基因的功能。该基因可负调控水稻对干旱和稻瘟病的抗性。本发明进一步研究表明，该基因通过调节活性氧积累和抗性相关基因的表达水平来调控水稻对稻瘟菌的抗性；该基因通过调节脯氨酸含量、可溶性糖含量和干旱相关基因的表达水平来调控水稻对干旱的抗性。

Description

水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用

技术领域

本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物，也是研究单子叶植物功能基因组学的模式植物。在自然生长条件下水稻经常会受到非生物逆境(干旱、低温)和生物逆境(稻瘟菌、白叶枯菌)的危害。

稻瘟病是世界性分布、危害最重的病害之一，尤其在东南亚、日本、韩国、印度和中国发生特别严重。流行年份，一块发病田块损失在10％-30％，如果不进行及时防治的话，甚至会造成局部田块颗粒无收。在中国，但凡有水稻栽培的地方，都会发生稻瘟病。在提倡绿色环保的当下，推进绿色防控技术专业化、保障水稻生产绿色高质量发展，选育抗稻瘟病的水稻品种就显得尤为重要了。

中国由于地形复杂，如四川等地区，造成了灌溉困难。广东、广西、海南地区由于处在单一气团的控制下，很容易造成春旱，而长江中下游、福建、江西等地，由于受到太平洋副热带气团的控制，易造成伏旱现象，而西北地区，由于地处大陆腹地受夏季风影响甚微，伏旱、秋旱多较为严重。旱灾容易造成水稻生长受到抑制，尤其是水稻孕穗期，如果遭遇干旱，很容易造成空粒，造成严重的减产。因而，选育一些耐干旱的品种就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于为改良水稻抗病性和抗旱性提供一种新选择。

本发明的技术方案是水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用。

具体的，所述水稻OsPUB23基因的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示。

其中，所述调控为负调控。

进一步，所述抗性为抗病性。

优选的，所述抗病性为对稻瘟菌的抗性。

具体的，所述调控为调控水稻活性氧积累和/或抗病性相关基因的表达。

优选的，所述抗病相关基因为OsLOX1、OsNH1、OsPR1a、OsPR3和OsWRKY45。

其中，所述抗性为抗旱性。

具体的，所述调控为调控水稻脯氨酸含量或/和可溶性糖含量。

具体的，所述调控为调控水稻干旱相关基因的表达。

优选的，所述水稻干旱相关基因为OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1。

本发明的下有益效果：本发明通过实验验证了水稻OsPUB23基因的功能。采用病毒诱导的基因沉默的方法，获得的植株对稻瘟病和干旱胁迫的耐性显著增强。该基因可负调控水稻对干旱和稻瘟病的抗性。本发明进一步研究表明，该基因通过调节活性氧积累和抗性相关基因的表达水平来调控水稻对稻瘟菌的抗性；该基因通过调节脯氨酸含量、可溶性糖含量和干旱相关基因的表达水平来调控水稻对干旱的抗性。

附图说明

图1、稻瘟菌侵染和激素处理下，OsPUB23基因的表达量；H8S+H₂O表示水稻品种H8S上不接菌，H8S+M.grisea表示水稻品种H8S上接种稻瘟菌85-14B1，H8R+H₂O表示水稻品种H8R上不接菌，H8R+M.grisea表示水稻品种H8R上接种稻瘟菌85-14B1。

图2、与对照植株相比，BMV:OsPUB23植株提高对稻瘟病的抗性。(A)BMV:OsPUB23植株中，OsPUB23的沉默效率；BMV:00就是指对照植株，也就是该基因没有沉默的植株；BMV:OsPUB23指的是该基因沉默的植株；(B)稻瘟菌侵染后，BMV:OsPUB23植株和对照植株的表型；(C)稻瘟菌侵染后，BMV:OsPUB23植株和对照植株叶片上病斑的长(length)宽(width)；(D)稻瘟菌侵染后，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内稻瘟菌的数量。

图3、与对照植株相比，稻瘟菌侵染后，BMV:OsPUB23植株体内积累较少的活性氧；(A)稻瘟菌侵染前后，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内积累活性氧的情况；(B)稻瘟菌侵染前后，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内过氧化氢的量，横坐标hpi表示接种后的时间；(C)稻瘟菌侵染前后，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内超氧化物歧化酶的活性；(D)稻瘟菌侵染前后，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内过氧化氢酶的活性。

图4、稻瘟菌侵染前后，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内抗病相关基因的表达情况。

图5、干旱处理后，OsPUB23基因的表达量；CK为对照，Drought为干旱。

图6、BMV:OsPUB23植株提高对干旱的耐性；(A)干旱逆境及恢复后，BMV:OsPUB23植株和对照植株的表型；(B)干旱逆境条件下，BMV:OsPUB23植株和对照植株的失水率；(C)干旱逆境条件下，BMV:OsPUB23植株和对照植株的存活率。

图7、BMV:OsPUB23植株通过调控脯氨酸含量和可溶性含量来提高对干旱的耐性；(A)正常(Normal)和干旱(Drought)逆境下，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内脯氨酸的含量；(B)正常和干旱逆境下，BMV:OsPUB23植株和对照植株可溶性糖的含量。

图8、正常(Nor)和干旱(Dro)条件下，BMV:OsPUB23植株和对照植株体内干旱相关基因的表达情况。

具体实施方式

下述实施例中用到的主要实验材料与方法：

1、植物材料与菌种

所采用的水稻品种为原丰早、H8S、H8R和IR64，用于不同的实验中。“原丰早”用于激素和干旱逆境处理的表达分析；“H8S和H8R”是一对近等基因系，用于稻瘟病菌处理的表达分析；IR64用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)。

菌种：稻瘟菌株85-14B1为浙江省农科院柴荣耀提供。

2、主要实验试剂

SA，JA和ACC药品购置于Sigama公司，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)相关的试剂购买于Takara公司。其他常规的试剂购买于北京鼎国生物技术有限责任公司。

3、植物种植方法：

水稻(Oryza sativa)品种原丰早、H8R和H8S经过催芽后种植在塑料营养钵(直径8cm，高10cm，每盆播种10株)，置于培养箱中培养。幼苗的生长条件是：28℃，16h光照/8h黑暗。

水稻品种IR64将水稻种子播种于塑料营养钵中，每钵播种5株，生长温度控制在22～24℃，光周期为14h/10h。待植株生长10-14天时，用于VIGS侵染实验。

4、实施例中用到的引物见表1。

表1实施例中用到的引物

实施例1基因的表达模式分析

激素处理：分别用1.5mM pH 6.5的水杨酸(Salicylic acid，SA)，0.1mM的ACC(1-氨基环丙烷羧酸盐酸盐，ACC)，0.1mM的茉莉酸(Jasmonic acid，JA)。SA和JA溶于0.1％的乙醇，对照喷雾用对应量0.1％的乙醇；ACC溶于水，对照喷雾用水对应。20天左右的“原丰早”水稻幼苗用于激素处理。喷雾至幼苗叶片布满细小雾滴为止。处理后0、6、12、24、48和72h取样，5株水稻幼苗的叶片混为一个样品，液氮冷冻后于-80℃保存备用。

干旱胁迫：采用三周龄左右的“原丰早”水稻放于空气中自然干燥，干旱处理后0、0.5、1和2h取样，液氮速冻后于-80℃保存备用。

稻瘟病菌处理：用分生孢子悬浮液(10⁵孢子mL^-1，含0.05％Tween-20)喷雾接种水稻植株，对照喷含0.05％Tween-20的无菌水。接种后的水稻幼苗在黑暗条件下，在25～28℃保湿24h。然后转移到植物生长箱，培养期间温度保持在25～28℃，饱和湿度，光源为荧光灯，光照时间为16h。接种后7d调查发病情况。

总RNA的提取采用Trizol的方法，具体操作如下：取叶片在液氮中充分研(研磨要迅速，最好不要超过1分钟)；然后将研磨号的粉末装入离心管中；每使用1mL Trizol加0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4℃，10000rpm离心10～15分钟；把水相转移到新管中并加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20～30分钟；4℃，10000rpm离心10分钟，去上清；加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀(每使用1mL Trizol至少用1mL 75％乙醇对沉淀进行洗涤)；4℃，5000rpm离心3分钟，倒出液体；室温放置晾干，根据实验需要，加入30～100μL无RNase水，溶解RNA。提取的总RNA样品，按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBR GreenI作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)仪器中进行。以水稻Actin基因作为内参基因，检测OsPUB23基因的表达量。扩增Actin基因的引物为表1中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，扩增OsPUB23基因的引物为表1中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。扩增体系：Fast Essential DNA Green Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

OsPUB23基因的表达受到了稻瘟菌、激素和干旱逆境的诱导。

活体接种稻瘟菌后，OsPUB23基因的表达在水稻H8R与稻瘟菌85-14B1非亲和系统中受到了强烈的诱导(图1A)。激素处理后，OsPUB23基因的表达量受到了ACC，JA和SA的强烈诱导(图1B)。干旱逆境下，OsPUB23基因的表达受到了强烈的诱导。在检测时间内，保持持续上升的趋势(图5)。

实施例2VIGS载体的构建

水稻OsPUB23基因的系统座位标识码为Os02g33590)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，其编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.32所示。基因沉默表达载体BMV载体由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供。

采用表1中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以水稻基因组DNA为模板，扩增OsPUB23基因，并将其连接到T/A克隆载体pMD19上。经测序验证正确后，以pMD19-OsPUB23质粒为模板，用特异性引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增。PCR产物经l％琼脂糖胶电泳后，采用DNA Gel Purification Kit(Sangon,Shanghai,China)回收目标条带，用NcoI和AvrⅡ(购于NEB公司)双酶切回收的目标片段和沉默载体BMV，在37℃温浴4h，酶切的体系分别为：4μL Buffer，1.5μL NcoI，1.5μL AvrⅡ，10μL BMV载体质粒或者目标片段，添加水补充至40μL。酶切后回收载体质粒或者目标片段，16度T4(Takara)连接酶过夜连接，连接体系为：1μL连接缓冲液，1μL T4连接酶，2μL酶切后回收的载体质粒，6μL酶切后回收的目标片段。42℃热击转化大肠杆菌JM109(含50mg/L的卡那霉素的LB平板筛选)，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定进行初筛，最终提取质粒进行测序验证，并命名为BMV:OsPUB23。经电击法将所述沉默表达载体BMV:OsPUB23转入农杆菌。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性菌斑，在液体培养基中培养，获得农杆菌菌液，-80℃保存备用。

实施例3VIGS沉默植株的获得

取实施例2得到的于—80℃保存的菌株在含有50mg/L Kan的YEP固体养基上28℃划线培养2～3d；挑取单克隆于含抗生素的50mL YEP培养基中，250rpm，28℃培养，使菌液浓度达到OD₅₉₅为1.0，将分别含有BMV:OsPUB23和病毒粒子p1300m/RNA1+2(该病毒粒子可帮助携带基因的病毒载体在植物体内的移动，由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供)农杆菌液等体积混合。对照组使用分别含BMV和p1300m/RNA1+2的农杆菌混合液。混合后农杆菌菌液4000rpm离心10min，去上清，并用等体积的诱导缓冲液重悬，28℃培养3h后，添加100μM乙酰丁香酮(AS)，0.4g/L L-半胱氨酸，0.15g/L二巯基苏糖醇(DTT)，0.75mg/L硝酸银。诱导缓冲液配方：10mM 2-吗啉乙磺酸(MES)，10mM MgCl₂，200μM乙酰丁香酮(AS)。

将生长两周的幼苗倒置于农杆菌浸入缓冲液中，进行抽真空处理。真空压力为-4000Pa，侵染时间为7min。侵染完后，将缓冲液叶面喷施于幼苗，将幼苗置于24/22℃(白天/黑夜)，14h光照/10h黑暗的培养箱内培养。

参照实施例1中的方法提取总RNA样品。按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBRGreen I作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)仪器中进行。用qRT-PCR检测基因的沉默效率。以水稻Actin基因作为内参基因，检测OsPUB23基因的表达量。扩增Actin基因的引物为表1中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，扩增OsPUB23基因的引物为表1中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。扩增体系：Fast Essential DNAGreen Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

结果见图2A，从图中可以看出OsPUB23基因在BMV:OsPUB23沉默植株中的沉默效率约为60％。

实施例4OsPUB23基因在调控水稻干旱抗性中的作用

将30天苗龄的沉默植株和对照植株同时转移到同一个容器，容器的一侧种上沉默植株，另一侧则种上对照植株，每侧至少有10个植株，设3次重复。恢复生长10天后停止浇水，15天后复水，复水后12天统计植株的存活率，失水率，脯氨酸含量和可溶性糖含量等指标。

失水率测定：将三个月大的水稻植株充分吸水过夜，每个株系取三株水稻，每株取5张叶片，失水前称量每张叶片的质量，然后在室温条件下放置1h、2h、3h、4h、5h后分别称重记录，最后将所有叶片在80℃烘箱中过夜烘干；失水率为失水质量占鲜重的百分比。如图6所示，OsPUB23沉默的植株，与对照植株相比，对干旱的抗性增加。与对照植株相比，BMV:OsPUB23沉默植株的失水率降低，存活率上升，这些都表明OsPUB23负向调控对干旱的耐性。

可溶性糖的测定：水稻叶片可溶性糖选用蒽酮法进行测定。取水稻叶片0.5g，经液氮研磨充分，放于加有10mL无菌水的试管中，沸水浴煮沸20min，静置冷却后离心10min(4000rpm)，取1mL上清液加入含有5mL蒽酮试剂的洁净试管中，沸水浴煮沸10min，静置冷却，取上清在620nm波长处测定吸光值，并根据标准曲线算得可溶性糖数值(X)。水稻中可溶性糖含量(％)＝X×提取液体积(mL)×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×10⁶]×100。

脯氨酸含量的测定：称取水稻叶片组织0.5g，用液氮研磨至粉末状，然后将其转移到含5ml 3％的磺基水杨酸溶液向试管中，在沸水浴中煮沸10min(提取过程中注意要经常摇动试管)，冷却后离心10min(4000rpm)，取滤液于干净试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2mL提取液于另一干净试管中，向其中加入2mL冰醋酸和2mL 2.5％酸性茚三酮溶液，放入沸水中煮沸30min，溶液逐渐呈现红色。冷却后向其中加入4mL甲苯，摇荡30秒钟，静置10min，取上层溶液与洁净试管中，离心5min(4000rpm)。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520nm波长处测定吸光度值。根据吸光度值从标准曲线中查的脯氨酸数值(X)，根据公式X×提取液总体积(mL)/样品鲜重(g)×测定时所用提取液体积(mL)算得水稻叶片中脯氨酸含量(μg·g^－1Fw)。

如图7所示，OsPUB23沉默调控了脯氨酸和可溶性糖的含量：干旱逆境下，检测BMV:OsPUB23沉默植株和对照植株体内的脯氨酸含量和可溶性糖含量。结果显示，干旱条件下，BMV:OsPUB23沉默植株体内的脯氨酸含量(图7A)和可溶性糖含量(图7B)比对照植株显著增加。这表明了OsPUB23沉默会增加植株体内脯氨酸含量和可溶性糖含量。

参照实施例1中的方法提取总RNA样品。按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBRGreen I作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)仪器中进行。

以水稻Actin基因作为内参基因，对已报道的跟植物干旱耐受有关基因OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1的表达量进行检测。扩增Actin的引物为表1中SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4，扩增OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1的引物为表1中SEQID No.21～30。扩增体系：Fast Essential DNA Green Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

如图8所示，干旱逆境条件下，BMV:OsPUB23沉默植株，与对照植株相比，诱导了干旱相关基因的表达情况。这些都表明了OsPUB23沉默增加对干旱逆境的耐性，是通过对干旱相关基因表达的调控来实现的。

实施例5OsPUB23基因在调控水稻稻瘟病抗性中的作用

水稻接种稻瘟病菌处理，采用离体接种和活体接种。

活体接种：用分生孢子悬浮液(10⁵孢子mL^-1，含0.05％Tween-20)喷雾接种实施例2得到的基因沉默植株，对照喷含0.05％Tween-20的无菌水。接种后的水稻幼苗在黑暗条件下，在25～28℃保湿24h。然后转移到植物生长箱，培养期间温度保持在25～28℃，饱和湿度，光源为荧光灯，光照时间为16h。接种后7d调查发病情况。

离体接种：在五叶期，剪取5～6cm长的水稻顶端完全伸展的叶片，置于平皿内保湿的滤纸上。按上述方法获得孢子悬液，在叶片表面间隔点滴15μL的孢子液。在25～28℃，接种后的叶片在黑暗条件下保湿培养24h。然后保湿培养，光照时间为24h。接种后7d测量病斑大小。

BMV:OsPUB23沉默植株，与对照植株相比，对稻瘟菌的抗性增加：沉默植株和对照植株在接种稻瘟菌后，观察病害发生的现象。OsPUB23确实沉默的植株，与对照植株相比，对稻瘟菌的抗性增加。与对照植株相比，BMV:OsPUB23沉默植株的病斑较小，且体内的真菌量较少(图2)，这些都表明Os06g34390负向调控对稻瘟病的耐性。

DAB检测活性氧的产生：采用DAB染色法检测H₂O₂含量，将叶片置于染色液中(0.01％Triton-X-100、1mg/mL DAB pH3.8)，室温静置2小时，用95％乙醇沸水浴至叶片叶绿素退去为止(期间可以多次更换酒精)，最后用50％乙醇漂洗保存，拍照。

SOD活性测定：取0.3g水稻叶片样品，洗净后置于预冷的研钵中用液氮充分研磨，然后加入到含1.6mL 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)的离心管中，4℃ 12000g离心20min，上清液即为酶液。取Met溶液(14.5mM/L)162mL，EDTA-Na2溶液(30μM/L)0.6mL，磷酸缓冲液5.4mL，NBT溶液(2.25mM/L)6mL，核黄素溶液6mL，混合后摇匀即为反应液。取3mL反应液和30μL酶液于试管中,将试管放于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；同时取两支对照试管，其中1支试管取3ml反应液加入30μL磷酸缓冲液，光照后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液并置于暗中用于调零。以不照光的对照管调零后，避光OD560下的吸光度。实验中以抑制NBT光化还原50％所需的酶量为1个酶活单位(U)。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)。Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量；W为样品鲜重。

CAT活性测定：酶液提取过程和上文一样。取3mL反应液加入0.1mL酶液，以磷酸缓冲液为对照调零，测定OD240吸光度值(测定40s)。以每min每OD值减少0.01为1个酶活性单位(U)。CAT＝[ΔA240×Vt]/(W×Vs×0.01×t)(u/gmin)。ΔA240为反应时间内吸光度数值的变化；W为样品的鲜重；t为反应的时间；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时所用酶液体积。

稻瘟菌接种后，检测BMV:OsPUB23沉默植株和对照植株体内的活性氧含量。结果显示，接种稻瘟菌后，BMV:OsPUB23沉默植株体内的活性氧含量(图3A)与对照植株相比，显著降低。测定过氧化氢(H₂O₂)含量的结果显示，接种稻瘟菌后，BMV:OsPUB23沉默植株体内的H₂O₂含量与对照植株相比，显著降低。这可能是通过SOD活性(图3C)的降低和CAT活性(图3D)的增加来实现的。这表明了OsPUB23沉默会降低植株体内活性氧含量。

参照实施例1中的方法提取的总RNA样品，按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBR Green I作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)仪器中进行。

水稻叶片中稻瘟菌量测定采用qRT-PCR测定稻瘟病DNA，提取水稻叶片DNA，利用稻瘟菌的28S rDNA为指示基因，水稻的基因组DNA的eEF-1α延长因子为内参基因。扩增28SrDNA的引物为表1中SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，扩增eEF-1α的引物为表1中SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8。扩增体系：Fast Essential DNA Green Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

BMV:OsPUB23沉默植株，与对照植株相比，对稻瘟菌的抗性增加：沉默植株和对照植株在接种稻瘟菌后，观察病害发生的现象。OsPUB23沉默的植株，与对照植株相比，对稻瘟菌的抗性增加。与对照植株相比，BMV:OsPUB23沉默植株的病斑较小，且体内的真菌量较少(图2)，这些都表明OsPUB23负向调控对稻瘟病的耐性。

以水稻Actin基因作为内参基因，对已报道的跟植物抗病有关基因OsLOX1、OsNH1、OsPR1a、OsPR3和OsWRKY45的表达量进行检测。对病菌的抗性，一般由SA途径和/或JA途径调控的，其中，OsLOX1，OsPR3与JA途径相关；OsPR1a，OsNH1与SA途径相关；OsWRKY45正向调控对真菌的抗性。

扩增Actin的引物为表1中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，扩增OsLOX1、OsNH1、OsPR1a、OsPR3和OsWRKY45的引物为表1中SEQ ID No.11～20。扩增体系：Fast EssentialDNA Green Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

如图4所示，接种稻瘟菌后，BMV:OsPUB23沉默植株，与对照植株相比，诱导抗病相关基因的表达情况。这些都表明了OsPUB23沉默提高对稻瘟菌抗性，可能是通过对抗病相关基因表达的调控来实现的。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 台州学院

<120> 水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atacctaggg ctcatccagg cgtggtgc 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatccatggc ggacggcttg agggagtaga 30

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagctgcggg tatccatgag a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaatgccag ggaacatagt g 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctcggcaag gacaatgg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaggagga ggatggcata 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaccctgac aagattccct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtcaaggtt ggtggacctc 20

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacgagagga accgctcatt cagataatta 30

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcagcagatc gtaacgataa agctactc 28

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaacgctcgc tggcatcaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atcgcctcct ccaccgtcat 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggcgtctc cttgatgtcc tt 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgagttgtgg gtcccttctt tc 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgtatgcta tgctacgtgt tt 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cactaagcaa atacggctga ca 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gggtcggcta ctacaagagg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tccctgcagg ctatgttatc t 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgggcagaag gagatccaaa act 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gccgatgtag gtgaccctgt agc 23

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagtgactcc gactcctcgt c 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gttcagatcc agatcgaaag ct 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggagcagcaa aagaatgagg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggtcttcagc ttcaccatcc 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgcagctccg acaacatct 19

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctgggtgac actctctcta caag 24

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccacggcacc gggatgacc 19

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agcttctcct tgatcttgtc ca 22

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

actgtagtat tacttgatga gata 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caatatttga tgtcatgaca at 22

<210> 31

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atggaggagg cggcggcgga ggtgccgtcc tacttcctgt gcccgatctc gctggagatc 60

atgagggacc cggtgacgct ggcgacgggg atcacctacg accggagcag catcgagcgg 120

tggatgttcg gcggcggcgg cggcgacggg gggaagggga cgtgcccggt gacgcggcgg 180

cagctggcgc cggcggagcg ggaggcgacg cccaaccaca cgctgcggcg gctcatccag 240

gcgtggtgcg ccgcgcacgc cgtcgagagg ttccccaccc cgcgcccgcc cgtcgactcc 300

tgccgcgtcg ccgcgctcgt cgacgagggg acgacgacga tgctcggcgg cggcggcagg 360

cagcggcagc tcgccgcgct ccgggagatc aaggccatcg ccgccgagag cgaccgcaac 420

aagcgctgcg tcgaggccac gcccggcgcc gtcgagttcc tcgtctccgt cgtcgtccag 480

agccatgccg ccgcctccac ctcagccagc tcggacgacg acgacctgtt cgactcggtg 540

atcgattccc ccatgtcgac gagctcgccg gaggaggagg ccctgggcgt gctctactcc 600

ctcaagccgt ccgagcccac cctgcgccgc gtcctcggca aggacaatgg cgtcggcttc 660

ctcgacaccc tcgcctccgt gctccgccgc ccgagctacc gttcgcgcgc gtatgccatc 720

ctcctcctga aggcggtgac gtcggcgatg ccgccggagc ggctgatggc ggtgagcccc 780

gagctggtgg aggaggtggt ccgggtggtg tccgacggcg tgtcgtcgaa ggcggtgaag 840

gcggcgctgc acgtgctgtg ccggctgtgc ccgtgggggc ggaaccgcgt gaaggcggtg 900

gaggccggcg cggtggcggc gctggtggag ctcctcctcg acgaggaggg cggcggcggg 960

cggcggcgcg cggcggagct ggcggtggtg gcgatcgacc acctgtgcgg gtgcgcggag 1020

gggaggtcgg agctggtggc gcacccggcg gggctcgccg tggtgtccaa gagggcgatg 1080

cgggtgtcgc cggcggccac cgagagcgcc gtgcgcgcgc tccacgccgt cgcgaggaac 1140

gcggcgacgc cggccgtgct gcaggagatg ctcgccgtcg gcgtggtggc gaagctgctg 1200

ctggtgctgc aggcggacgg cggcgagcgc gccagggcga gggcgaggga gatgctcagg 1260

gcgaacgcta gggtttggaa ggactcgcca tgcttgcaag ctcaccttaa ggcttcttac 1320

ccctcctga 1329

<210> 32

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Met Glu Glu Ala Ala Ala Glu Val Pro Ser Tyr Phe Leu Cys Pro Ile

1 5 10 15

Ser Leu Glu Ile Met Arg Asp Pro Val Thr Leu Ala Thr Gly Ile Thr

20 25 30

Tyr Asp Arg Ser Ser Ile Glu Arg Trp Met Phe Gly Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Asp Gly Gly Lys Gly Thr Cys Pro Val Thr Arg Arg Gln Leu Ala Pro

50 55 60

Ala Glu Arg Glu Ala Thr Pro Asn His Thr Leu Arg Arg Leu Ile Gln

65 70 75 80

Ala Trp Cys Ala Ala His Ala Val Glu Arg Phe Pro Thr Pro Arg Pro

85 90 95

Pro Val Asp Ser Cys Arg Val Ala Ala Leu Val Asp Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Thr Met Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Arg

115 120 125

Glu Ile Lys Ala Ile Ala Ala Glu Ser Asp Arg Asn Lys Arg Cys Val

130 135 140

Glu Ala Thr Pro Gly Ala Val Glu Phe Leu Val Ser Val Val Val Gln

145 150 155 160

Ser His Ala Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ser Ser Asp Asp Asp Asp Leu

165 170 175

Phe Asp Ser Val Ile Asp Ser Pro Met Ser Thr Ser Ser Pro Glu Glu

180 185 190

Glu Ala Leu Gly Val Leu Tyr Ser Leu Lys Pro Ser Glu Pro Thr Leu

195 200 205

Arg Arg Val Leu Gly Lys Asp Asn Gly Val Gly Phe Leu Asp Thr Leu

210 215 220

Ala Ser Val Leu Arg Arg Pro Ser Tyr Arg Ser Arg Ala Tyr Ala Ile

225 230 235 240

Leu Leu Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Met Pro Pro Glu Arg Leu Met

245 250 255

Ala Val Ser Pro Glu Leu Val Glu Glu Val Val Arg Val Val Ser Asp

260 265 270

Gly Val Ser Ser Lys Ala Val Lys Ala Ala Leu His Val Leu Cys Arg

275 280 285

Leu Cys Pro Trp Gly Arg Asn Arg Val Lys Ala Val Glu Ala Gly Ala

290 295 300

Val Ala Ala Leu Val Glu Leu Leu Leu Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Arg Arg Arg Ala Ala Glu Leu Ala Val Val Ala Ile Asp His Leu Cys

325 330 335

Gly Cys Ala Glu Gly Arg Ser Glu Leu Val Ala His Pro Ala Gly Leu

340 345 350

Ala Val Val Ser Lys Arg Ala Met Arg Val Ser Pro Ala Ala Thr Glu

355 360 365

Ser Ala Val Arg Ala Leu His Ala Val Ala Arg Asn Ala Ala Thr Pro

370 375 380

Ala Val Leu Gln Glu Met Leu Ala Val Gly Val Val Ala Lys Leu Leu

385 390 395 400

Leu Val Leu Gln Ala Asp Gly Gly Glu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg

405 410 415

Glu Met Leu Arg Ala Asn Ala Arg Val Trp Lys Asp Ser Pro Cys Leu

420 425 430

Gln Ala His Leu Lys Ala Ser Tyr Pro Ser

435 440

Claims

1.水稻OsPUB23基因在调控水稻抗性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水稻OsPUB23基因的核苷酸序列如SEQID No.31所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控为负调控。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抗性为抗病性。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗病性为对稻瘟菌的抗性。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控为调控水稻活性氧积累和/或抗病相关基因的表达；优选的，所述抗病相关基因为OsLOX1、OsNH1、OsPR1a、OsPR3和OsWRKY45。

7.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：所述抗性为抗旱性。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述调控为调控水稻脯氨酸含量或/和可溶性糖含量。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述调控为调控水稻干旱相关基因的表达；优选的，所述水稻干旱相关基因为OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1。