CN113651877B - 野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了野生毛葡萄商‑24抗病基因VqWRKY31及其应用，该基因完整开放阅读框序列全长1608bp，编码536个氨基酸。构建了pCAMBIA2300‑35s‑VqWRKY31‑3×Flag过量表达载体，并通过农杆菌介导的葡萄遗传转化法将其稳定转入汤姆森无核白葡萄中。结果发现过表达VqWRKY31的转基因植株高于野生型葡萄的白粉病抗性，通过代谢组和转录组联合分析发现该基因主要通过调控芪类化合物和类黄酮生物合成关键基因的表达，促进葡萄中飞燕草素‑3‑O‑葡萄糖苷、二氢白藜芦醇、橙皮素、肉桂酸、圣草酚、白藜芦醇、蛇葡萄素F、ε‑葡萄素等物质的合成，进而行使提高葡萄对白粉病抗性的生物学功能。
Description
技术领域
本发明属于植物抗白粉病相关基因鉴定及基因工程技术领域，具体涉及一种野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31及其应用。
背景技术
葡萄是世界第二大经济果树。然而，葡萄的生长发育常常遭受到各种疾病的危害。其中，葡萄白粉病是损害葡萄产量及其经济价值的主要因素之一。在生产中，经常采用各种化学防治的方法来控制白粉菌大面积发病，但这样不仅会增加栽培成本，更会污染环境，危害食品安全，因此这些方法都是不可持续发展的。我国拥有许多宝贵的野生葡萄种质资源，其中，中国野生毛葡萄‘商-24’对白粉病有较高的抗性。因此发掘并鉴定抗病葡萄品种中抗白粉病相关基因，研究其调控机制并将其应用到分子育种中，可以为培育抗病性强、品质优良的葡萄品种具有重要的理论意义。
迄今为止，在葡萄中已经鉴定到一些抗白粉病相关结构基因，包括RUN1、RUN2、REN1、REN2、REN3、REN4、REN5、REN6和REN71。另外葡萄白粉病可以诱导许多转录因子家族基因，例如WRKY、ERF和MYB等，它们中的一些基因在模式植物拟南芥中异源过表达可以显著增强植物对白粉病的抗性。然而，在同源系统葡萄中研究这些抗白粉病转录因子调控机理的研究还很少。
植物长期暴露于多种生物胁迫中，例如病原体；在这一过程中，它们逐渐进化出独特的免疫能力，且植物免疫是一个非常复杂的过程，包括复杂的信号传导及次生代谢物的合成与代谢。例如，水杨酸(SA)作为一种内源性激素，通过激活SA免疫信号通路在植物抗病过程中发挥重要的作用。SA信号可以激活病程相关蛋白(PR)的表达，并有助于产生过敏反应。过敏反应是局部程序性细胞死亡，病原体从活体组织中获取营养，而过敏反应会在试图感染的部位形成坏死点，这被认为是限制生物营养病原体传播的关键事件。SA防御信号通路通常伴随着活性氧(ROS)的快速产生，即氧化爆发。
次生代谢物也是植物抗病的重要因素。例如，芪类物质，其受病原体诱导，参与植物抗病性。芪类物质的前体白藜芦醇的合成依赖于芪合成酶(STS)，在葡萄或其他植物中过量表达STS相关基因可以促进芪类物质的积累并提高植物的抗病性。白藜芦醇可以代谢形成各种芪类抗毒素，可以抑制病原体的发展，并有助于产生过敏反应。黄酮衍生物合成是植物中广泛存在的另一种次级代谢合成途径，其合成依赖于查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、类黄酮-3',5'-羟化酶(F3'5'H)、黄烷酮-3-双加氧酶(FHT)、黄酮醇合酶(FLS)和二氢黄烷醇-4-还原酶(DFR)等多种催化酶。几种黄酮类化合物可以抑制微生物生长，例如柚皮素、山奈酚、槲皮素和儿茶素的衍生物。原花青素是类黄酮生物合成的终产物，通常称为单宁，广泛参与植物抗病性，并与SA信号传导相关。这些抗病相关代谢物的合成受到相关转录因子的调控，然而调控这些代谢物以增强葡萄抗白粉病的机制尚不清楚。WRKY转录因子广泛参与了植物众多的生物学过程，例如生物胁迫与非生物胁迫、激素信号、次生代谢和植物生长发育等。WRKY转录因子在植物对病原菌反应过程中起着重要的作用，然而关于葡萄WRKY基因的抗病功能研究还很少。
发明内容
本发明的目的是提供野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31，并证明了该基因在提高葡萄抗白粉病能力的生物学功能。
本发明的另一目的是提供野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31在提高葡萄抗白粉病能力中的应用。
本发明所采用的技术方案是，野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31，该基因的编码区序列是：
1 ATGGACAAAGGATGGGGTCTCACCCTTGATTCTATTGCCATCAATTCGTTTCTCAACAAG
61 CGCAGCCGTGGGATTCTGGAGTCTGGCCCCATGTTGGACATGCCGGTGGGTGATGAGAGG
121 CGGGAGGTGGATTTCTTCGCCGAGAAGACTAGGAGCGTCAGTGTGAAGAAGGAGAATTCT
181 CATGTGGATGAAGCTGCGATCACTGATTTGGATGTCAATACTGGGTTGAATCTTCTGACT
241 GCTAACGCGGGAAGTGATCAGTCGACGGTGGAGGATGAGAATCCGGATAGGGAGAATAAG
301 AGAGCCAAGATTGAGGTGGCGCAATTGCAAGTGGAGCTTGAACGTATGAATGCCGAGAAC
361 CAAAAGCTGCGAGGGATGCTGAACCAGGTGACCAACAACTACAGCACTCTTCAGATGCAT
421 CTCGTCACACTTATGCAGCAGCAGAGCCAGCAGAACCGTGGAGCCGAAAGCCTCCAAGAA
481 CATGGGTCTGTCGGAGGAAAATCTGATGAGAAGAAACATGAGGTTGCGGGAGCGGTGGTG
541 CCCAGGCAGTTCATCGATCTAGGCCCAACTGCCACAGCTGACACGGATGAGCCATCTCAA
601 TCTTCATCAGAAGAAAGAACCCGGGATCTCTCTGGATCACCCCAGAATCATCAGGAAAAC
661 GGAAAAGGAGCTGGCAGGGAAGAAAGCCCAGAATCTGAAACACAAGGTTGGGTCCAGAAC
721 AAGGCTTCCAAATTGAGTCCTCCCAAGACTATTGATCAGTCCGCAGAGGCCACAATGAGG
781 AAAGCCCGCGTCTCGGTTCGTGCCCGATCAGAGGCTCCCATGATCACTGATGGATGCCAA
841 TGGCGCAAGTATGGGCAGAAAATGGCGAAGGGGAACCCATGCCCGCGAGCCTACTACCGA
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1561 AACTCCAGCAACACCAACAAAATCAGCAGCTTCCCGACGGGGAATTAA
该基因编码的氨基酸序列是：
1 MDKGWGLTLDSIAINSFLNKRSRGILESGPMLDMPVGDERREVDFFAEKTRSVSVKKENS
61 HVDEAAITDLDVNTGLNLLTANAGSDQSTVEDENPDRENKRAKIEVAQLQVELERMNAEN
121 QKLRGMLNQVTNNYSTLQMHLVTLMQQQSQQNRGAESLQEHGSVGGKSDEKKHEVAGAVV
181 PRQFIDLGPTATADTDEPSQSSSEERTRDLSGSPQNHQENGKGAGREESPESETQGWVQN
241 KASKLSPPKTIDQSAEATMRKARVSVRARSEAPMITDGCQWRKYGQKMAKGNPCPRAYYR
301 CTMAVGCPVRKQVQRCAEDRSILITTYEGTHNHPLPPAAMAMASTTSAAANMLLSGSMSS
361 ADGLMNPNFLARTILPCSSNMATISASAPFPTVTLDLTHTPSPLQYQRPTSQFPVPFAAP
421 AQSFPSAQTSSLPQVFSQALYNQSKFSGLQLSQDMESAHQAPPTLHQPQPASLADTVSAA
481 TAAITADPNFTAALAAAITSIIGGGAAHPNTTINSTSNATNSSNTNKISSFPTGN*
本发明的所采用的另一技术方案是野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31在提高葡萄抗白粉病能力中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的中国野生种葡萄商-24VqWRKY31基因能明显提高葡萄对于白粉病的抗病性。本发明的VqWRKY31基因是通过调控VvSTS,VvCHS,VvCHI,VvF3′5′H,VvFHT,VvFLS,VvDFR等芪类化合物和类黄酮生物合成关键基因的表达，来促进葡萄中飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、二氢白藜芦醇、橙皮素、肉桂酸、圣草酚、白藜芦醇、蛇葡萄素F、ε-葡萄素等物质的合成，进而行使提高葡萄对白粉病抗性的生物学功能。
附图说明
图1是VqWRKY31基因的特征；A图是VqWRKY31的进化分析。Gm Glycine max；MdMalus domestica；Vq Vitis quinquangularis；At Aarabidopsis thaliana；Sl Solanumlycopersicum.五角星标注VqWRKY31.B图是VqWRKY31在接种白粉的“商-24”葡萄叶片中的表达量。星号表示过表达和WT之间的统计学显着性(*0.01<P<0.05，**P<0.01，学生t检验)。C图是VqWRKY31和其它相关WRKY基因的序列比对。黑线表示WRKYGQK保守结构域，三角标注锌指结构。五角星标注VqWRKY31。
图2是创制过表达VqWRKY31无核白再生植株的过程。A图是CaMV35S-VqWRKY31-3×Flag载体的示意图。B图是农杆菌介导的无核白葡萄转基因。1-诱导前的无核白花药；2-花药诱导而来的原胚团；3-原胚团和农杆菌的共培养；4-具有卡那霉素抗性的胚状体；5-生长在MS培养基中的转基因葡萄幼苗；6-温室中炼苗的转基因葡萄苗。C图是检测VqWRKY31转基因株系的T-DNA插入。数字表示VqWRKY31过表达株系的标号。D图是qRT-PCR实验显示野生型葡萄和VqWRKY31过表达株系葡萄苗中VqWRKY31基因的表达量。
图3是VqWRKY31过表达株系增强葡萄对白粉病抗病性。A图是VqWRKY31过表达株系和野生型接种白粉14天后的表型。比例尺＝3cm。B图是背光板下过表达和野生型叶片接种白粉3天后的表型。比例尺＝0.2cm。C图是VqWRKY31过表达和野生型葡萄接种白粉5天和14天后台盼蓝染色的结果。比例尺＝100μm。D图是VqWRKY31过表达株系和野生型葡萄叶片接种白粉14天后孢子数。星号表示过表达和WT之间的统计学显着性(*0.01<P<0.05，**P<0.01，学生t检验)。
图4是VqWRKY31过表达株系与野生型转录组结果。A图是韦恩图展示过表达株系与野生型株系在自然状态下和接种白粉24小时后的差异基因数量。WTC自然状态的野生型植株、WTT接病24小时的野生型植株、#32C自然状态的过表达植株、#32T接病24小时的过表达植株。B图是#32C/WTC中富集的上调KEGG通路。
图5是转录组结果中参与芪类化合物合成的差异表达基因的热图分析。用渐变色带展示了基因表达倍数的对数化结果(Base＝2)。
图6是参与类黄酮化合物合成的差异表达基因的qRT-PCR实验结果。分别是查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-双加氧酶(FHT)、黄酮醇合酶(FLS)和二氢黄烷醇-4-还原酶(DFR)。星号表示过表达和WT之间的统计学显着性(*0.01<P<0.05，**P<0.01，学生t检验)。
图7是代谢组结果中VqWRKY31过表达株系相比野生型差异高积累的芪类代谢物及倍数。
图8是代谢组结果中VqWRKY31过表达株系相比野生型差异高积累的类黄酮代谢物及倍数。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明构建了pCAMBIA2300-35s-VqWRKY31-3×Flag过量表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化法将其导入‘无核白’葡萄中。研究了VqWRKY31过量表达的转基因株系和野生对照在接种白粉菌后，其抗白粉病能力的情况。
本发明从抗白粉病的中国野生毛葡萄(Vitis quinquagularis)商-24(Shang-24)中克隆WRKY转录因子IIb亚组基因，VqWRKY31，并通过农杆菌介导的胚状体遗传转化法将其成功转化到‘无核白’(Thompson Seedless)葡萄中。本研究发现，过表达VqWRKY31可显着抑制葡萄接种白粉病后菌丝的发育和繁殖并触发过敏反应。过表达VqWRKY31还激活了SA防御信号并改变了抗病相关代谢物(芪类、黄酮类化合物)的积累。推测该基因在参与葡萄抗白粉病过程中起到非常重要的作用，并进一步探究了VqWRKY31参与葡萄抗病性的调控机理，为增强葡萄抗病性提供分子理论基础及可用的基因资源，为加速选育优质抗病葡萄新品种有重要的理论意义和应用价值。
发明人利用同源克隆技术，根据欧洲葡萄黑比诺(Vitis vinifera)VvWRKY31的CDS序列设计特异性引物，以中国野生种葡萄‘商-24’叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增了VqWRKY31开放阅读框序列，该基因完整开放阅读框序列全长1608bp，编码536个氨基酸。
氨基酸序列分析表明，VqWRKY31包含一个WRKY保守结构域和C2H2锌指结构域，是典型的WRKYIIb亚家族基因。进化树分析结果表明，VqWRKY31与很多属于WRKYIIb亚家族的基因具有较高的同源性。
在表达模式分析试验中，发明人发现在白粉菌处理的‘商-24’叶片中，VqWRKY31的表达收到了显著的诱导。
为了研究中国野生种葡萄基因VqWRKY31在同源系统葡萄中的生物学功能，发明人构建了pCAMBIA2300-35s-VqWRKY31-3×Flag过量表达载体，将其在‘无核白’(ThompsonSeedless)葡萄中过量表达，分析该基因的生物学功能。表型观察发现在接种白粉病3天后，VqWRKY31过表达株系的叶片出现显著的过敏反应。台盼蓝染色显示VqWRKY31过表达株系的白粉繁殖受到了抑制，孢子密度显著低于野生型。接病14天后，VqWRKY31过表达株系的病情远弱于野生型葡萄。
为进一步了解VqWRKY31过表达株系抗白粉病的机理，我们对自然状态和接病24小时的野生型和转基因葡萄叶片进行了转录组测序，结果发现了大量的差异表达基因。KEGG富集分析显示，与野生型葡萄相比，过表达株系有大量上调的途径。一些与植物抗病性和代谢相关的途径在自然状态下和接病24小时后上调，例如苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、植物-病原体相互作用以及芪类生物合成途径。具体来看，VqWRKY31基因提高了VvSTS,VvCHS,VvCHI,VvF3′5′H,VvFHT,VvFLS,VvDFR等芪类化合物和类黄酮生物合成关键基因的表达。这说明VqWRKY31的过表达引起葡萄基因表达的动态变化，诱导一些抗病相关途径和代谢途径基因的表达上升。
为了进一步分析VqWRKY31究竟参与了哪些化合物的积累。我们对自然状态下的野生型和转基因葡萄叶片进行了广靶代谢组学试验。结果显示，共有168种物质在过表达株系中积累显著高于野生型，52种物质的积累显著低于野生型。通过对差异代谢物进行KEGG富集分析，我们发现了两条显著变化的途径：类黄酮生物合成途径和芪类生物合成途径。代谢组实验总共测得17种芪类物质，其中8种物质，如白藜芦醇、蛇葡萄素F、ε-葡萄素和二氢白藜芦醇的积累在过表达株系中较高，没有物质的含量低于野生型。过表达株系中飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、橙皮素、肉桂酸、圣草酚、柚皮素类衍生物、山奈酚类衍生物、槲皮素类衍生物、儿茶素类衍生物等类黄酮及其衍生物质的含量均显著高于野生型。这说明过表达VqWRKY31促进了白藜芦醇和类黄酮物质在葡萄叶片中的积累，并提高了葡萄对于白粉病的抗性。
以下是中国野生种葡萄‘商-24’VqWRKY31的编码区序列以及抗白粉病功能实验验证的具体步骤。
A、在前期研究分析中，对葡萄59个WRKY家族基因进行鉴定的基础上，利用同源克隆技术，以中国野生种葡萄‘商-24’叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增得到了VqWRKY31序列，该基因编码区序列如下：
1 ATGGACAAAGGATGGGGTCTCACCCTTGATTCTATTGCCATCAATTCGTTTCTCAACAAG
61 CGCAGCCGTGGGATTCTGGAGTCTGGCCCCATGTTGGACATGCCGGTGGGTGATGAGAGG
121 CGGGAGGTGGATTTCTTCGCCGAGAAGACTAGGAGCGTCAGTGTGAAGAAGGAGAATTCT
181 CATGTGGATGAAGCTGCGATCACTGATTTGGATGTCAATACTGGGTTGAATCTTCTGACT
241 GCTAACGCGGGAAGTGATCAGTCGACGGTGGAGGATGAGAATCCGGATAGGGAGAATAAG
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901 TGTACCATGGCAGTTGGCTGCCCAGTTCGCAAACAAGTTCAGAGGTGTGCCGAGGACAGG
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1561 AACTCCAGCAACACCAACAAAATCAGCAGCTTCCCGACGGGGAATTAA
该基因编码的氨基酸序列是：
1 MDKGWGLTLDSIAINSFLNKRSRGILESGPMLDMPVGDERREVDFFAEKTRSVSVKKENS
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B、参见图2，发明人将VqWRKY31序列的完整开放阅读框插入CaMV35S启动子下游，构建了过量表达载体并将其通过农杆菌介导的方式转入到葡萄体胚。发明人鉴定得到了‘无核白’葡萄过表达VqWRKY31基因再生植株。
C、参见图3，发明人鉴定了VqWRKY31过表达株系能明显提高葡萄对于白粉病的抗性。接种白粉后，VqWRKY31过表达株系叶片出现显著的过敏反应，大大限制了白粉病原菌的生长和繁殖，降低了葡萄白粉菌的孢子密度。
D、参见图4-8，发明人通过转录组与代谢组联合分析。结果发现，共有168种物质在过表达株系中积累显著高于野生型，52种物质的积累显著低于野生型。其中，白藜芦醇、蛇葡萄素F、ε-葡萄素和二氢白藜芦醇等芪类化合物的积累在过表达株系中较高。过表达株系中飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、橙皮素、肉桂酸、圣草酚、柚皮素类衍生物、山奈酚类衍生物、槲皮素类衍生物、儿茶素类衍生物等类黄酮及其衍生物质的含量均显著高于野生型。进一步分析发现，这些物质的积累上升是由于VqWRKY31基因提高了VvSTS,VvCHS,VvCHI,VvF3′5′H,VvFHT,VvFLS,VvDFR等芪类化合物和类黄酮生物合成关键基因的表达。综合上述结果说明VqWRKY31具有提高无核白葡萄中芪类和类黄酮类代谢物合成的生物学功能，提高了葡萄对白粉病抗性。
以下是发明人给出的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。
实施例1：VqWRKY31的生物信息学分析
氨基酸序列分析表明，VqWRKY31包含一个WRKY保守结构域和C2H2锌指结构域，是典型的WRKYIIb亚家族基因(图1C)。进化树分析结果表明，VqWRKY31与很多属于WRKYIIb亚家族的基因具有较高的同源性(图1A)。
实施例2：VqWRKY31的表达模式分析
为了分析VqWRKY31的表达模式，本研究分析了白粉菌处理下‘商-24’叶片中VqWRKY31的表达，结果显示VqWRKY31的表达受到白粉菌的显著诱导(图1B)。
实施例3：VqWRKY31转基因葡萄株系的获得
为了分析VqWRKY31可能的抗白粉病生物学功能，本研究构建了植物表达载体pCAMBIA2300-35s-VqWRKY31-3×Flag，并通过农杆菌介导的遗传转化法将其导入无核白葡萄中，通过卡那霉素筛选再生葡萄抗性植株，之后通过DNA水平鉴定以及定量PCR表达分析，从中筛选到VqWRKY31表达量最高的3株转基因株系(#32、#33和#36)进行后续试验分析(图2A-D)。
实施例4：过量表达VqWRKY31显著提高葡萄对于白粉病的抗性通过接病后的表型观察发现，白粉处理后的VqWRKY31过表达株系呈现显著的过敏反应(图3B)。台盼蓝染色实验发现，VqWRKY31过表达株系限制了白粉病的繁殖和发展(图3C)。接病14天后，野生型葡萄叶片出现显著的白粉病斑，而VqWRKY31过表达株系叶片的病斑远小于野生型(图3A)。孢子密度分析显示VqWRKY31过表达株系相较于野生型葡萄拥有较低的白粉孢子密度(图3D)。
实施例5：VqWRKY31诱导芪类和类黄酮生物合成关键基因升高表达
为进一步解析VqWRKY31过表达株系抗白粉病的机理，我们对自然状态下和接病24小时的野生型和转基因葡萄叶片进行了转录组测序实验，结果显示，两种葡萄苗间有大量的差异表达基因(图4A)。对差异基因进行KEGG富集分析，结果显示，与野生型葡萄相比，过表达株系有大量上调和下调的KEGG途径。一些与植物抗病性和代谢相关的途径在自然状态下和接病24小时后上调，例如苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、植物-病原体相互作用以及芪类生物合成途径(图4B)。具体来看，VqWRKY31基因提高了VvSTS,VvCHS,VvCHI,VvF3′5′H,VvFHT,VvFLS,VvDFR等芪类化合物和类黄酮生物合成关键基因的表达(图5、图6)。这说明VqWRKY31的过表达引起葡萄基因表达的动态变化，诱导一些参与芪类化合物和类黄酮生物合成的基因表达上升。
实施例6：VqWRKY31提高了葡萄芪类和类黄酮代谢物的含量为了进一步揭示VqWRKY31诱导芪类和类黄酮生物合成关键基因升高表达如何促进了芪类和类黄酮代谢物的积累，我们对自然状态下的转基因葡萄叶片进行了广靶代谢组学实验。结果显示，共有168种物质在过表达株系中积累显著高于野生型，52种物质的积累显著低于野生型。通过对差异代谢物进行KEGG富集分析，我们发现了两条显著变化的途径：类黄酮生物合成途径和芪类生物合成途径。代谢组实验总共测得17种芪类物质，其中8种物质，如白藜芦醇、蛇葡萄素F、ε-葡萄素和二氢白藜芦醇的积累在过表达株系中较高，没有物质的含量低于野生型(图7)。过表达株系中飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、橙皮素、肉桂酸、圣草酚、柚皮素类衍生物、山奈酚类衍生物、槲皮素类衍生物、儿茶素类衍生物等类黄酮及其衍生物质的含量均显著高于野生型(图8)。这说明过表达VqWRKY31促进了白藜芦醇和类黄酮物质在葡萄叶片中的积累，从而提高葡萄对于白粉病的抗病性。
序列表（SEQUENCE LISTING）
<110>西北农林科技大学
<120>野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31及其应用
<160>
<210>1
<211>1095
<212>野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31的编码区序列
<213>
<220>
<400> 1
1 ATGGACAAAGGATGGGGTCTCACCCTTGATTCTATTGCCATCAATTCGTTTCTCAACAAG
61 CGCAGCCGTGGGATTCTGGAGTCTGGCCCCATGTTGGACATGCCGGTGGGTGATGAGAGG
121 CGGGAGGTGGATTTCTTCGCCGAGAAGACTAGGAGCGTCAGTGTGAAGAAGGAGAATTCT
181 CATGTGGATGAAGCTGCGATCACTGATTTGGATGTCAATACTGGGTTGAATCTTCTGACT
241 GCTAACGCGGGAAGTGATCAGTCGACGGTGGAGGATGAGAATCCGGATAGGGAGAATAAG
301 AGAGCCAAGATTGAGGTGGCGCAATTGCAAGTGGAGCTTGAACGTATGAATGCCGAGAAC
361 CAAAAGCTGCGAGGGATGCTGAACCAGGTGACCAACAACTACAGCACTCTTCAGATGCAT
421 CTCGTCACACTTATGCAGCAGCAGAGCCAGCAGAACCGTGGAGCCGAAAGCCTCCAAGAA
481 CATGGGTCTGTCGGAGGAAAATCTGATGAGAAGAAACATGAGGTTGCGGGAGCGGTGGTG
541 CCCAGGCAGTTCATCGATCTAGGCCCAACTGCCACAGCTGACACGGATGAGCCATCTCAA
601 TCTTCATCAGAAGAAAGAACCCGGGATCTCTCTGGATCACCCCAGAATCATCAGGAAAAC
661 GGAAAAGGAGCTGGCAGGGAAGAAAGCCCAGAATCTGAAACACAAGGTTGGGTCCAGAAC
721 AAGGCTTCCAAATTGAGTCCTCCCAAGACTATTGATCAGTCCGCAGAGGCCACAATGAGG
781 AAAGCCCGCGTCTCGGTTCGTGCCCGATCAGAGGCTCCCATGATCACTGATGGATGCCAA
841 TGGCGCAAGTATGGGCAGAAAATGGCGAAGGGGAACCCATGCCCGCGAGCCTACTACCGA
901TGTACCATGGCAGTTGGCTGCCCAGTTCGCAAACAAGTTCAGAGGTGTGCCGAGGACAGG
961TCAATATTGATAACTACCTATGAAGGAACCCACAACCACCCACTCCCTCCGGCTGCAATG
1021GCCATGGCATCAACGACATCAGCAGCTGCAAACATGCTACTTTCAGGATCCATGTCGAGC
1081GCAGATGGACTAATGAACCCGAATTTCCTGGCCAGGACGATACTCCCTTGCTCATCTAAC
1141ATGGCGACTATTTCAGCTTCAGCGCCATTCCCCACAGTGACATTGGACCTCACCCACACT
1201CCTTCCCCATTACAGTACCAAAGGCCAACTTCCCAGTTCCCGGTCCCCTTCGCCGCCCCG
1261GCTCAGAGCTTCCCCTCCGCGCAAACCTCTTCTCTGCCTCAAGTTTTCAGTCAGGCCCTC
1321TACAACCAATCCAAATTCTCAGGGCTGCAGCTCTCTCAGGACATGGAATCAGCCCACCAA
1381GCTCCACCAACATTGCATCAGCCACAGCCAGCCTCATTGGCTGACACAGTGAGCGCTGCC
1441ACAGCTGCCATCACCGCCGACCCAAACTTCACCGCAGCTCTCGCAGCTGCCATAACCTCG
1501ATCATCGGCGGTGGCGCCGCCCACCCAAACACCACCATTAACAGCACCTCCAATGCAACC
1561AACTCCAGCAACACCAACAAAATCAGCAGCTTCCCGACGGGGAATTAA
Claims (1)
1.野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY31在提高葡萄抗白粉病能力中的应用，其特征在于，所述基因的编码区序列是：
1 ATGGACAAAGGATGGGGTCTCACCCTTGATTCTATTGCCATCAATTCGTTTCTCAACAAG
61 CGCAGCCGTGGGATTCTGGAGTCTGGCCCCATGTTGGACATGCCGGTGGGTGATGAGAGG
121 CGGGAGGTGGATTTCTTCGCCGAGAAGACTAGGAGCGTCAGTGTGAAGAAGGAGAATTCT
181 CATGTGGATGAAGCTGCGATCACTGATTTGGATGTCAATACTGGGTTGAATCTTCTGACT
241 GCTAACGCGGGAAGTGATCAGTCGACGGTGGAGGATGAGAATCCGGATAGGGAGAATAAG
301 AGAGCCAAGATTGAGGTGGCGCAATTGCAAGTGGAGCTTGAACGTATGAATGCCGAGAAC
361 CAAAAGCTGCGAGGGATGCTGAACCAGGTGACCAACAACTACAGCACTCTTCAGATGCAT
421 CTCGTCACACTTATGCAGCAGCAGAGCCAGCAGAACCGTGGAGCCGAAAGCCTCCAAGAA
481 CATGGGTCTGTCGGAGGAAAATCTGATGAGAAGAAACATGAGGTTGCGGGAGCGGTGGTG
541 CCCAGGCAGTTCATCGATCTAGGCCCAACTGCCACAGCTGACACGGATGAGCCATCTCAA
601 TCTTCATCAGAAGAAAGAACCCGGGATCTCTCTGGATCACCCCAGAATCATCAGGAAAAC
661 GGAAAAGGAGCTGGCAGGGAAGAAAGCCCAGAATCTGAAACACAAGGTTGGGTCCAGAAC
721 AAGGCTTCCAAATTGAGTCCTCCCAAGACTATTGATCAGTCCGCAGAGGCCACAATGAGG
781 AAAGCCCGCGTCTCGGTTCGTGCCCGATCAGAGGCTCCCATGATCACTGATGGATGCCAA
841 TGGCGCAAGTATGGGCAGAAAATGGCGAAGGGGAACCCATGCCCGCGAGCCTACTACCGA
901 TGTACCATGGCAGTTGGCTGCCCAGTTCGCAAACAAGTTCAGAGGTGTGCCGAGGACAGG
961 TCAATATTGATAACTACCTATGAAGGAACCCACAACCACCCACTCCCTCCGGCTGCAATG
1021 GCCATGGCATCAACGACATCAGCAGCTGCAAACATGCTACTTTCAGGATCCATGTCGAGC
1081 GCAGATGGACTAATGAACCCGAATTTCCTGGCCAGGACGATACTCCCTTGCTCATCTAAC
1141 ATGGCGACTATTTCAGCTTCAGCGCCATTCCCCACAGTGACATTGGACCTCACCCACACT
1201 CCTTCCCCATTACAGTACCAAAGGCCAACTTCCCAGTTCCCGGTCCCCTTCGCCGCCCCG
1261 GCTCAGAGCTTCCCCTCCGCGCAAACCTCTTCTCTGCCTCAAGTTTTCAGTCAGGCCCTC
1321 TACAACCAATCCAAATTCTCAGGGCTGCAGCTCTCTCAGGACATGGAATCAGCCCACCAA
1381 GCTCCACCAACATTGCATCAGCCACAGCCAGCCTCATTGGCTGACACAGTGAGCGCTGCC
1441 ACAGCTGCCATCACCGCCGACCCAAACTTCACCGCAGCTCTCGCAGCTGCCATAACCTCG
1501 ATCATCGGCGGTGGCGCCGCCCACCCAAACACCACCATTAACAGCACCTCCAATGCAACC
1561 AACTCCAGCAACACCAACAAAATCAGCAGCTTCCCGACGGGGAATTAA；
所述基因编码的氨基酸序列是：
1 MDKGWGLTLDSIAINSFLNKRSRGILESGPMLDMPVGDERREVDFFAEKTRSVSVKKENS
61 HVDEAAITDLDVNTGLNLLTANAGSDQSTVEDENPDRENKRAKIEVAQLQVELERMNAEN
121 QKLRGMLNQVTNNYSTLQMHLVTLMQQQSQQNRGAESLQEHGSVGGKSDEKKHEVAGAVV
181 PRQFIDLGPTATADTDEPSQSSSEERTRDLSGSPQNHQENGKGAGREESPESETQGWVQN
241 KASKLSPPKTIDQSAEATMRKARVSVRARSEAPMITDGCQWRKYGQKMAKGNPCPRAYYR
301 CTMAVGCPVRKQVQRCAEDRSILITTYEGTHNHPLPPAAMAMASTTSAAANMLLSGSMSS
361 ADGLMNPNFLARTILPCSSNMATISASAPFPTVTLDLTHTPSPLQYQRPTSQFPVPFAAP
421 AQSFPSAQTSSLPQVFSQALYNQSKFSGLQLSQDMESAHQAPPTLHQPQPASLADTVSAA
481 TAAITADPNFTAALAAAITSIIGGGAAHPNTTINSTSNATNSSNTNKISSFPTGN*。
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