CN111876394A

CN111876394A - 抗坏血酸氧化酶rip5在调控水稻抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN111876394A
Application number: CN202010619562.XA
Authority: CN
Inventors: 张泽民; 张晶晶; 何焱; 梁嘉燕
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-07-01
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明公开了抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用。本发明通过GRISPR/Cas9系统靶向突变RIP5基因构建RIP5基因敲除突变体，发现抑制RIP5蛋白的表达量和/或活性能够有效提高植物抗旱性，即水稻抗坏血酸氧化酶基因RIP5能够负调控植物抗旱性。本发明还提供了一种用于编辑水稻抗坏血酸氧化酶基因RIP5的gRNA靶序列，该gRNA靶序列与CRISPR/Cas9基因编辑系统配合作用，可以实现RIP5蛋白的编码基因的靶向突变，进而可以调控水稻的抗旱能力。本发明的研究为植物抗旱性遗传育种提供了新的基因靶点和资源，利用该基因编辑得到的敲除突变植株具有重要的应用价值。

Description

抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，世界上有超过三分之一的人口以稻米为主食，因而促进水稻稳产、高产对于确保粮食安全及社会稳定具有十分重要意义。近年来，随着全球气候变暖、自然灾害频发、时间空间上降雨不均匀分布、水资源短缺，造成水稻的生产面积及单产的严重下降，干旱胁迫已成为影响水稻稳产、高产和优质的主要限制因子之一。干旱胁迫对植物的生长发育、农作物减产及环境恶化具有重要影响。面对自然环境危害，植物在形态学、生理学、生物化学、细胞和分子水平等方面已进化形成了一系列的适应性，如植物的避逆性、耐逆性及抗逆性等。当植物受到干旱胁迫环境时，植物会对胁迫产生应答，诱导抗旱相关基因的表达从而影响植物的生长发育来起到保护作用，所以研究和挖掘植物抗旱基因，利用转基因策略来提高作物的抗旱能力，培育抗旱作物品种，提高作物产量、确保粮食生产安全具有重要的意义。

干旱胁迫可造成植物体活性氧(ROS)的产生和积累。ROS的产生可能是植物细胞在非生物胁迫和衰老条件下最早的反应之一。在正常条件下，植物细胞中产生的ROS可通过体内抗氧化酶系统(如酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统)维持在相对稳定的水平，这种平衡可能也会因抗氧化酶的消耗或ROS的过量积累而被中断导致氧化应激，从而对细胞大分子和生物膜造成损害以及增加脂质过氧化。抗坏血酸(ASA)是一种普遍存在于植物组织的抗氧化物质，可以作为初级抗氧化物直接清除单线态氧、超氧化物和羟自由基。也可以与其它酶协同作用，间接清除植物体内的活性氧。植物中的AsA含量与抗逆性正相关，植物体内AsA含量提高或促进氧化态AsA向还原态的转变，在很大程度上都能提高植物的抗逆性。相反，植物体内AsA含量的缺乏，导致植物对氧化胁迫的耐性降低。水稻RIP5基因编码抗坏血酸氧化酶，抗坏血酸氧化酶(Ascorbic Oxidase,AO)是多铜氧化酶家族中的一员，在将氧还原为水的同时，将AsA转化为单脱氢抗坏血酸(Monodehydroascorbate，MDHA)，进而影响植物质外体的氧化还原稳态以及活性氧的清除。AO活性影响植物细胞分化和伸长，在植物生长和发育以及非生物胁迫和生物胁迫上具有重要的作用。

基因编辑可对植物内源基因进行加工，这一加工过程虽然依赖于外源性DNA的导入，但在随后的杂交过程中可快速分离，从而产生完全不携带外源DNA片段的植物个体。CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统是近年来新发展起来的一种新型基因组编辑技术。该系统由单导向RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶两部分组成。利用该技术只需更换sgRNA中一段20个核苷酸的“引导序列”就可以实现对不同靶点的准确切割，避免了蛋白质工程步骤，使得构建表达单元非常简便。随着分子生物学发展，基因编辑手段开辟了植物抗逆育种的新途径。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种抗坏血酸氧化酶RIP5蛋白突变体。

本发明的再一目的在于提供一种抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用。

所述的抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用，为通过抑制水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性，提高水稻的抗旱性。

抗坏血酸氧化酶RIP5在培育抗旱水稻中的应用。

所述的抗坏血酸氧化酶RIP5在培育抗旱水稻中的应用，为通过抑制水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性，提高水稻的抗旱能力。

所述的抗坏血酸氧化酶RIP5为来源于水稻的抗坏血酸氧化酶RIP5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述抗坏血酸氧化酶RIP5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的抑制RIP5蛋白的表达量和/或活性优选为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP5基因的174位缺失一个碱基C(发生移码突变)，进而抑制RIP5蛋白的表达量和/或活性。

所述的基因突变可通过GRISPR/Cas9系统靶向突变RIP5基因，达到抑制水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性的目的。

所述的GRISPR/Cas9系统为含有gRNA靶序列的pBGK037载体(将gRNA靶序列连接到CRISPR/Cas载体BGK03中)。

所述的gRNA靶序列为水稻抗坏血酸酶基因RIP5的CDS正义链的第158～180位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的水稻的品种优选为水稻中花11。

一种抗坏血酸氧化酶RIP5蛋白突变体，为如下任一序列：

a、如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

b、由突变型抗坏血酸氧化酶RIP5基因所编码的序列；所述的突变型抗坏血酸氧化酶RIP5基因为RIP5基因的174位缺失一个碱基C。

所述的抗坏血酸氧化酶RIP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体，为抗坏血酸氧化酶RIP5基因的174位缺失一个碱基C。

含有上述抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体的表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

所述的微生物为农杆菌；优选为农杆菌EHA105。

所述的细胞为植物细胞；优选为水稻细胞。

所述的抗坏血酸氧化酶RIP5蛋白突变体和/或抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体在提高水稻抗旱性中的应用。

一种用于编辑所述水稻抗坏血酸氧化酶RIP5基因的gRNA靶序列在调控水稻抗旱性中的应用，该gRNA靶序列为水稻抗坏血酸酶基因RIP5的CDS正义链的第158～180位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该gRNA靶序列与CRISPR/Cas9基因编辑系统配合作用，实现RIP5蛋白的编码基因的靶向突变。

所述的GRISPR/Cas9系统为含有gRNA靶序列的pBGK037载体。

一种调控水稻抗旱性的方法，为通过调控水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性实现。

所述的调控为通过抑制水稻中RIP5蛋白的表达量，以提高水稻的抗旱能力；或通过降低水稻中RIP5蛋白的活性，以提高水稻的抗旱能力；或将水稻中RIP5蛋白失活，以提高水稻的抗旱能力。

所述的抑制水稻中RIP5蛋白的表达量或降低水稻中RIP5蛋白的活性为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP5基因的174位缺失一个碱基C(发生移码突变)，进而抑制水稻中RIP5蛋白的表达量或降低水稻中RIP5蛋白的活性。

一种培育抗旱性水稻的方法，为通过调控水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性实现。

所述的抑制水稻中RIP5蛋白的表达量或降低水稻中RIP5蛋白的活性为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP5基因的174位缺失一个碱基C(发生移码突变)，以抑制水稻中RIP5蛋白的表达量或降低水稻中RIP5蛋白的活性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现水稻抗坏血酸氧化酶基因RIP5能够负调控植物抗旱性，通过抑制RIP5蛋白的表达量和/或活性，能够有效提高植物抗旱性。

(2)本发明采用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体，转化野生型ZH11，获得敲除突变体rip5，抗坏血酸氧化酶(Ascorbic Oxidase,AO)的活性测定结果表明相比于野生型植株，RIP5基因敲除突变体rip5的抗坏血酸氧化酶活性显著降低。

(3)本发明通过干旱处理实验证明，相比于野生型植株，RIP5基因敲除突变体rip5的抗旱性显著增强，当野生型植株在干旱处理后存活率为50％左右时，RIP5基因敲除突变体的存活率达90％左右。

(4)本发明发现的RIP5基因新功能为植物抗旱性遗传育种提供了新的基因靶点和资源，利用该基因编辑得到的敲除突变植株具有重要的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例1中RIP5的靶位点基因编辑结果示意图(图中：ZH11为野生型中花11水稻；rip5为RIP5基因敲除突变体)。

图2是CRISPR/Cas9敲除载体pBGK03的质粒图谱。

图3是本发明实施例2中抗坏血酸氧化酶活性测定结果图(图中：ZH11为野生型中花11水稻；rip5为RIP5基因敲除突变体)。

图4是本发明实施例3中干旱处理野生型ZH11和rip5突变体的表型及存活率统计图；其中，A为干旱处理前野生型ZH11和rip5突变体的表型；B为干旱处理后野生型ZH11和rip5突变体的表型；C为野生型ZH11和rip5突变体的存活率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中涉及的野生型水稻为中花11号(简称野生型ZH11)。

实施例1水稻RIP5基因敲除突变体rip5的获取

(1)RIP5靶位点的基因编辑

水稻抗坏血酸氧化酶基因RIP5在水稻基因组注释计划中基因编号为LOC_Os06g37150(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)(ShengzeYao,Zhirui Yang,Rongxin Yang,et al.Transcriptional regulation of miR528 byOsSPL9 orchestrates antiviral response in rice[J].Mol Plant,2019,12:1114-1122.)。本发明使用的基因敲除载体骨架为CRISPR/Cas载体BGK03(http://www.biogle.cn/index/excrispr)(图2)，将RIP5的gRNA靶序列连接到含Cas9酶表达框的CRISPR/Cas9载体pBGK03中，获得含有gRNA靶序列的pBGK037载体，其具体构建方法参考百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒使用说明Cat#BGK03。其中选取RIP5基因CDS序列的158～180位(SEQ ID NO.3：GGATAAACGGCAGGTTCCCGGGG，其中下划线部分为符合NGG的PAM序列)的序列为靶位点，合成gRNA序列(SEQ ID NO.3)，导入到包含Cas9酶表达框的CRISPR/Cas9敲除载体中，转化到农杆菌EHA105中，侵染水稻中花11成熟胚愈伤组织，再生后获得转基因株系。其转化方法参考文献(Nishimura A.,AichiI.,and Matsuoka M.,Nature protocols,2006,1,2796-2802)。

(2)转基因株系的鉴定

以提取上述得到的T0代转基因植株叶片的总DNA为模板，采用引物HPT-F(SEQ IDNO.4：5’-CGAGAGCCTGACCTATTGCAT-3’)和引物HPT-R(SEQ ID NO.5：5’-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3’)组成的引物对进行PCR扩增，筛选得到T0阳性转基因植株(阳性植株PCR扩增产物大小为481bp)。再以T0阳性植株的DNA为模板，在RIP5靶位点两端设计引物RIP5-F(SEQ ID NO.6：5’-AGCTCACTTCCAAGAGCCT-3’)和RIP5-R(SEQ ID NO.7：5’-ATTCGTTGCACTAGGATGTG-3’)，扩增后进行测序，筛选发生突变的株系。T0代自花授粉得到T1代，T1代自花授粉得到T2代。对T2代植株再次进行筛选，获得转基因阴性(分离)但RIP5靶位点发生纯合突变的独立株系1个，命名为rip5，靶序列处发生了1个碱基的删除，在RIP5基因的174位缺失一个碱基C，导致编码蛋白相应位置后移码突变，提前终止。突变后的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例2ZH11和突变体rip5的AO活性测定

抗坏血酸氧化酶(Ascorbic Oxidase,AO)的活性测定参照抗坏血酸氧化酶(AAO)活性测试盒(比色法)(南京建成生物工程研究所)中的使用说明，简述如下：

(1)粗酶液提取：分别称取0.1g实施例1中筛选得到的rip5突变体以及野生型ZH11的水稻叶片，加入1mL试剂一冰浴匀浆，4℃16000g离心10min，取上清置于冰上待测。

(2)配制反应体系：100μL粗酶液、850μL已预热的试剂二和50μL试剂三，以100μL双蒸水作为对照，快速混匀，转入1mL石英比色皿中，于265nm波长处测定吸光值。用双蒸水调零，分别测定10s的吸光度值A₁₀和130s的吸光度值A₁₃₀，ΔA＝A₁₀-A₁₃₀。以25℃中每克样品每分钟氧化1nmol抗坏血酸(ASA)所需的酶液量为1U。

结果如图3所示：酶活结果显示与野生型ZH11相比，RIP5基因敲除突变体rip5的AO酶活性显著降低。

实施例3干旱处理ZH11和突变体rip5

分别取适量野生型ZH11与突变体rip5的种子，置于放有滤纸的培养皿中浸种24h，然后将水倒尽，保持滤纸湿润，置于37℃的培养箱中催芽2d，随后转移到土中，移至培养箱中生长，昼/夜分别为28℃14h/26℃12h。将泥土完全混匀，再均等分装到塑料小盆，待水稻长到一叶一心时，移栽到提前准备好泥土的塑料小盆中，每盆种4株，置于人工气候室28℃14h/26℃12h，长至分蘖期后停止浇水两周，然后复水一周调查存活率。

结果如图4所示：结果显示与野生型相比，突变体rip5的抗旱性明显高于其野生型ZH11。存活率统计数据表明野生型存活率为50.79％，突变体rip5存活率为90.48％。以上结果表明，RIP5的功能丧失可大幅提高水稻的抗旱性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5472

<212> DNA

<213> Oryza sativa L

<220>

<223> 抗坏血酸氧化酶基因RIP5

<400> 1

atagtgtagc atagctcact tccaagagcc tcgtgacaca caccactcac tatactggcc 60

cctcctcctc ctcggagatc gagccggcca gccatggcgg ccgccgtgca gctgctcgtc 120

gtcgccgccg ccgccgccat ggcggcggcg tgctgcgccg gcatggcggc ggcggcggcg 180

acggtggagg tgacgtggga cgtggagtac gtactgtggg cgccggactg ccagcagcgg 240

gtgatgatcg ggataaacgg caggttcccg gggcccaaca tcaccgcgcg cgccggcgac 300

gtgatcagcg tcaccatgaa caacaagatg cacaccgagg gcgtcgtcat ccactggcac 360

ggcatcagac aggtactagt acactctact ggtagcatag tgaccggaca aagttttaca 420

atcatacagt tccttctttt ttttttttca agtcgaaacc aacgttatac tttctccata 480

taaaaaaaat atatgagatt ttgggtggat gggacacatc ctagtgcaac gaatctgaac 540

cgtctatcca cccaaaatcc cttatatatt aagacggaga gagtatatag ttattcggtc 600

catactagaa tataataact tcttatgttt aatataataa cttcttgtgt ttaacttttt 660

attaaaatat aatattttat cttaaaatat aacaacttta tcgatataac ttgacaaatg 720

tatatacttc ctccgtttca aaatgtaagt cattctaact tttcccacat tcatattcat 780

gttaataaat ctagataaat atatatgtat tcgttaatat caatatgaat atgggaaatg 840

ttagaatgac ttacatgtga aacggatgga gtacatggat tctctttagt ctcagcgaat 900

cataagtatt tctctttttt tctctatcta ctttcacata tcaactaatc attatcatta 960

gtcatataat tttatttact ttattaatct agtgtcaccg cctcgaactg gccactggtt 1020

ttctagcaac ccctaaaaca ggaaaacacg aagaagattt tatttttgaa caggaaaagc 1080

tcaaagtaaa ttgtcgtgtg tttgaaaaga aaaggcacaa actaataaag cgggtctatc 1140

tggattctgg aaccacccac actgcaccac cgtcagtgtc gcttccgaag ttgcgagaaa 1200

caactttgct ttagaataac ttgttctctt tttaaaaaaa tacagtttgt gaaaaaaaaa 1260

tcgtagttta acttaacttt gtaacagagt ataagcccta ctctgctttt atattttcct 1320

tttatgcact aaccagctcg agcacagcct aaaacttaag aaaaaaaatt atgattctta 1380

agaggcatgg agaggtatta ataacttttg aagtatagtt ttttttatct tctcgtagta 1440

ttgagaagtg gcaaattttg tacttaactg tgtaaaaaat agtacctctc attttcttct 1500

caaagaacta taaatttact caaaacaaca taaactgagt agaaactaga aaggtcatgc 1560

attttactta ctataacagt aatctaaact actacacaac tacgagtttt ataattctag 1620

aatgaatata atgaaaaatg atgtaaaatc aattaccacg catgcagttt ggcacgccgt 1680

gggcggacgg gacggcatcg atatcccagt gcgcagtgaa cccgggcgag acgttcgtct 1740

acaagttcgt cgccgacaag ccgggcacct acttctacca cggccacttc gggatgcagc 1800

gcgccgcggg cctgtacggt tccctcatcg tcctcgactc gccggagcag cccgagccgt 1860

tccgccacca gtacgacgac ggcggcgagc tccccatgat gctcctcagc gactggtggc 1920

accagaacgt ctacgcccag gccgccggac tcgacggcaa ggacaggcac ttcgagtgga 1980

tcggcgagcc ccaggtaaat aaaaaaacac atcgccgccg tcgtcatcgt cgccgccatc 2040

tccggtgata gagaaccatg tcgataaaga aggcacgatg ggtcacccgt gccttcaggc 2100

cggcacggca cggctcgact cgcctcgggc cgtgcctagc ccgtgtcggg cggcccttat 2160

ggccatctat accggtgagt gctaacagtt agttttttgc aaattgtaga cgatcttgat 2220

caatgggaga ggacagttcg agtgcacgct ggggccagcg aggaagagct ttgagaagct 2280

cctcaacgag aacgtggaga cctgcgtcga cgaccagaag atgtgcagcg accaggagaa 2340

gtgcctgagg aggagcgagt gcgggccgta ctgccccagg agccagtgcg cccctgtcgt 2400

gttcaatgtc gagcagggga agacttaccg ccttaggatc gccagcacca cctccctttc 2460

tctcctcaac gtcaagattc aaggggtaag ataattcaat gttttttatg gattgtattt 2520

tttagattgt acgaaagacg cacgtatact atcatgatgt ataataaggg agcataaatg 2580

taagtatact gatttaatca cgctcgaaaa tatatgaatg agtgtcggtc atcatcttca 2640

acagtagctt gatgtgactt gttgtaacaa tttcaatgaa attgaagaaa ttttgcaaat 2700

ggtaaaattt tggcagcaca agatgacggt ggtggaggcc gacgggaacc acgtggagcc 2760

gttcgtggtc gacgacatcg acatctactc cggcgagagc tactccgtcc tcctcaaggc 2820

cgaccagaag ccggcgagct actggatctc cgtcggcgtc agggggcgcc accccaagac 2880

ggtgccggcg ctcgccatcc tcagctacgg caacggcaac gcggcgccgc cgccgctcca 2940

gctgcccgcc ggcgagcccc ccgtgacgcc ggcgtggaac gacacacagc gcagcaaggc 3000

cttcacctac agcatcaggg cgcgcaagga caccaaccgg ccgccgccgg cggccgccga 3060

ccggcagatc gtcctgctca acacgcagaa cctcatggac gggcgctaca ggtggtccat 3120

caacaacgtg tccctgacgc tgccggcgac gccgtacctg ggcgccttcc accacggcct 3180

ccaggacagc gcgttcgacg cgtccggcga gccgccggcg gcgttcccgg aggactacga 3240

cgtgatgagg ccgccggcga acaacgcgac gacggcgagc gacagggtgt tccggctgcg 3300

acacggcggc gtggtggacg tggtgctcca gaacgccaac atgctgaggg aggaggtgag 3360

cgagacgcac ccgtggcacc tccacggcca cgacttctgg gtgctcggct acggcgacgg 3420

ccggtacgac ccggcggcgc acgcggcggg gctcaacgcc gccgacccgc cgctgcggaa 3480

cacggcggtg gtcttcccgc acgggtggac ggcgcttcgg ttcgtcgcca acaacaccgg 3540

cgcgtgggcg ttccactgcc acatcgagcc gcacctccac atgggcatgg gcgtcgtctt 3600

cgtcgagggg gaggacagga tgcacgagct cgacgtgccc aaggacgcca tggcgtgcgg 3660

cctcgtcgcc aggacggccg ccacgccgct caccccggca acgccgctgc ctccgtcgcc 3720

ggcgccggcg ccatgagctc ctcctcagca tgcccattcc agttaaatgc catttttgcc 3780

gtaacattgt gattggccac tgcgaaataa gatcactcac tgatgaagag tggtttagat 3840

tgtttggtca tatgcatgct caataatctc atgtaactaa gaaataatgt ccatgtttgc 3900

taattaagat gattgtgtaa tattgttgca atgtacacca aaaatattgc acggtgttgc 3960

tggcaaagag tggacaccca gcacaagcaa atctccagct agtggatagc aaaccatgat 4020

aaagtacgta tgttcgaatg tgatatgcct caaatctcca gaaaaagaaa tatgtgaagc 4080

cgtaagataa agagacatgg aatattacaa gaagcactca aacatcttca gagttacaaa 4140

attcatgtca cgctacaggg agtatcaaga actctcttga acatcaggca attcttacct 4200

cctaccagac tacatgttct accaaaaacc atccaatccg gtcgcacatc ccacttccat 4260

ttatatatgt taattgggag acaccattgt atcacatttg tagcagatga tgtttcgagc 4320

tgtctcatca gtcgatcttc acagaagcat atatcttcct cacgaaccag aagcaagcat 4380

agaagccaat ggtaccagtc agcacgaaga aagcatacga gatgatcagc atgtaaccaa 4440

agtagagaat gcctgaaaca agcttcgtga tctccagctt gttgaagaag tagaagatgg 4500

cataagcaaa aagatacagt gctgaagagc cagcagtcag gtatgctctc caccaccagt 4560

gatagtcctc gctgcatagt tggaagtagc agagcacaat tgtgatctca gcacaagtaa 4620

cgatgaggat gatgaagact atgaagagga agccgaagat gtagtagaac tggttcagcc 4680

agattgatgt cagaatgaag aagagctcga tgaagacagc gccaaatggc aatatgccac 4740

cagcaagtat tgagaaagct ggctgcaggt accatgcctg ctcaggaatt tgcctgggaa 4800

tcttgtttgt cttcactggg tcctcaatgg ctggctgctt gaagcccaag aaacttccaa 4860

caaagactag cggcacagag atgccaaacc aaaggaggaa cagagcaaac attgttccaa 4920

agggaactgc acctgatgat ttctcacccc agatcagggc atttaggaag aaaaagagtg 4980

caaagattat accaggaaac ataaaggcag tcttgagggt gattttcttc cattcagtgc 5040

ctttgaacat cttatatagg cgagatgagg tgtatcctgc caatacaccc atgaacaccc 5100

acagaaggac catagcagtc attagtccac cacggtttgc aggggacaag aatccaagta 5160

gcgcaaacat catggttacc agtgtcattc caaagaactg cacaccagtt ccaacataaa 5220

cacaaaggag gcctgagtgg acaggtggcc tgaagacatc accatgcact aacttccagc 5280

cagtttcttc ctgggcctca tcctggttgt caagctgatt atagtttgca atatccttgt 5340

aaagagttct catcatgatc atggctacca tgccagaaag gaaaaggaca atcatcagtg 5400

agttaatgat tgagaaccaa tggatctggc tatcacttga aagaagatag acatcccaac 5460

gagatgccca ta 5472

<210> 2

<211> 633

<212> PRT

<213> Oryza sativa L

<220>

<223> 抗坏血酸氧化酶RIP5

<400> 2

Met Ala Ala Ala Val Gln Leu Leu Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Met

1 5 10 15

Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Val Glu

20 25 30

Val Thr Trp Asp Val Glu Tyr Val Leu Trp Ala Pro Asp Cys Gln Gln

35 40 45

Arg Val Met Ile Gly Ile Asn Gly Arg Phe Pro Gly Pro Asn Ile Thr

50 55 60

Ala Arg Ala Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Met Asn Asn Lys Met His

65 70 75 80

Thr Glu Gly Val Val Ile His Trp His Gly Ile Arg Gln Phe Gly Thr

85 90 95

Pro Trp Ala Asp Gly Thr Ala Ser Ile Ser Gln Cys Ala Val Asn Pro

100 105 110

Gly Glu Thr Phe Val Tyr Lys Phe Val Ala Asp Lys Pro Gly Thr Tyr

115 120 125

Phe Tyr His Gly His Phe Gly Met Gln Arg Ala Ala Gly Leu Tyr Gly

130 135 140

Ser Leu Ile Val Leu Asp Ser Pro Glu Gln Pro Glu Pro Phe Arg His

145 150 155 160

Gln Tyr Asp Asp Gly Gly Glu Leu Pro Met Met Leu Leu Ser Asp Trp

165 170 175

Trp His Gln Asn Val Tyr Ala Gln Ala Ala Gly Leu Asp Gly Lys Asp

180 185 190

Arg His Phe Glu Trp Ile Gly Glu Pro Gln Thr Ile Leu Ile Asn Gly

195 200 205

Arg Gly Gln Phe Glu Cys Thr Leu Gly Pro Ala Arg Lys Ser Phe Glu

210 215 220

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Val Glu Thr Cys Val Asp Asp Gln Lys Met

225 230 235 240

Cys Ser Asp Gln Glu Lys Cys Leu Arg Arg Ser Glu Cys Gly Pro Tyr

245 250 255

Cys Pro Arg Ser Gln Cys Ala Pro Val Val Phe Asn Val Glu Gln Gly

260 265 270

Lys Thr Tyr Arg Leu Arg Ile Ala Ser Thr Thr Ser Leu Ser Leu Leu

275 280 285

Asn Val Lys Ile Gln Gly His Lys Met Thr Val Val Glu Ala Asp Gly

290 295 300

Asn His Val Glu Pro Phe Val Val Asp Asp Ile Asp Ile Tyr Ser Gly

305 310 315 320

Glu Ser Tyr Ser Val Leu Leu Lys Ala Asp Gln Lys Pro Ala Ser Tyr

325 330 335

Trp Ile Ser Val Gly Val Arg Gly Arg His Pro Lys Thr Val Pro Ala

340 345 350

Leu Ala Ile Leu Ser Tyr Gly Asn Gly Asn Ala Ala Pro Pro Pro Leu

355 360 365

Gln Leu Pro Ala Gly Glu Pro Pro Val Thr Pro Ala Trp Asn Asp Thr

370 375 380

Gln Arg Ser Lys Ala Phe Thr Tyr Ser Ile Arg Ala Arg Lys Asp Thr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asp Arg Gln Ile Val Leu Leu Asn

405 410 415

Thr Gln Asn Leu Met Asp Gly Arg Tyr Arg Trp Ser Ile Asn Asn Val

420 425 430

Ser Leu Thr Leu Pro Ala Thr Pro Tyr Leu Gly Ala Phe His His Gly

435 440 445

Leu Gln Asp Ser Ala Phe Asp Ala Ser Gly Glu Pro Pro Ala Ala Phe

450 455 460

Pro Glu Asp Tyr Asp Val Met Arg Pro Pro Ala Asn Asn Ala Thr Thr

465 470 475 480

Ala Ser Asp Arg Val Phe Arg Leu Arg His Gly Gly Val Val Asp Val

485 490 495

Val Leu Gln Asn Ala Asn Met Leu Arg Glu Glu Val Ser Glu Thr His

500 505 510

Pro Trp His Leu His Gly His Asp Phe Trp Val Leu Gly Tyr Gly Asp

515 520 525

Gly Arg Tyr Asp Pro Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Asn Ala Ala Asp

530 535 540

Pro Pro Leu Arg Asn Thr Ala Val Val Phe Pro His Gly Trp Thr Ala

545 550 555 560

Leu Arg Phe Val Ala Asn Asn Thr Gly Ala Trp Ala Phe His Cys His

565 570 575

Ile Glu Pro His Leu His Met Gly Met Gly Val Val Phe Val Glu Gly

580 585 590

Glu Asp Arg Met His Glu Leu Asp Val Pro Lys Asp Ala Met Ala Cys

595 600 605

Gly Leu Val Ala Arg Thr Ala Ala Thr Pro Leu Thr Pro Ala Thr Pro

610 615 620

Leu Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro

625 630

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> gRNA序列

<400> 3

ggataaacgg caggttcccg ggg 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物HPT-F

<400> 4

cgagagcctg acctattgca t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物HPT-R

<400> 5

ctgctccata caagccaacc ac 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物 RIP5-F

<400> 6

agctcacttc caagagcct 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物RIP5-R

<400> 7

attcgttgca ctaggatgtg 20

<210> 8

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗坏血酸氧化酶RIP5蛋白突变体

<400> 8

Met Ala Ala Ala Val Gln Leu Leu Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Met

1 5 10 15

Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Val Glu

20 25 30

Val Thr Trp Asp Val Glu Tyr Val Leu Trp Ala Pro Asp Cys Gln Gln

35 40 45

Arg Val Met Ile Gly Ile Asn Gly Arg Phe Arg Gly Pro Thr Ser Pro

50 55 60

Arg Ala Pro Ala Thr

65

Claims

1.抗坏血酸氧化酶RIP5在调控水稻抗旱性中的应用。

2.抗坏血酸氧化酶RIP5在培育抗旱水稻中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：为通过抑制水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性，提高水稻的抗旱性。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抑制RIP5蛋白的表达量和/或活性通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP5基因的174位缺失一个碱基C，进而抑制RIP5蛋白的表达量和/或活性；

所述的抗坏血酸氧化酶RIP5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种抗坏血酸氧化酶RIP5蛋白突变体，其特征在于，为如下任一序列：

a、如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

6.一种抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体，其特征在于：为抗坏血酸氧化酶RIP5基因的174位缺失一个碱基C。

7.含有权利要求6所述的抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体的表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

8.权利要求5所述的抗坏血酸氧化酶RIP5蛋白突变体和/或权利要求6所述的抗坏血酸氧化酶RIP5基因突变体在提高水稻抗旱性中的应用。

9.一种用于编辑水稻抗坏血酸氧化酶RIP5基因的gRNA靶序列在调控水稻抗旱性中的应用，其特征在于：所述的gRNA靶序列为水稻抗坏血酸酶基因RIP5的CDS正义链的第158～180位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

10.一种调控水稻抗旱性或培育抗旱性水稻的方法，其特征在于：为通过调控水稻中RIP5蛋白的表达量和/或活性实现；

所述的调控为通过抑制水稻中RIP5蛋白的表达量，或降低水稻中RIP5蛋白的活性，或将水稻中RIP5蛋白失活，以提高水稻的抗旱能力；

所述的抑制水稻中RIP5蛋白的表达量或降低水稻中RIP5蛋白的活性为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP5基因的174位缺失一个碱基C，以抑制水稻中RIP5蛋白的表达量或降低水稻中RIP5蛋白的活性。