CN110184247A

CN110184247A - 紫花苜蓿褪黑素合成基因MsASMT及其在调控植物褪黑素和黄酮类物质合成中的应用

Info

Publication number: CN110184247A
Application number: CN201910384020.6A
Authority: CN
Inventors: 张蕴薇; 岑慧芳; 刘斯佳; 黄艳华; 田丹阳; 崔鑫; 管聪; 刘华玥
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110184247B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及紫花苜蓿褪黑素合成基因MsASMT及其在调控植物褪黑素和黄酮类物质合成中的应用。本发明通过克隆获得紫花苜蓿的褪黑素合成关键酶MsASMT，其氨基序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。MsASMT基因对褪黑素的积累及黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质的合成代谢以及植物的生长发育具有调控功能。MsASMT基因及其功能的发现为苜蓿高品质新品种的选育以及其他牧草品质育种提供理论基础和新的方法。

Description

紫花苜蓿褪黑素合成基因MsASMT及其在调控植物褪黑素和黄酮类物质合成中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT、其编码基因及其在调控植物褪黑素、黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质的合成以及植物生长发育中的应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上重要的多年生豆科牧草，因其草质优良、营养丰富、蛋白质含量高，一直被称为“牧草之王”。紫花苜蓿在世界上广泛栽培，是世界上重要的多年生饲草作物之一，全世界种植面积达3.2×10⁷公顷。中国的苜蓿种植面积约3.8×10⁶公顷，主要分布于西北、华北和东北地区。紫花苜蓿不仅蛋白质含量丰富，并且含有较高的维生素和黄酮类物质等活性成分，对家畜及人体健康都十分有益。紫花苜蓿作为保健品原料已有成功应用，作为食材的市场也正迅速发展，这些都迫切需要品种的不断改良与创新。

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是在高等植物中广泛存在的小分子物质，参与植物生长、植物抗逆性、昼夜节律、清除活性氧等多种生理生化过程的调控。植物褪黑素的合成前体是色氨酸，乙酰-5-羟色胺甲基转移酶(ASMT)是合成褪黑素的最后一步酶，对植物体内褪黑素的合成起关键调控作用。通过基因调控提高紫花苜蓿中褪黑素含量，研究内源褪黑素对紫花苜蓿生长发育及物质代谢的调控关系，对于进一步揭示褪黑素在植物中的生物学功能提供证据，并为苜蓿高品质新品种的选育奠定基础，也为其他牧草品质育种提供理论和技术借鉴。现有研究中未见关于紫花苜蓿中褪黑素合成关键酶基因的克隆、表达及其应用，也未见内源褪黑素在紫花苜蓿中对植株的生长发育等过程的调控功能的研究。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT、其编码基因及其在调控植物褪黑素和黄酮合成中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过序列比对，找到截形苜蓿的ASMT基因序列，设计引物，在紫花苜蓿中进行基因克隆，获得的目的产物经过测序，得到MsASMT基因序列。同时，构建MsASMT基因的过表达载体，获得过表达MsASMT基因的转基因紫花苜蓿株系，对MsASMT基因进行功能鉴定，结果表明，MsASMT基因具有提高紫花苜蓿褪黑素含量的功能，并且紫花苜蓿中黄酮类物质含量也受MsASMT基因的调控。

具体地，本发明提供紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT，其氨基序列如SEQ IDNO.1所示或为如SEQ ID NO.1所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的蛋白的氨基酸序列。

本发明提供编码所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因。

具体地，所述基因的CDS的核苷酸序列为如下(1)～(3)任意一种：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入形成的序列；

(3)在严格条件下能够与如(1)或(2)所述的核苷酸序列杂交并编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供含有所述编码紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT基因的生物材料。

所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或转基因细胞系。

本发明中，所述载体和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的载体和宿主细胞。但随着科技发展，所述载体和宿主细胞的选择也许会发生变化，或在非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和宿主细胞的利用，但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围之内。

本发明发现紫花苜蓿褪黑素合成关键酶基因MsASMT的表达水平影响植物内源褪黑素的合成以及黄酮类物质等代谢物的合成，通过过表达MsASMT可显著提高内源褪黑素的合成，同时影响多种黄酮类物质(如鹰嘴豆素、山柰酚、槲皮素等)、植物总黄酮、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质的含量以及紫花苜蓿的生长发育。

基于MsASMT的上述功能，本发明提供所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或所述编码紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因或含有所述基因的生物材料在调控植物褪黑素积累中的应用。

本发明还提供所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或所述编码紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因或含有所述基因的生物材料在调控植物生长发育中的应用。

优选地，所述调控植物生长发育包括调控植物的茎粗和叶片大小。

本发明还提供所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或所述编码紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因或含有所述基因的生物材料在调控植物黄酮类物质积累中的应用。

本发明中，通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，降低的黄酮类物质包括槲皮素7-O-丙二酰基己糖基-己糖苷、槲皮素O-乙酰基己糖苷、槲皮素3-阿拉伯糖苷、紫云英苷(山奈酚-3-葡萄糖苷)、芒柄花素、芒柄花苷、鹰嘴豆素-7-O葡萄糖苷(印度黄檀苷)、穗花杉双黄酮、乙酰基圣草酚O-己糖苷、金合欢素O-乙酰己糖苷、矢车菊素3-O-芸香糖苷；提高的黄酮类物质包括羟基金雀异黄素、麦黄酮5-O-己糖苷、木犀草素3’,7-二氧葡萄糖苷、白杨素、柚皮素7-O-葡萄糖苷、胡麻黄酮

本发明还提供所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或所述编码紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因或含有所述基因的生物材料在调控植物萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质积累中的应用。

本发明中，通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，降低的萜类物质包括柠檬苦素。通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，降低的多酚类物质包括(-)-表阿夫儿茶精、表儿茶素没食子酸。通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，降低的苯丙素类物质包括花椒毒醇、对香豆酸甲酯。通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，提高的生物碱类物质包括异喹啉。

本发明还提供所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或所述编码紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因或含有所述基因的生物材料在构建转基因植物或植物遗传育种中的应用。

本发明中，所述植物包括但不限于紫花苜蓿。优选为紫花苜蓿。

进一步地，本发明提供一种调控紫花苜蓿褪黑素积累、生长发育或代谢物质积累的方法，其为通过调控紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的表达实现。

所述代谢物质包括黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质。

具体地，通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，提高紫花苜蓿中褪黑素的积累、促进紫花苜蓿生长发育，或者调控紫花苜蓿中黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质的积累。

优选地，所述促进紫花苜蓿生长发育包括提高茎粗和/或增加叶片大小。

本发明的有益效果在于：本发明首次在紫花苜蓿中克隆得到褪黑素合成关键酶基因MsASMT，将MsASMT基因在紫花苜蓿中过表达，获得过表达MsASMT基因的转基因紫花苜蓿，并研究了MsASMT基因在紫花苜蓿中的表达模式及其在调控褪黑素合成、黄酮类物质等多种代谢物合成以及植物生长发育中的作用，经实验证实了MsASMT基因对褪黑素的积累及多种黄酮类物质、部分萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质和苯丙素类物质的合成代谢以及植物的生长发育具有调控功能。本发明填补了内源褪黑素含量调控在紫花苜蓿中无相关报道的空白，为苜蓿高品质新品种的选育以及其他牧草品质育种提供理论基础和新的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中MsASMT基因克隆的电泳结果图，其中M代表DNA marker。

图2为本发明实施例2中菌液PCR检测重组过表达载体pZh01-ASMT的农杆菌转化结果图。

图3为本发明实施例2中MsASMT转基因紫花苜蓿的获得过程及植株生长情况，其中，WT代表野生型紫花苜蓿，OE-1、OE-2、OE-3分别代表不同的MsASMT转基因植株。

图4为本发明实施例2中MsASMT转基因植株的hpt基因PCR和MsASMT基因RT-PCR验证结果图。

图5为本发明实施例2中野生型紫花苜蓿与各转基因植株中MsASMT基因的相对表达量分析结果，其中WT代表野生型紫花苜蓿，OE-1、OE-3、OE-9、OE-10、OE-12、OE-14、OE-15、OE-16分别代表不同的转基因植株。

图6为本发明实施例2中MsASMT基因的组织表达特性分析结果。

图7为本发明实施例2中转基因与野生型植株中MsASMT基因的昼夜节律表达特性及褪黑素含量的累积曲线，其中WT代表野生型紫花苜蓿，TG代表MsASMT转基因植株。

图8为本发明实施例3中野生型紫花苜蓿与各转基因植株中的褪黑素含量分析结果，其中WT代表野生型紫花苜蓿，OE-1、OE-3、OE-9、OE-10、OE-12、OE-14、OE-15、OE-16分别代表不同的转基因植株。

图9为本发明实施例3中野生型紫花苜蓿与各转基因植株的叶片大小和茎粗比较结果，其中，WT代表野生型紫花苜蓿，OE-3、OE-9、OE-10、OE-12、OE-14、OE-15、OE-16分别代表不同的转基因植株。

图10为本发明实施例3中野生型紫花苜蓿与各转基因植株中总黄酮含量分析结果，其中WT代表野生型紫花苜蓿，OE-1、OE-3、OE-9、OE-10、OE-12、OE-14、OE-15、OE-16分别代表不同的转基因植株。

具体实施方式

本发明从紫花苜蓿“中苜一号”中克隆得到褪黑素合成的最后一步酶编码基因MsASMT，构建MsASMT基因的过表达载体并进行遗传转化，获得过表达MsASMT转基因植株。利用野生型“中苜一号”和MsASMT过表达转基因植株分析了MsASMT基因以及植株褪黑素与黄酮类物质等代谢物含量间的调控关系。经实验证实MsASMT基因对紫花苜蓿内源褪黑素的合成发挥促进作用，对苯丙烷代谢通路中大部分黄酮类物质的合成以及部分萜类物质、多酚类物质和苯丙素类物质起负调控作用，对部分黄酮类物质及部分生物碱类物质起正调控作用，对紫花苜蓿总黄酮含量起负调控作用，同时具有调控植物生长发育的作用。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1紫花苜蓿褪黑素合成关键酶基因MsASMT的克隆

紫花苜蓿褪黑素合成关键酶基因MsASMT的克隆包括以下步骤：

1、紫花苜蓿叶片总RNA的提取及cDNA的合成

(1)取中苜一号紫花苜蓿幼苗叶片约100mg，在液氮中研磨成粉末，按照Trizol法提取植物总RNA，经琼脂糖凝胶电泳验证，获得了28S和18S完整的高质量RNA，并且用Nanodrop2000测定RNA浓度和纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8-2.0之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀均>2.0，证明所得到的RNA质量好，可用于cDNA第一链的合成及下游基因的克隆。

(2)以上述RNA样品1μg为模板，采用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒按说明书进行反转录，操作在冰上进行，所用离心管及枪头均为RNase free，反转录后产物即为总cDNA。

2、紫花苜蓿MsASMT基因克隆引物的设计及基因克隆

(1)利用DNAMAN对拟南芥、苹果、水稻等已报道的所有植物植物中的ASMT基因序列进行多序列比对，在Phytozome v12.1(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中找到截形苜蓿的ASMT基因同源序列(Medtr5g074600.1)，根据截形苜蓿MsASMT基因序列，利用Primer 5.0和NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线工具设计引物，引物序列如下(酶切位点加下划线，根据基因序列及载体上的多克隆位点确定)：

正向引物：5′-CGCGGATCCGCAAGTAAGTATGGAATCCCAAAAT-3′(含酶切位点BamH I)；

反向引物：5′-CGGGGTACCTTATGGATAGATCTCAATCATGGAC-3′(含酶切位点Kpn I)；

引物送上海生工生物合成。

(2)以反转录得到的紫花苜蓿cDNA第一链为模板，利用MsASMT基因克隆引物对MsASMT基因编码区进行PCR扩增，PCR选用2×Taq Mix酶反应体系，体系总体积20μL，包括：2×Taq Mix 10μL，得到ddH2O 8μL，10μM的正反向引物各1μL，模板cDNA 1μL。PCR反应程序为：95℃2min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测特异性，MsASMT的扩增条带如图1所示。

3、MsASMT基因克隆载体的构建及基因测序

(1)上述具有清晰条带的琼脂糖凝胶，大小约1kb，利用TaKaRa的胶回收试剂盒按照说明书回收MsASMT基因片段，并利用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计测定回收DNA片段的纯度和浓度。

(2)通过TaKaRa的连接试剂盒按照说明书与pMD18-T载体连接，连接体系如下：0.3pmol目的片段(根据浓度换算成体积)，1μLpMD18-T载体，5μL solution I，ddH₂O补至10μL，混匀，置于金属浴中16℃反应1h。

(3)将保存在-80℃冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞取出，置于冰上解冻，将连接产物轻轻加入到刚解冻的感受态细胞中央，轻弹3-5下，冰浴30min，将感受态细胞在水浴锅中42℃热激1min，迅速转入冰中静置2min。

(4)在转化后的感受态细胞中加入800μL LB液体培养基，颠倒混匀，置于37℃摇床上，220rpm振荡培养1h。

(5)将培养好的菌液5000rpm离心2min，吸去上清500μL，余下的液体用移液枪吸打混匀，取100μL菌液均匀涂布至含100mg/L氨苄霉素的LB固体培养基平板上，培养箱中37℃倒置培养12h。

(6)用无菌枪头挑取单菌落10～20个，分别加入到5mL LB液体培养基中(含100mg/L Amp)，37℃，220rpm震荡培养12h。

(7)分别取1μL菌液，按照2(2)所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，并经琼脂糖凝胶电泳检验扩增的特异性。

(8)将PCR鉴定含有目的片段的菌液各取1mL，送上海生工测序(测序采用通用引物M13，双向测序)。

4、MsASMT基因的序列和结构分析及功能预测

(1)测序得到的序列结果拼接后去掉载体序列，得到的MsASMT基因序列编码区大小为1077bp(MsASMT基因CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，序列比对发现与截形苜蓿序列相似性为87.87％，共编码358个氨基酸(MsASMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。翻译的氨基酸序列的保守结构域在NCBI网站进行搜索，发现其具有dimerization domain和AdoMet_MTase superfamily两个结构域，与其他植物中已报道的ASMT氨基酸保守结构域相同。

(2)利用CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在线软件进行蛋白质的亚细胞定位预测，发现MsASMT定位于细胞质中。利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在线软件进行蛋白质的理化性质预测，发现MsASMT蛋白分子量为40.385Kd，理论等电点为5.62，脂溶系数94.19，总平均亲水系数-0.119，不稳定系数37.64，属于稳定蛋白；二级结构预测及功能预测等主要通过PropFun 2.2Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)网站提供的生物信息学在线分析软件进行，该蛋白结构中α-螺旋占43.85％，β-转角占8.10％，延伸链占17.32％，无规则卷曲占30.73％，属于非分泌蛋白，不存在信号肽，无蛋白跨膜区域。

(3)根据MsASMT基因序列，在NCBI Blast和Phytozome网站上在线查找鹰嘴豆、菜豆、黄瓜、苹果、大豆、小麦、二穗短柄草、大麦、小米、水稻、拟南芥等植物相应的基因序列，先以Clustal x1.83进行序列比对，然后导入MEGA 5.0进行系统发育树的构建。

实施例2MsASMT过表达载体的构建及转基因紫花苜蓿的获得

本实施例提供紫花苜蓿褪黑合成关键酶基因MsASMT过表达载体的构建及转基因紫花苜蓿的获得方法，具体包括如下步骤：

1、MsASMT植物过表达载体的构建

(1)将上述测序正确的含有pMD18T-MsASMT质粒的大肠杆菌菌液用TaKaRa质粒小量提取试剂盒提取质粒，并用NanoDrop2000测定质粒浓度。

(2)由于基因克隆上下游引物分别带有BamH I和Kpn I的酶切识别位点，因此选择这两个酶对测序正确的质粒样品及植物过表达载体pZh01分别进行双酶切，酶切体系如下：质粒DNA 1μg(需根据浓度换算成体积)，BamH I 1μL，Kpn I 1μL，Cutsmart 5μL，ddH₂O补至50μL，混匀，置于37℃水浴锅反应1h。酶切结果根据琼脂糖凝胶电泳验证。

(3)利用TaKaRa胶回收试剂盒根据说明书回收酶切的目的基因片段和pZh01载体片段，并用NanoDrop2000测定浓度。利用T4DNA连接酶将目的基因和目的载体片段进行连接，反应体系如下：目的基因：载体片段＝10：1，T4DNA连接酶1μL，Buffer 2μL，用ddH₂O补至20μL，混匀，16℃连接2h以上。

(4)参照实施例1中的步骤3将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并进行培养。参照实施例1中的方法进行菌液PCR鉴定，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

(5)菌液PCR为阳性的大肠杆菌菌液各取1mL，送上海生工测序，将测序结果正确的菌液提取质粒，获得构建成功的重组质粒pzh01-ASMT。

2、农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化和转基因植株的获得

(1)将保存在-80℃冰箱的农杆菌EHA105感受态细胞取出，置于冰上解冻，将重组质粒pzh01-ASMT轻轻加入到刚解冻的感受态细胞中央，轻弹3-5下，冰浴30min，液氮中速冻1min，将感受态细胞在水浴锅中37℃热激5min，迅速转入冰中静置2min。

(2)在转化后的感受态细胞中加入500μL YEP液体培养基，颠倒混匀，置于28℃摇床上，220rpm振荡培养2-4h。

(3)取200μL菌液涂布在含有100mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP平板上，28℃避光倒置培养2天，挑取单菌落进行菌落PCR检测(结果如图2所示)，检测结果呈阳性，表明重组质粒pzh01-ASMT已成功导入农杆菌，保存农杆菌菌液。

(4)挑选黄色饱满的紫花苜蓿中苜一号种子于50mL离心管中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入10mL 50％H₂SO₄，置摇床上室温震荡5min；弃浓H₂SO₄，用无菌水清洗3～5次，加入20mL5％次氯酸钠，置摇床上室温震荡40min；弃次氯酸钠，用无菌水清洗5～6次。清洗后的种子摆于MS固体培养基(MS基本培养基4.43g/L,蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH5.8)上发芽，7天后长出无菌苗。

(5)取100μL保存的农杆菌菌液至20mL YEP液体培养基中(50mg/L Rif，100mg/LKan)，28℃,220rpm震荡培养14h，后加As至150μM/L，再摇2h至菌液OD₆₀₀值达到0.8～1.0，3000rpm离心10min，收集菌体，之后用20mL重悬液(20×N6大量母液50ml/L,200×Ms微量母液5ml/L,200×铁盐母液5ml/L,1000×有机成分1ml/L,3mg/L 2,4-D,0.05mg/L KT,0.6g/LMES,30g/L蔗糖,pH 5.4)重悬至菌液OD值达到0.5～0.6后,28℃,80rpm缓震2h，准备好的农杆菌菌液备用。

(6)将生长7～8d的无菌苗子叶切成3～4mm²的小片，下胚轴切成2～3mm的小段，准备好的外植体倒入准备好的农杆菌菌液中，冰浴20min，-0.8MPa抽真空10min，28℃、80rpm缓震侵染30min。

(7)弃农杆菌菌液外植体转移至无菌滤纸上，稍干燥(30min以上)，将外植体平铺于共培养培养基(20×N6大量母液50ml/L,200×Ms微量母液5ml/L,200×铁盐母液5ml/L,1000×有机成分1ml/L,3mg/L 2,4-D,0.05mg/L KT,0.6g/L MES,30g/L蔗糖,8g/L琼脂，pH5.4)上，培养基上提前铺一层滤纸，置于暗处，培养2～3d至菌斑初现。

(8)共培养结束后的外植体用无菌水清洗3～5次，无菌滤纸上晾干后转移至愈伤诱导培养基上(20×N6大量母液50ml/L,200×Ms微量母液5ml/L,200×铁盐母液5ml/L,1000×有机成分1ml/L，2mg/L2,4-D，0.05mg/L KT,0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，200mg/L特美汀，5mg/L潮霉素pH 5.8)，两周后，培养基中潮霉素浓度提高至10mg/L。

(9)再2周后，将绿色、粘性愈伤组织接种于分化培养基(20×N6大量母液50ml/L，200×Ms微量母液5ml/L，200×铁盐母液5ml/L，1000×有机成分1ml/L，0.6mg/L KT,0.5g/L酸水解酪蛋白，20g/L蔗糖，200mg/L特美汀，3mg/L潮霉素，8g/L琼脂pH 5.8)上，每2周继代一次，将不断形成的鱼雷型胚接种于生根培养基(MS基本培养基4.43g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，200mg/L特美汀，2mg/L潮霉素pH 5.8)上。

(10)在生根培养基上的幼苗长至10cm左右高度，根系健康时，用镊子取出无菌苗，洗净根部培养基，移入营养土中，用透明玻璃瓶罩住幼苗约3～5d至幼苗充分适应环境(如图3所示)。

(11)转化植株经载体上的筛选标记基因Hpt引物分别进行PCR验证，鉴定转基因阳性植株。转基因阳性植株提取基因组DNA，用载体上的筛选标记基因Hpt序列设计引物，引物序列为：Hpt-F:5’-TACTTCTACACAGCCATCGGTCCAG-3’；Hpt-R:5’-CTTGACATTGGGGAGTTTAGCGAGA-3’，以各植株DNA为模板进行PCR扩增(结果如图4所示)。

(12)挑选PCR鉴定为阳性的植株提取RNA，利用TaKaRa公司的PrimeScript RTreagent Kit反转录试剂盒合成cDNA作为模板，设计ASMT基因特异引物分别进行RT-PCR和QRT-PCR分析。引物序列为：MsASMT-F:5’-ATTTCTTCACTACCAATCCACCC-3’；MsASMT-R:5’-CCACACTCATTGGATTGTTCTAAA-3’，内参引物序列为：actin-F:5’-CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT-3’；actin-R:5’-CATGACACCAGTATGACGAGGTCG-3’，检测MsASMT基因在不同植株中的表达水平，其中RT-PCR的检测结果如图4所示，QRT-PCR的分析结果如图5所示。

3、MsASMT基因时空表达特性分析

(1)取中苜一号紫花苜蓿根、茎、幼叶、成熟叶、花等部位各约100mg，在液氮中研磨后，按照Trizol法提取各部位总RNA，经琼脂糖凝胶电泳验证，获得了28S和18S完整的高质量RNA，并且用Nanodrop2000测定RNA浓度和纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8-2.0之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀均>2.0，证明所得到的RNA质量好，可用于cDNA第一链的合成。

(3)根据MsASMT基因序列设计特异引物进行实时荧光定量PCR反应，引物序列同上。结果如图6所示，MsASMT基因在茎和根中表达量最高，其次为幼叶、成熟叶，在花中表达量最低。

(4)转基因与野生型植株在一天24h中每隔3h分别取叶片，测定不同时间点ASMT基因的相对表达量；并在相同时间点取样，用植物褪黑素ELISA测定试剂盒测定植株的褪黑素含量，得出转基因与野生型植株中MsASMT基因的昼夜节律表达特性及褪黑素含量的累积曲线，结果如图7所示。

实施例3转基因紫花苜蓿的表型及生物学功能分析

1、转基因紫花苜蓿中褪黑素含量分析

取野生型与各转基因植株地上部分约1.5～2g，每个植株3个重复，液氮研磨后，用甲醇过夜浸提，8000g离心10min，上清液过0.25μm滤膜进棕色小瓶，用高效液相色谱法(HPLC)测定各转基因与野生型紫花苜蓿中的褪黑素含量。结果如图8所示，过表达MsASMT转基因紫花苜蓿中的褪黑素含量均显著提高。用SPSS对褪黑素含量水平与MsASMT基因的表达量进行相关性分析，相关性系数为0.720，对应的显著性为0.029，说明褪黑素含量水平与MsASMT基因的表达量呈显著的正相关关系。

2、转基因紫花苜蓿的生长发育表型分析

转基因紫花苜蓿移栽温室后，观察并测量转基因与野生型植株的株高、茎粗、叶片大小、开花特性等表型指标。结果如图9所示，过表达MsASMT转基因紫花苜蓿的茎变粗，叶片变大。

3、转基因紫花苜蓿中黄酮类物质含量分析

取同一生长时期同一部位植株约0.2～0.5g，利用植物类黄酮含量测定试剂盒(苏州科铭生物科技有限公司)按照说明书方法进行总黄酮含量的测定。结果如图10所示，过表达MsASMT转基因紫花苜蓿的总黄酮含量降低。但总黄酮含量水平与MsASMT基因的表达量之间无显著的负相关关系。

取相同部位植物组织约1.5～2g，送百迈克生物科技有限公司进行MsASMT转基因紫花苜蓿与野生型紫花苜蓿的广泛靶向代谢组学分析，结果如表1所示，结果表明，鹰嘴豆素、山柰酚、槲皮素、芒柄花素等黄酮类物质含量显著降低，羟基金雀异黄素、麦黄酮、木犀草素、白杨素、柚皮素等黄酮类物质含量升高，总黄酮含量的降低主要是由于鹰嘴豆素、山柰酚、槲皮素、芒柄花素等黄酮类物质含量降低而导致的；此外还有部分萜类、生物碱、多酚及苯丙素类物质含量也显著降低。

表1与野生型紫花苜蓿相比，MsASMT转基因紫花苜蓿中部分黄酮类物质、萜类、生物碱类、多酚类和苯丙素类物质的变化

表1中down代表与野生型紫花苜蓿相比，MsASMT转基因紫花苜蓿中相对应的物质含量降低，up代表与野生型紫花苜蓿相比，MsASMT转基因紫花苜蓿中相对应的物质含量提高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 紫花苜蓿褪黑素合成基因MsASMT及其在调控植物褪黑素和黄酮类物质合成中的应用

<130> KHP191112147.7

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Ser Gln Asn Gly Asp Asn Val Ala Ser Asn Leu Leu Lys Ala

1 5 10 15

Gln Ser His Leu Trp Asn His Ile Phe Asn Phe Ile Asn Ser Met Ser

20 25 30

Leu Lys Cys Val Val Asp Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His Asn His

35 40 45

Gly Lys Pro Met Pro Leu Ser Lys Leu Ile Ser Ser Leu Pro Ile His

50 55 60

Pro Ser Lys Lys Pro Cys Asn Tyr Arg Leu Met Arg Ile Met Thr Tyr

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Gln Gln Asn Ile Thr Glu Asn Glu Leu Glu Ile

85 90 95

Glu Tyr Met Leu Thr Asp Val Ser Leu Leu Leu Leu Lys Asn Asn Pro

100 105 110

Met Ser Val Ala Pro His Val His Gly Ile Leu Ser Pro Asp Met Ile

115 120 125

Asp Pro Trp His Gln Phe Ser Ala Trp Leu Lys Asn Asp Asp Ile Thr

130 135 140

Ala Phe Glu Thr Ala His Gly Met Ser Phe Trp Asp Tyr Leu Ala Arg

145 150 155 160

Asp Ser Lys Ile Asn Asn Ser Phe Asn Glu Ser Met Ala Lys Asp Thr

165 170 175

Arg Leu Val Ser Asp Leu Leu Ala Glu Lys Cys Lys Gly Val Phe His

180 185 190

Glu Val Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala

195 200 205

Lys Thr Leu Ala Lys Ser Phe Pro Gln Met Glu Cys Ile Val Phe Asp

210 215 220

Leu Pro His Val Val His Gly Leu Gln Gly Ile Glu Asn Leu Asn Tyr

225 230 235 240

Val Ala Gly Asp Met Phe Lys Glu Ile Pro Ser Thr Asp Ala Ile Leu

245 250 255

Leu Lys Ser Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Glu Glu Cys Val Lys Ile

260 265 270

Leu Lys Asn Cys Lys Asp Ala Ile Ser Lys Lys Gly Lys Gly Lys Val

275 280 285

Val Ile Ile Asp Thr Val Leu Asp Lys Glu Asn Gly Asn Ile Asn Glu

290 295 300

Ser Val Glu Thr Gln Leu Phe Tyr Asp Met Leu Met Met Val Val Phe

305 310 315 320

Ala Gly Lys Glu Arg Asn Glu Lys Glu Trp Ile Lys Leu Ile Cys Leu

325 330 335

Ala Gly Phe Ser Asp Tyr Lys Ile Thr Pro Ile Leu Gly Ser Arg Ser

340 345 350

Met Ile Glu Ile Tyr Pro

355

<210> 2

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaatccc aaaatggaga taatgttgct tccaatttgc tcaaagctca aagccactta 60

tggaatcaca ttttcaactt cataaattca atgtcactta aatgtgtagt tgacttaggc 120

ataccagata tcatacacaa ccatggaaaa cccatgccac tctcaaaact catttcttca 180

ctaccaatcc acccttcaaa aaagccttgc aactatcgct tgatgcgaat catgacttat 240

tccggcttct tctctcaaca aaatattact gagaatgagc tagagattga gtacatgtta 300

actgatgtat ctctattact acttaagaac aatccaatga gtgtggcacc gcatgtgcac 360

gggatactca gtccagatat gatagatcca tggcatcaat tctctgcttg gttaaaaaat 420

gatgatatta cagcatttga aacagcacat gggatgtcgt tttgggatta tcttgcacgt 480

gactccaaaa ttaacaactc atttaacgaa tcaatggcaa aagatactcg attagtttcc 540

gatttgttgg ctgagaagtg caagggagtg ttccatgaag ttgagtcatt ggttgatgtt 600

ggaggaggta cggggaccat ggcaaaaact cttgccaaat cattcccaca aatggagtgc 660

attgtgtttg atctcccaca tgttgttcat ggtttgcaag gaattgaaaa cttaaactat 720

gttgctggag acatgtttaa agaaattccg tcaacggatg caattttgtt gaagtcgata 780

ttgcatgatt ggaatgacga ggaatgtgta aagatattaa agaattgcaa ggatgcaata 840

tcaaagaaag gtaaagggaa ggtggttatc attgacacgg tgttagacaa agagaatgga 900

aacattaatg aatcagttga aacacaactc ttctatgaca tgttgatgat ggtagtattc 960

gcaggaaaag agagaaacga gaaagaatgg attaagttga tttgcttggc tggttttagt 1020

gactacaaga ttactccaat tttaggatca aggtccatga ttgagatcta tccataa 1077

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatccg caagtaagta tggaatccca aaat 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggggtacct tatggataga tctcaatcat ggac 34

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacttctaca cagccatcgg tccag 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttgacattg gggagtttag cgaga 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atttcttcac taccaatcca ccc 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccacactcat tggattgttc taaa 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaaagatgg cagatgctga ggat 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catgacacca gtatgacgag gtcg 24

Claims

1.紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT，其特征在于，其氨基序列如SEQ ID NO.1所示或为如SEQ ID NO.1所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的与SEQ IDNO.1所示的蛋白具有相同功能的蛋白的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其CDS的核苷酸序列为如下(1)～(3)任意一种：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

4.含有权利要求2或3所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或转基因细胞系。

5.权利要求1所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述生物材料在调控植物褪黑素积累中的应用。

6.权利要求1所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述生物材料在调控植物生长发育中的应用。

7.权利要求1所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述生物材料在调控植物黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质积累中的应用。

8.权利要求1所述紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述生物材料在构建转基因植物或植物遗传育种中的应用。

9.一种调控紫花苜蓿褪黑素积累、生长发育或代谢物质积累的方法，其特征在于，调控紫花苜蓿褪黑素合成关键酶MsASMT的表达；所述代谢物质包括黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过提高褪黑素合成关键酶MsASMT的表达，提高紫花苜蓿中褪黑素的积累、促进紫花苜蓿的生长发育，或者调控紫花苜蓿中黄酮类物质、萜类物质、生物碱类物质、多酚类物质或苯丙素类物质的积累。