CN106591322A - 调控植物开花的银杏MADS‑box类转录因子基因GbMADS9及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供调控植物开花的银杏MADS‑box类转录因子GbMADS9基因。该基因是以银杏雌花总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而获得的。其优点是：GbMADS9基因可调控植物开花，缩短植物童期，同时受GA3、ABA、盐胁迫、干旱胁迫和冷害胁迫的诱导，超表达GbMADS9基因可增强植物对渗透胁迫的耐受性；可应用于植物花期的调控。

Description

调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子基因GbMADS9及其 编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说是一种调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)原产我国，银杏科银杏属，落叶乔木，雌雄异株，又称白果树、公孙树。银杏是目前世界上最古老的孑遗植物，有着“活化石”之称，广泛应用于园林景观、医药、食品、保健等领域。由于银杏的童期非常长，给银杏优良品种的育种带来了严重的障碍，使得银杏许多经济效益和社会价值受到很大程度的限制。近年来通过基因工程手段对木本植物开花相关基因的遗传改造，在缩短木本植物的童期研究中已取得了一定的成效。因此，利用基因工程技术缩短童期有望在银杏上实现。

MADS-box基因家族编码的转录因子(TF)与一个保守的DNA结构域结合，称为MADS-box。这些基因在生物有机体中普遍存在，具有广泛的调节功能，如在动物心肌发育，酵母中信息素反应，精氨酸代谢和控制植物的生长和发育等。植物中MADS-box基因的大小和功能已经在多种植物中被研究报道，如拟南芥，水稻，矮牵牛，番茄，玉米，高粱，梅花和兰花。这些研究表明MADS-box基因扮演着许多重要的调节作用，包括裂区的分化形成，胚胎的发育，果实的成熟，营养器官发育，控制开花时间，以及调控花的分生组织和器官的形成等。此外，一些MADS-box基因也参与调控次生代谢产物的生物合成途径和非生物胁迫的耐受性。

银杏中已有一些MADS-box基因被报道。Jager等人首先在银杏中分离出33个MADS-box基因。系统发育分析表明，这些基因中的一个GBM5基因，是拟南芥AGAMOUS(AG)MADS-box基因同源基因。Lovisetto等也确认Bsister MADS-box(GBM10)基因来自银杏。GBM10在烟草中的过表达研究表明，其在胚珠和种子发育中起重要作用。最近报道的GbMADS2和GbSEP基因，分别属于AG分支和SEP分支，它们可能参与生殖器官的发育。但是，银杏中MADS-box基因调控开花时间和胁迫响应的功能未见报道。

发明内容

本发明的目的在于一方面提供一种调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因，如序列表SEQ ID NO:1所示。是从“家佛手”银杏中分离克隆的一段完整编码区的cDNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析可知，它属于B_sister类MADS-box蛋白的GGM13分支，命名为GbMADS9；可调控植物开花，增强植物对渗透胁迫的抗逆性。

本发明第二方面：调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因是以银杏雌花总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而获得的具有银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段，如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明第三方面：调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:3所示。

本发明第四方面是提供一种含有上述基因的克隆载体；

本发明第五方面是提供一种含上述基因的表达载体；

本发明第六方面是提供所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因在调控植物开花中的应用，将所述基因用花絮浸染法导入拟南芥植物中，以调控植物开花时间。

本发明第七方面是提供一种与上述第二方面所述GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段同源的cDNA序列。

本发明第八方面是提供所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因在调控植物渗透胁迫耐受性中的应用。

调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子基因GbMADS9及其编码蛋白与应用，其优点是：GbMADS9基因可调控植物开花，缩短植物童期，同时受GA3、ABA、盐胁迫、干旱胁迫和冷害胁迫的诱导，超表达GbMADS9基因可增强植物对渗透胁迫的耐受性；可应用于植物花期的调控。

附图说明

图1A为将GbMADS9基因的蛋白质与同源MADS-box蛋白质的氨基酸序列比对的结果；

图1B为GbMADS9基因组结构中的外显子与内含子；

图2为MADS-box蛋白质序列比对构建的系统发育进化树；

图3为GbMADS9的Southern杂交分析；

图4A为银杏不同组织中GbMADS9的表达模式；

图4B为银杏果的生长发育过程中GbMADS9转录水平的变化；

图5A、5B、5C分别为植物激素GA3，IAA和ABA处理后GbMADS9的表达模式；

图6A、6B、6C分别为GbMADS9在盐胁迫、干旱胁迫、冷害胁迫的表达模式；

图7为转基因和野生型拟南芥植株的内源开花相关基因表达谱；

图8为GbMADS9转基因植物和WT植物的生长；

图9A、9B、9C均为渗透胁迫对WT和GbMADS9过表达转基因植株叶片生理特性的影响；

图10A、10B、10C、10D均为在渗透胁迫下GbMADS9过表达转基因植株和WT植株对抗氧化酶活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一

银杏GbMADS9基因的获得

S1、银杏雌花总RNA的提取：

S11、取1g新鲜的银杏雌花，在液氮中充分研磨后转入10ml遇冷的离心管中，加入4ml CTAB提取液，60℃水浴30min；

S12、再向步骤S1获得的物质加入4ml氯仿异戊醇溶液混匀，冰浴5min后，在4℃,12000rpm条件下离心10min，吸取上清液，加入8M LiCl混匀，-80℃条件下静置60min；然后在4℃,12000rpm条件下离心10min；弃上清，70％酒精洗涤两次，离心管倒置10min；

S13、再加入DNase至步骤S12经处理后的溶液中消化45min后，重复S12步骤；最后加入100μL DEPC水，即得到银杏雌花RNA。

S2、步骤S1制备的银杏RNA反转录获得cDNA；第一链cDNA的合成使用Clontech公司的PowerScriptTM Reverse Transcriptase试剂盒，方法参照反转录试剂盒说明书。

S3、GbMADS9的克隆：使用RT-PCR技术，以银杏雌花总RNA反转录的cDNA为模板，进行扩增反应，目的条带胶回收，将回收产物克隆到pMD18-T载体中并测序，即得到银杏GbMADS9基因组序列全长(见序列表)；

用于RT-PCR扩增反应的GbMADS9cDNA全长的引物为：

MADS9-FP：5'-CTCAATCAGTCCGCTTTATCTC-3'

MADS9-RP：5'-GAATACTGTGTAGTATTTTAAATAT-3'

RT-PCR反应体系：Taq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，MADS9-FP(10mM)1μL，MADS9-RP(10mM)1μL，ddH₂018.5μL，总体积25μL；反应条件：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，33个循环；72℃，10min,4℃，10min。

实施例二

银杏基因信息与同源性的分析

本发明银杏GbMADS9基因组序列长度为2820bp，序列中含有684bp的最大开放阅读狂，编码227个氨基酸，分子量为26.3kDa，等电点为8.5(分子量、等电点通过预测网站www.expasy.org/tools/protparam.html获得)。银杏GbMADS9转录因子氨基酸序列与其他植物的蛋白质有51％-65％同源性(包括来自玉米的ZMM17，金鱼草的AmDEFH21，矮牵牛的PhFBP24，拟南芥的AtAGL32，买麻藤的GGM3，欧洲紫杉的TBBS和细辛的AeAP32)(同源性分析网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，且GbMADS9基因在氨基酸残基中具有C末端区域中的PI基序(FRVQPTQPNLQD)，目前所有的MADS-box转录因子都包含PI型蛋白质区域。(如图1A所示，图1A是利用DNAMAN 5.0软件制作)

同时，该基因组结构包含七个内含子和八个外显子。(如图1B所示)

将MADS蛋白质序列比对构建系统发育进化树(如图2所示)，可知总共有85种II型MADS-box基因被分为14个亚组：AG，AGL12，TM8，TM3，SQUA，AGL2，AGL6，FLC，STMADS11，AGL17，AGL15，GLO，DEF和GGM13。系统发育分析表明GbMADS9基因属于Bsister类MADS-box蛋白的GGM13分支。

实施例三

银杏GbMADS9基因Southern杂交分析：实验步骤按照下列方法进行：

银杏雌花DNA的提取：

S1、取1g新鲜的银杏雌花，在液氮中充分研磨后转入10ml遇冷的离心管中，加入4ml CTAB提取液，60℃水浴30min；

S2、再向步骤S1获得的物质加入4ml氯仿异戊醇溶液混匀，冰浴5min后，在4℃,12000rpm条件下离心10min，吸取上清液，加入8M LiCl混匀，-80℃条件下静置60min；然后在4℃,12000rpm条件下离心10min，；弃上清，70％酒精洗涤两次，离心管倒置10min；

S3、再加入RNase至步骤S2经处理后的溶液中消化45min后，重复S2步骤；最后加入100μL DEPC水，即得到银杏雌花DNA。

Southern杂交采用Roche生物公司的DIG High Primer DNA labeling andDetection Starter Kit II试剂盒进行，以银杏MADS9基因组序列为探针，分别用探针区域中无识别位点的限制性内切酶EcoRI、BamHI和XmaI将上述获得的银杏DNA过夜酶切，探针标记、杂交、洗膜和杂交信号检测均按照杂交试剂盒说明书进行。Southern杂交的结果显示只有一个特定的杂交带，范围从1.5kb至2.5kb(如图3所示)，这表明GbMADS9基因是银杏中的一个单拷贝基因。

实施例四

银杏GbMADS9在不同组织内的表达分析

分析GbMADS9基因在不同组织中的表达模式，目的是探讨GbMADS9基因在银杏生长发育过程中的作用。

具体为：

实时定量PCR以测量所选择基因的相对转录水平：将qRT-PCR在Perkin-Elmer7000thermal cycler荧光定量PCR仪上进行，PCR反应采用One-step RT-PCR master mixreagents(大连，TakaRa)20μL反应体系，在96孔PCR仪上进行，Thermal cycler条件设定按照说明书完成。

PCR反应条件为95℃，3分钟；94℃，1分钟，60℃，30秒，72℃，30秒，40个循环；72℃，3分钟；

实时荧光定量RT-PCR分析中涉及的GbMADS9基因的引物为：

MADS9-QF：5'-GCTCTAGAATGGGGAGGGGAAAGATTG-3'

MADS9-QR：5'-CGGGATCCTCAACATTGTTGATGGATATGGTC-3'

原始数据用Light Cycler软件进行分析；而表达标准参考Gb18S和GbGAPDH两个银杏内参基因，基因的表达量通过比较CT值来获得，目的基因GbMADS9在各个组织的相对表达量，用目的基因mRNA表达量比内参基因mRNA表达量的相对倍数来表示，每个样品重复三次。

实验中制备内参基因GbGAPDH的引物为：

GAPDH-FP：5'-TAGGAATCCCGAGGAAATACC-3'

GAPDH-RP：5'-TTCACGCCAACAACGAACATG-3'

实验中制备内参基因Gb18S的引物为：

18S-FP：5'-ATAACAATACTGGGCTCATCG-3'

18S-RP：5'-TTCGCAGTGGTTCGTCTTTC-3'

qRT-PCR结果如图4A所示，分析表明，GbMADS9基因在根、茎叶中几乎不表达量，但是其在生殖器官如花和果实中具有很高的表达量。而且，GbMADS9基因在花中的表达量显著高于果实。在雄花中检测到的GbMADS9基因表达量最高，成熟果实最低。

由于MADS-box同源基因对胚珠和果实的形成非常重要，所以还检测了GbMADS9基因在果肉组织不同发育阶段的表达模式。选择生长势和负载量均一致的银杏12株，在12株树中，选择长势相一致的36个主枝，实验于2015年果实发育时进行，分别在4.25，5.06，5.16，6.01，6.15，7.06，7.21，8.01，8.14，8.26，9.07，9.14日采收银杏果实取样，样品带回实验室，果肉置于液氮中保存，再利用qRT-PCR技术(同上所述)检测银杏GbMADS9在不同组织内的表达分析；

结果表明，银杏的GbMADS9基因在胚珠和果实果肉中普遍表达，并且随着果肉的生长持续表达。详细地，从果肉中分离出的石细胞表达量持续增加，在6-15的样品中达到峰值，其表达水平大约是幼胚珠的14倍。然而，表达水平在这之后逐渐下降，8-14样品中几乎检测不到表达量，并且在成熟果肉中检测不到转录物。(如图4B所示)

实施例五

植物激素处理时GbMADS9的表达分析

实验目的是为了确定GbMADS9基因表达是否受植物激素调节。具体为以日光温室里种植的银杏幼苗为材料，在银杏幼苗长到四叶期时期，选择生长势一致的银杏幼苗48株，每个处理随机选择12株幼苗，用赤霉素(GA3)，生长素(IAA)，脱落酸(ABA)和水(对照)喷洒，在处理20d后采收银杏叶片，样品带回实验室，分别置于液氮保存；

再利用qRT-PCR技术(同实施例四中的qRT-PCR操作方法)检测植物激素处理时GbMADS9的表达分析。实验结果如图5A、5B、5C所示。GA3和ABA处理可以显著增强GbMADS9基因的表达量，但是IAA对GbMADS9基因表达量几乎没有影响。

实施例六

银杏GbMADS9在逆境胁迫下的表达量

实验目的是为了确定银杏GbMADS9基因在盐胁迫、干旱胁迫和冷害胁迫处理时的表达模式，分析GbMADS9是否涉及对非生物胁迫的应答。具体为选择生长势一致的银杏幼苗48株，每个处理随机选择12株幼苗，在银杏幼苗长到四叶期时用盐胁迫、干旱胁迫、冷害胁迫和对照处理，在处理20d后单独采收银杏叶片，样品带回实验室，分别置于液氮保存。再利用qRT-PCR技术(同实施例四中的qRT-PCR操作方法)检测银杏GbMADS9在逆境胁迫下的表达量，实验结果如图6A、6B、6C所示，表明GbMADS9基因的表达受到盐胁迫、干旱胁迫、冷害胁迫这三个胁迫的诱导。

实施例七

拟南芥中GbMADS9基因的过表达可以促进开花

S1、构建并且选择在35S启动子控制下过量表达GbMADS9基因的植物，再用一步克隆法构建携带有35S和GbMADS9的二元植物表达载体；GbMADS9基因编码区的PCR产物克隆到植物表达载体pBI121(由市场购得)中，具体操作步骤参照说明书进行；

S2、将GbMADS9插入到pBI121二元载体的CaMV 35S启动子和GUS基因之间，再将所得重组质粒导入到根癌农杆菌菌株EHA105，然后利用花絮浸染法将转化菌株侵染到野生型拟南芥中。获得的T1代植物用卡那霉素筛选，阳性转基因株系通过PCR验证；通过隔离分离从T3选取纯合子植物；

S3、将T3代转基因株系种子播种于1/2MS培养基并放置于培养箱中，在4℃黑暗条件下培养3天；幼苗在24℃连续光照条件下生长6天，等幼苗长到6厘米移植，主茎超过5mm开始进行分组，形成花环和茎生叶时开始进行第一朵花的计数；

实验结果如表1所示：35S和GbMADS9转基因品系和WT(野生型)植物相比在天数和叶数方面表现出早花的表型，这说明GbMADS9参与银杏开花时间的调节，即GbMADS9基因的生物学功能可控制花的发育。

表1野生型(WT)和GbMADS9过表达转基因拟南芥T3代植株的开花时间和叶数比较。

实施例八

转基因拟南芥植株中与开花相关基因的表达

在开花期收集整株植物(不包括地下部分)，利用qRT-PCR技术(同实施例四中的qRT-PCR操作方法)检测GbMADS9基因在拟南芥中与开花相关基因的表达，分析控制开花时间和花器官特征的基因的转录水平，以验证含有35S和GbMADS9基因的转基因拟南芥植株调控早花的机制。

实验结果如图7所示，转基因拟南芥中GbMADS9基因的过表达显著促进FLOWERINGLOCUS T(FT)，APETALA1(AP1)，LEAFY(LFY)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1(SOC1)的转录水平，此外，在转基因株系中CONSTANS(CO)基因的转录水平有所上升，相反，在转基因品系中AGAMOUS-LIKE24(AGL24)和SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)基因的转录水平显著下调。

进一步地，测量FLOWERING LOCUS T(FT)相对不表达量的引物如下：

AtFT-S：5'-TATCTCCATTGGTTGGTGACTG-3'

AtFT-A：5'-GGGACTTGGATTTTCGTAACAC-3'

测量APETALA1(AP1)相对不表达量的引物如下：

AtAP1-S：5'-CTGTGATGCTGAAGTTGCTC-3'

AtAP1-A：5'-TGTATTGACGTCGGACTCAG-3'

测量LEAFY(LFY)相对不表达量的引物如下：

AtLFY-S：5'-TCCACTGCCTAGACGAAGAAGC-3'

AtLFY-A：5'-TCCCAGCCATGACGACAAGC-3'

测量SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1(SOC1)相对不表达量的引物如下：

AtSOC1-S：5'-CCGAACTCATGTTGAAGCTTGTTGAG-3'

AtSOC1-A：5'-CGGAGATTTGTCCAGCAGGTG-3'

测量CONSTANS(CO)相对不表达量的引物如下：

AtCO-S：5'-TAAGGATGCCAAGGAGGTTG-3'

AtCO-A：5'-CCCTGAGGAGCCATATTTGA-3'

测量AGAMOUS-LIKE24(AGL24)相对不表达量的引物如下：

AtAGL24-S：5'-GAGGCTTTGGAGACAGAGTCGGTGA-3'

AtAGL24-A：5'-AGATGGAAGCCCAAGCTTCAGGGAA-3'

测量SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)相对不表达量的引物如下：

AtSVP-S：5'-GCAACTAACGGAAGAGAACGAG-3'

AtSVP-A：5'-GAGCTCTCGGAGTCAACAGG-3'

实施例九

拟南芥GbMADS9基因的过表达在增强其对渗透胁迫的耐受性方面的表达

S1、比较400mM甘露醇处理转基因植物和野生型(WT)植物的生长和表型的效果，以阐明GbMADS9基因的过表达是否影响植物对渗透胁迫的耐受性。

具体为：

在拟南芥幼苗生长到四叶期用400mM甘露醇处理转基因植物和野生型(WT)植物的幼苗叶片，渗透胁迫处理15天后，单独收集叶片并保存，然后测定其叶绿素、脯氨酸及MDA含量来研究GbMADS9基因是否可以提高植株对渗透胁迫的耐受性。将收集的叶片利用qRT-PCR技术(同实施例四中的qRT-PCR操作方法)检测拟南芥GbMADS9基因的过表达在增强其对渗透胁迫的耐受性方面的表达，实验结果如图9所示，渗透胁迫处理15天后，过量表达GbMADS9基因的转基因拟南芥植株根的长度均比WT植物显著增长。

进一步地，叶绿素含量测定，称取新鲜样品0.2g，放入研钵中，加0.2g石英砂和3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用2ml乙醇冲洗研钵、研棒及残渣三次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

辅氨酸含量测定：称取待测植物叶片0.5g，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，冷却后过滤于经消毒后的试管中，吸取2ml提取液于另一带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置3～5min，取上层液在3000rpm下离心5min。用吸管吸取上层溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。

MDA含量测定：取新鲜植物样品0.5g，加5％三氯乙酸5mL研磨，之后匀浆在3000r/min下离心10min。取上清液2mL，加0.67％硫代巴比妥酸2mL，混合后在100℃水浴中保温30分钟，再置于冰浴中冷却，在1500rpm下再离心10分钟，取上清液测定波长450nm、530nm和600nm处的吸光度。

实验结果如图9A所示，渗透胁迫15天后观察到野生型植株中叶绿素的含量显著比转基因品系低；如图9B所示，脯氨酸含量和叶绿素含量变化趋势相似；如图9C所示，在渗透胁迫处理15天后，转基因株系的MDA含量相比野生型株系显著降低。

S2、通过检测渗透胁迫时转基因拟南芥叶片抗氧化酶的活性来分析GbMADS9基因的过表达对抗氧化途径中抗氧化酶活性的影响

具体为：

S21、超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml pH7.8的磷酸缓冲液混匀，4000r/min离心15min上清液即为粗酶液。取1ml上清液稀释5倍后加入5ml提取液，4000lx日光灯下反应20min，最后在560nm处测定反应液的吸光度值；

S22、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定：称取1g新鲜叶片组织，加入1.6mL预冷的提取液(含1mmol·L^-1AsA，3mmol·L^-1β-巯基乙醇，0.5mmol·L^-1PMSF，2％PVP，1mMEDTA)。用液氮研磨，提取液于4℃，4000×g离心20min，上清液用于酶活性的测定。取0.1ml酶液，加入1.7ml含0.1mM EDTA-Na₂的PBS(0.05mol/L，pH7.0)，再加入0.1ml 5mM的AsA，最后加入0.1ml 20mM H₂O₂，立即在20℃条件下测定OD290值在10min时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，求酶活性；

S23、过氧化氢酶(CAT)活性的测定：称取1g新鲜叶片组织，放入研钵中，加入4ml蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，用5ml蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过滤。然后再取滤液10ml至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释液。取100ml容量瓶，向其中加入稀释后的酶液10ml，将容量瓶放在20℃水浴中保温10min。保温后加入0.018％H₂O₂5ml,用紫外分光光度计于240nm处测其吸光值，重复3次求平均值；

S24、谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定，称取植物组织0.5g，加入0.5ml粗酶液及0.5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.7)的试管中加入0.25ml磷酸缓冲液(pH 6.8)，反应液置于恒温水浴25℃中保温10min后，迅速用紫外分光光度计于412nm处测其吸光值，重复3次求平均值。

实验结果如图10A、10B、10C所示，在渗透胁迫时，含有GbMADS9基因的转基因拟南芥株系中超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)的活性显著增加。如图10D所示，转基因株系中谷胱甘肽还原酶(GR)的活性和野生型株系相比有小幅下降。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 长江大学

<120> 调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因及其编码蛋白与应用

<160> 3

<170> DNAMAN 5.2.9 Demo version

<210> 1

<211> 2761

<212> cDNA

<213> 银杏（Ginkgo biloba L.）

<220>

<223> 银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因全长序列

<400> 1

1 ctcaatcagtccgctttatctctcacactctgtcatactgtcagtctgcttgagataagt

61 atggggaggggaaagattgaaatcaagaggattgaaaatgcagccaacagacaagtcact

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1201 agaggatttagcatttcacctgatatatcttcatttggaaaccgtaggaaaatgaattaa

1261 gagatctaataatccaaaaaggaatcattacacgagtttgaaaactcctgaagaaatatt

1321 tgcaaaacccttactttaaatattatgatatttactttgggaactctggaaatatatgta

1381 cttctcctttatttaatattgtttatgtgatttagctggaaggttatgaaggaacacagt

1441 tgaattttacttaccttgactacattttacttaatttgaggtaggtggattccacaaggt

1501 taaattgactacattcctgcgtggatattaatgtatagttttgaagggtttatgtctgaa

1561 gaatagtgctggattgaatgatgatgaagtttaatccaagatgtatattttcatgtcaat

1621 aagattaataggaaagtctttatagtggacttcaagcatttctatctagtaccaaattat

1681 agtgagttctccactacaagcaataatatagagatcctcgtttgtgtaaaaccttcgaaa

1741 taaattggaaatggttttcttcattttttttttcagaaattcccactcatattgaatggg

1801 tatacacaagggtgagacttgtttacccagtaattcgaatgtggggtggttataatttgg

1861 ttgttagactgtgtattcattctaatatattatttcaatattcttcccattaaaatcttt

1921 cctagagccatgtgatgggcgaggagctcaacacattgtcgacgaatgagctgcaccatc

1981 tcgaacaaaaccttgaaattgcaacagctagggtacgaacaagaaaggtatgatcacaag

2041 aggattcaattttatcatgactgattaagccttttccaattctaagtggaccagcctcac

2101 caaattcttgtatgtttgttatgaaatagaatcaacagatggctcaagagttagacaaac

2161 tgaggaaaaaggtaagatgtttaaaatttttttttttcagtttcttgtagagagagagag

2221 agacagatgaaattaaaagttgaatatggtttattgaattaggaggattttctgcgccag

2281 aaaaacaataagctctaccaaagggtatgcgttatgtacaatatttatttatcgagttaa

2341 aatgaaataaaattattgagcgctttctgaaatcaaaattggtttatcgaaatttcacaa

2401 gggagattaattcagattcagcttctgtgctctaaaatttattagtctctaaattttttt

2461 cttttgccaattttattaacagcttgttgagattcaagcaccagtggtgagggagtctgt

2521 attttatgaagaaggaggtccgattccttttaatatgacacctgtagtacctgagttccg

2581 tgtgcagccaagccagcccaacttgcaggatattgtataccaacatactgatatagaatt

2641 ggggtacataattataaaatcttatctaatatatatctttgccaacattcatttgtcgag

2701 ttgtttttatcatcaataataagaagatgacaatttcattttctttgatgacagattcga

2761 ccatatccatcaacaatgttgacattctatgggaaatatttaaaatactacacagtattc

<210> 2

<211> 684

<212> cDNA

<213> 银杏（Ginkgo biloba L.）

<220>

<223> 银杏MADS-box类转录因子GbMADS9编码基因

<400> 2

1 atggggaggg gaaagattga aatcaagagg attgaaaatg cagccaacag acaagtcact

61 tttgctaagc gtagaggagg actgcttaag aaggctcatg agctttctgt actgtgtgct

121 gccgaggttg cactcatcat tttctccggc actggaaagc tttttgagta ttcaagctcc

181 agtatgaaga caattttgga gagatatgaa aggttatcag gagcacggct gtgggattat

241 gaacaccaaa atttattctc tgagatgaca gccattagga acgagaacga gaggcttaaa

301 aatgccttaa gccatgtgat gggcgaggag ctcaacacat tgtctacgaa tgagctgcac

361 catctcgaac aaaaccttga aattgcaaca gctagggtac gaacaagaaa gaatcaacag

421 atggctcaag agttagacaa actgaggaaa aaggaggatt ttctgcgcca gaaaaacaat

481 aagctctacc aaaggcttgt tgagattcaa gcaccagtgg tgagggagtc tgtattttat

541 gaagaaggag gtccagttcc ttttaatatg acacctgtag tacctgagtt ccgtgtgcag

601 ccaagccagc ccaacttgca ggatattgta taccaacata ctgatataga attgggattc

661 gaccatatcc atcaacaatg ttga

<210> 3

<211> 227

<212> PTR

<213> 银杏（Ginkgo biloba L.）

<220>

<223> 银杏MADS-box类转录因子GbMADS9氨基酸序列

<400> 3

Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Ala Ala

1 5 10 15

Asn Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Gly Gly Leu Leu Lys

20 25 30

Lys Ala His Glu Leu Ser Val Leu Cys Ala Ala Glu Val Ala Leu

35 40 45

Ile Ile Phe Ser Gly Thr Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Met Lys Thr Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Leu Ser Gly Ala

65 70 75

Arg Leu Trp Asp Tyr Glu His Gln Asn Leu Phe Ser Glu Met Thr

80 85 90

Ala Ile Arg Asn Glu Asn Glu Arg Leu Lys Asn Ala Leu Ser His

95 100 105

Val Met Gly Glu Glu Leu Asn Thr Leu Ser Thr Asn Glu Leu His

110 115 120

His Leu Glu Gln Asn Leu Glu Ile Ala Thr Ala Arg Val Arg Thr

125 130 135

Arg Lys Asn Gln Gln Met Ala Gln Glu Leu Asp Lys Leu Arg Lys

140 145 150

Lys Glu Asp Phe Leu Arg Gln Lys Asn Asn Lys Leu Tyr Gln Arg

155 160 165

Leu Val Glu Ile Gln Ala Pro Val Val Arg Glu Ser Val Phe Tyr

170 175 180

Glu Glu Gly Gly Pro Val Pro Phe Asn Met Thr Pro Val Val Pro

185 190 195

Glu Phe Arg Val Gln Pro Ser Gln Pro Asn Leu Gln Asp Ile Val

200 205 210

Tyr Gln His Thr Asp Ile Glu Leu Gly Phe Asp His Ile His Gln

215 220 225 227

Gln Cys

Claims (7)

1.调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因，其特征在于：该基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因，其特征在于：调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因是以银杏雌花总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而获得的具有银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段，如序列表SEQ ID NO:2所示。

3.一种保护权利要求1或2所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:3所示。

4.一种与权利要求2所述GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段同源的cDNA序列。

5.一种克隆载体，其特征在于含有权利要求1～3任一所述的调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因。

6.如权利要求1～3任一所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因在调控植物开花中的应用，将所述基因用花絮浸染法导入拟南芥植物中，以调控植物开花时间。

7.如权利要求1～3任一所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因在调控植物渗透胁迫耐受性中的应用。