CN108251435B - 野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4及其应用 - Google Patents

Abstract

提供一种野生毛葡萄商‑24抗病基因VqJAZ4及其应用，首次构建了pCAMBIA2300‑35S‑VqJAZ4过量表达载体，并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥，研究了野生毛葡萄商‑24抗病基因VqJAZ4的转基因拟南芥株系和野生对照在接种白粉病和灰霉菌后各种株系的抗病反应；本发明的野生毛葡萄商‑24抗病基因VqJAZ4能明显提高拟南芥对白粉病的抗性，增加对灰霉菌的感病性。

Description

野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4及其应用

技术领域

本发明属植物抗病基因鉴定及基因工程技术领域，具体涉及一种野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4及其应用。

背景技术

植物中存在大量的转录因子，转录因子的数量和种类繁多，表明了植物转录调控的特殊性和复杂性。自植物中最早的玉米转录因子被报道后发现，转录因子不仅能参与调控植物细胞和组织的形成，还是植物形态建成的关键调节因子，也能参与调节植物次生代谢产物的合成和分解，影响次生代谢产物的合成、分解及时空分布，同时还能响应与植物抗病抗逆的多种调控途径，可调控植物体感受干旱、高盐、低温和病原菌等信号相关基因的表达，在植物抗性反应中发挥重要作用。JAZ(JASMONATE ZIM-DOMAIN)转录因子家族是TIFY转录因子家族的一个亚家族，被认为是一种植物所特有的转录因子。JAZ蛋白包含一个TIFY家族特有的36个氨基酸的TIFY保守结构域，在其C端还有一个27个氨基酸的Jas保守结构域。植物受到外界刺激后，主要通过其体内的小分子信号物质茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水杨酸(salicylic acis，SA)和乙烯(ethylene，ETH)来逐级传递相关信号，然后发生相应的生理生化及分子反应来形成抗性。其中，茉莉酸类物质(jasmonates)主要包括茉莉酸及其活性衍生物茉莉酸甲酯等，在植物对抗各种生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥着重要作用。JAZ转录因子在茉莉酸信号转导途径中发挥着至关重要的作用。当植物正常生长时，细胞内只有少量有活性的JA，而JAZ蛋白与MYC2/MYC3等转录因子直接结合，致使其失去正向调控的转录活性，或通过TOPLESS(TPL)抑制子和NINJA连接子间接结合，从而抑制了下游JA响应基因的表达；当植物受到外界生物或非生物刺激后，细胞内JA含量增加，促使JAZ蛋白被SCF^COI1复合体介导的泛素/26S蛋白酶体途径降解，从而使MYC2/MYC3等转录因子恢复活性，或释放TPL和NINJA解除间接抑制作用，激活下游响应基因的表达，对所受刺激产生相应生理生化反应。

拟南芥JAZ基因家族中有13个成员，水稻则有15个成员。拟南芥JAZ基因，JAI3对MYC2转录因子起负调控作用，拟南芥JAI3突变体研究发现，SCF^COI1型E3泛素连接酶可以直接作用于JAI3，使其发生降解，而JA处理会加速这种降解的发生，MYC2反过来可以通过反馈调节与JAI3互作。MYC2转录因子已经明确确定为直接受JAZ抑制的基因，并在JA途径中起关键的正调控作用。此外，过量表达JAS1基因可以降低拟南芥对茉莉酸甲酯(MeJA)和机械损伤的敏感性；相反，利用RNAi技术对JAS1基因进行干扰会增加拟南芥对MeJA的敏感性。近年来，许多关于植物JAZ基因的表达分析证明，JAZ基因在植物响应激素(JA和ABA)处理、干旱、低温、高盐、虫害、机械损伤、病菌侵染等逆境胁迫过程中起重要作用。

植物先天免疫系统由两个主要的免疫反应组成，即病原相关分子模式激发的免疫反应(PTI)和效应蛋白激发的免疫反应(ETI)。在免疫反应诱导后期，植物体内的多种信号途径被激活形成复杂的调控网络。研究发现，SA和JA/Eth两种信号途径是主要的防御响应。SA信号途径激活下游NPR1基因的表达，主要介导植物对活体寄生真菌的抗性，例如白粉菌等；JA/Eth信号途径主要通过JAZ基因的调控参与植物对腐生菌的抗性，例如灰霉菌等。目前对于JAZ基因功能的研究有很多，尤其以研究模式植物拟南芥和水稻JAZ基因最多，但是有关葡萄JAZ基因的研究还比较少。我国拥有丰富的野生葡萄资源，其中商-24(S-24)表现出较强的抗病性，利用这些葡萄资源进行葡萄抗病研究和杂交培育优良品种具有重要的意义。课题组前期从葡萄抗黑痘病转录组结果和两个抗病相关SSH文库中都筛选到了编码JAZ蛋白的基因，并从葡萄基因组中鉴定出11个JAZ基因，按照它们在染色体上的位置将其命名为VvJAZ1-VvJAZ11，在生物信息学初步分析JAZ基因的基础上，本研究首次从野生毛葡萄(Vitis.quinquangularis)商-24中克隆到JAZ4基因，利用模式植物拟南芥进行VqJAZ4基因超表达的功能分析，在转基因拟南芥株系中验证该基因的抗病功能，并分析其可能的作用机理，为葡萄抗病育种奠定理论基础。

发明内容

本发明解决的技术问题：提供一种野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4，并证明了该基因在抗病方面的功能。

本发明采用的技术方案：一种野生毛葡萄商-24抗逆基因VqJAZ4，其编码区序列具体如下：

还提供野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4的应用，用于提高植株的抗活体寄生真菌白粉菌能力的应用以及对于通过调控过敏反应来响应其他病原菌的应用。

本发明与现有技术相比的优点：

1、本发明首次构建了pCAMBIA2300-35S-VqJAZ4过量表达载体，并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。研究了野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4的转基因拟南芥株系和野生对照在接种白粉病和灰霉菌后各种株系的抗病反应；

2、本发明的野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4能明显提高拟南芥对白粉病的抗性，增加对灰霉菌的感病性；

3、本发明研究结果表明，转基因株系中的死细胞和活性氧的积累水平明显高于野生对照Col-0，表明植物体内的免疫反应受到激活，抑制病原菌的入侵。白粉病菌诱导后，转基因株系中的SA信号途径相关基因(AtICS1、AtPR1和AtNPR1)和JA/Eth信号途径相关基因(AtCOI1、VSP2和AtPDF1.2)表达水平增加，而AtMYC2、ORA47和ANAC55转录因子的表达水平下降，这表明野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4超表达拟南芥后通过参与调控信号途径相关基因的表达，增强了植物免疫反应，提高了植株的抗白粉病的能力。另外，灰霉病活体接种诱导后，转基因株系的JA/Eth信号途径中相关基因(VSP2、AtPDF1.2和AtLOX3)表达水平下降，AtMYC2基因的表达水平下降，而AtWRKY57和ORA59基因的表达水平升高，这表明VqJAZ4过量表达后通过参与调控JA/Eth信号途径相关基因的表达，降低了对灰霉病的抗性。

附图说明

图1是VqJAZ4启动子在葡萄叶片中的瞬时表达分析；A图为pVqJAZ4基因启动子的瞬时表达载体的构建；B图为pVqJAZ4:GUS瞬时载体和PC0380:GUS空载体转化葡萄叶片后与未转化的葡萄叶片的染色观察；C图为VqJAZ4基因启动子序列不同缺失程度的片段进行瞬时载体的构建；D图为VqJAZ4基因启动子pVqJAZ4、D1和D2的瞬时转化葡萄叶片和转化后接种白粉病72小时的GUS染色的表现型；E图为显微镜观察VqJAZ4基因启动子pVqJAZ4、D1和D2瞬时转化葡萄叶片接种白粉病后72小时的菌丝生长情况。

图2是VqJAZ4转基因株系(L1、L2和L3)和对照材料哥伦比亚野生型Col-0的盆栽苗接种白粉菌的反应。A图为各株系接种白粉病菌7天后的形态学照片；B图为各株系接种白粉病菌7天后的孢子数统计分析，**表示与野生对照相比有极显著差异(**P<0.01，单因素ANOVA)；C图为台盼兰、NBT和苯胺蓝分别染色感病叶片观察白粉菌接种诱导的死细胞、O^2-和胼胝质的积累水平，图上标尺代表100μm。

图3是白粉菌处理VqJAZ4转基因株系(L1、L2和L3)和对照材料哥伦比亚野生型Col-0后的抗病相关基因表达情况。内参基因为Actin1。

图4是VqJAZ4转基因株系(L1、L2和L3)和对照材料哥伦比亚野生型Col-0的盆栽苗接种灰霉病的反应。A图为各株系接种灰霉病7天后的形态学照片；B图为各株系接种灰霉病7天后的叶片病斑面积的统计分析；C图为台盼兰、NBT和DAB分别染色感病叶片观察白粉菌接种诱导的死细胞、O^2-和H₂O₂的积累水平，图上标尺代表100μm。

图5是白粉菌处理VqJAZ4转基因株系(L1、L2和L3)和对照材料哥伦比亚野生型Col-0后的抗病相关基因的表达情况，内参基因为Actin1。

具体实施方式

发明人利用同源克隆技术，根据欧洲葡萄黑比诺基因组序列采用反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，以野生毛葡萄商-24叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，首次扩增了野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4，该基因完整开放阅读框序列全长861bp，编码286个氨基酸。

为了一步研究野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4在植物抵御生物胁迫的具体功能，发明人构建了pCAMBIA2300-35S-VqJAZ4过量表达载体，利用花絮侵染法超表达入拟南芥。发现VqJAZ4转基因株系能明显提高拟南芥对白粉病的抗性，增加对灰霉菌的感病性。

在研究中，发明人对转基因植株和野生对照进行了两种不同类型病原菌的胁迫处理，并测定了死细胞与活性氧的积累，胼胝质的积累和抗病相关基因的表达情况，结果表明VqJAZ4基因参与调控SA和JA/Eth信号途径，在病原菌诱导引起植物细胞死亡过程中起重要防御作用。

以下是野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4的编码区序列以及抗生物胁迫功能实验验证的具体步骤。

A、在课题组前期研究分析中，葡萄JAZ家族基因在病原菌处理及激素处理后的表达分析的基础上，利用同源克隆技术，以野生毛葡萄商-24叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增得到了野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4序列，该野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4的编码区序列如下：

B、将野生毛葡萄商-24抗逆基因VqJAZ4序列的完整开放阅读框插入CaMV35S启动子下游，构建了植株过量表达载体并将其通过农杆菌介导的花絮浸染法将其导入野生型拟南芥哥伦比亚Col-0。筛选获得了表现型良好的T3代VqJAZ4转基因株系。

C、参见图2-5，发明人鉴定了VqJAZ4转基因株系(L1、L2和L3)能显著提高拟南芥对白粉病的抗性，增加对灰霉菌的感病性。此外，在病原菌接种后，转基因株系中的死细胞和活性氧的积累水平明显高于野生对照，表明植物体内的免疫反应受到激活，抑制病原菌的入侵。以上结果都表明野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4在植物抗病信号途径中起重要作用。

以下是发明人给出的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

实施例1：VqJAZ4启动子瞬时转化葡萄叶片后对白粉病的响应

前期的研究中我们发现VqJAZ4受葡萄白粉菌诱导表达，为了进一步验证这个结果，我们将VqJAZ4基因的启动子区域克隆出来融合到GUS报告基因前面，构建形成不同缺失程度的多个瞬时表达结构载体(图1)，通过真空泵瞬时转化入葡萄幼嫩叶片，分析不同长度序列的启动子片段的不同活性，并分析瞬时转化的葡萄叶片在受到白粉病菌接种后的活性变化。图中明显看出未接种病原菌时，GUS染色的活性由强到弱依次是pVqJAZ4、D1和D2，接种葡萄白粉病病原菌后，GUS染色的活性均普遍增强，尤其是pVqJAZ4载体的活性受到强烈诱导，之后GUS活性依次为D1和D2。VqJAZ4基因启动子pVqJAZ4、D1和D2瞬时转化葡萄叶片接种白粉病后72小时后。在对照葡萄WT叶片上，可看到大量菌丝和萌发的孢子，pVqJAZ4瞬时表达载体活性增强后，观察到叶片上存在未萌发的孢子和少量菌丝，D1和D2瞬时表达载体活性也出现增强现象，观察到叶片上存在刚刚萌发的孢子和适量繁殖产生的菌丝，这表明VqJAZ4启动子具有一定的活性，1465bp的启动子片段能参与响应葡萄白粉病的侵染，而且505bp的启动子片段可能是最小片段参与响应葡萄白粉病。

实施例2：野生毛葡萄商-24抗病基因T3代VqJAZ4转基因拟南芥对白粉病的响应

为了验证VqJAZ4在植物防御中的作用，将3个T3代转基因株系(L1、L2和L3)和拟南芥拟南芥哥伦比亚Col-0分别接种拟南芥白粉病，观察其对病原菌的响应。发明人将生长4周的成年苗接种白粉菌，观察拟南芥株系死细胞、活性氧和胼胝质的积累水平，并统计了白粉菌分生孢子数量，定量分析了抗病相关基因的相对表达情况。结果表明三个转基因株系在白粉菌接种后发病状况较野生对照(Col-0)要轻(图2)。三个转基因株系出现强烈的白粉菌诱导的细胞死亡，活性氧水平也明显升高，接种白粉病后的叶片中胼胝质的积累水平也显著增加。

发明人通过实时定量PCR检测了不同信号途径中的抗病相关基因在野生对照(Col-0)及转基因株系中的表达量(图3)。AtICS1基因参与SA的生物合成，病原菌处理后24小时该基因表达量升高，120小时达到峰值。AtPR1也参与SA相关的信号途径，在SA生物合成的上游起重要作用。AtPR1基因在处理后24-120小时表达也逐渐升高。AtNPR1基因作为SA途径下游重要的基因，与AtPR1基因共同表现SA信号途径的效应结果，病原菌处理后72小时该基因表达量显著升高，120小时达到峰值。此外，AtCOI1基因参与抑制JA的生物合成，转基因株系中的表达水平较对照高，在白粉病诱导后24小时达到峰值。VSP2基因作为JA途径中的中期标志基因，VSP2基因表达水平与AtCOI1相似，也在白粉病接种后24小时达到峰值。AtPDF1.2基因作为JA途径中的后期标志基因，AtPDF1.2基因在处理后24-120小时表达也逐渐升高，在120h达到峰值。AtLOX3基因是JA生物合成的关键基因，AtLOX3基因在受到白粉病菌诱导后的表达了逐渐降低，在24h达到最低值。发明人又检测相关转录因子的表达水平分析，其中AtMYC2基因是被确认为受JAZ抑制的正向调节基因。ORA47基因参与促进JA的合成，直接作用于AtLOX3，且AtMYC2基因直接调控ORA47基因。ANAC55参与JA途径，主要通过抑制AtICS1基因和激活BSMT1基因达到抑制SA的生物合成。基因表达分析发现AtMYC2、ORA47和ANAC55转录因子的表达水平均表现显著下降。

以上实验说明VqJAZ4在SA和JA/Eth共同介导的信号网络途径中起重要作用。这些结果都表明野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4在拟南芥中的过量表达能明显提高了拟南芥对于白粉菌的抗性。

实施例3：野生毛葡萄商-24抗病基因T3代VqJAZ4转基因拟南芥对灰霉菌的响应

为了验证VqJAZ4在植物防御中的作用，将3个T3代转基因株系(L1、L2和L3)和拟南芥拟南芥哥伦比亚Col-0分别接种拟南芥灰霉病，观察其对病原菌的响应。发明人将生长4周的成年苗活体接种灰霉病菌，观察拟南芥株系死细胞和活性氧的积累水平，并统计了灰霉病接种后诱发的病斑面积，定量分析了抗病相关基因的相对表达情况。结果表明三个转基因株系在灰霉病接种后发病状况较野生对照(Col-0)要重(图4)。三个转基因株系出现强烈的灰霉病诱导的细胞死亡，活性氧和超氧阴离子的水平也明显升高。

发明人通过实时定量PCR检测了不同信号途径中的抗病相关基因在野生对照(Col-0)及转基因株系中的表达量(图5)。结果表明灰霉病诱导后的转基因株系只参与调控JA/Eth途径，不参与SA途径的调控。其中VSP2基因的表达量在灰霉病诱导72-120小时后逐渐下降，AtPDF1.2在接种24-120小时后逐渐下降，并在120小时达到最低。AtLOX3基因在接种24-120小时后逐渐下降，也在120小时达到最低。此外，相关转录因子的表达水平分析发现，AtMYC2基因的表达水平在灰霉病诱导24小时逐渐下降。AtWRKY57基因参与负向调控灰霉病，转基因株系中AtWRKY57的表达量逐渐增加，在120小时达到峰值。ORA59基因正调控灰霉病，与ERF1基因共同促进AtPDF1.2的表达。转基因株系中ORA59的表达量逐渐增加，在120小时达到峰值。

以上结果表明野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4在拟南芥中的过量表达明显提高了成年植株对灰霉菌的感病性。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述内容所做的等效变化，均应包括在本发明权利要求范围之内。

Claims (2)

1.一种野生毛葡萄抗病基因VqJAZ4，其特征在于：该基因的编码区序列为序列1所示。

2.如权利要求1所述的野生毛葡萄抗病基因VqJAZ4的应用，其特征在于：用于提高植株的抗活体寄生真菌白粉菌能力的应用。

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