CN113186212A

CN113186212A - 小鼠asmtl基因及其特异性引物对和检测试剂盒

Info

Publication number: CN113186212A
Application number: CN202110575605.3A
Authority: CN
Inventors: 刘国世; 李广栋; 张鲁; 关盛宇; 王立凯; 阎来庆; 付瑶; 吕东颖; 姚昱君
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-07-30

Abstract

本发明涉及分离的小鼠ASMTL基因以及相应的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及针对小鼠ASMTL基因CDS区的特异性引物对和检测试剂盒。本发明明确了小鼠ASMTL基因序列，为该基因相关的生物合成路径以及生理和病理方面的研究提供新的参考。

Description

小鼠ASMTL基因及其特异性引物对和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及分离的小鼠ASMTL基因以及相应的表达载体和宿主细胞，还涉及针对小鼠ASMTL基因CDS区的特异性引物对和检测试剂盒。

背景技术

褪黑素(Melatonin，MT，N-乙酰基-5-甲氧基色胺)也被称为“脑白金”，主要是由哺乳动物松果体、卵巢等器官合成分泌的一种重要的吲哚类活性小分子物质，其广泛分布于动物多个组织中。褪黑素是一种十分重要的内分泌激素，其合成受到光照的抑制，呈现昼低夜高的节律振荡，因而也被称为“黑暗荷尔蒙”。褪黑素具有多种生理学和药理学功能，比如：改善睡眠，调节生物节律，缓解应激，调节免疫系统，增强免疫力，抗肿瘤，抗衰老等。褪黑素及其代谢产物都是重要的广谱抗氧化剂，能够清除动物体内、外的氧基自由基(ROS)、高活性的氮基自由基(RNS)等，还能够激活细胞内抗氧化酶基因的表达，进一步发挥抗氧化功能。另外，褪黑素能够保护细胞DNA的稳定性，减少脂质的损伤，维持线粒体功能，促进抗凋亡基因的表达等。褪黑素也是一种关键的生殖激素，在动物繁殖活动中直接或间接调控生殖激素的分泌、卵泡发育、胚胎发育及附植等，也参与了季节性发情动物发情周期的调控。

在哺乳动物体内，褪黑素合成的最初来源物质是L-tryptophan(色氨酸)。L-tryptophan经过TPH(tryptophane hydroxylase，色氨酸羟化酶)催化的羟化反应生成5-羟色氨酸(5-Hydroxytryptophan，5-HTP)，再经过AAAD(L-aromatic amino aciddecarboxylase，L-芳香氨基酸脱羧酶)脱羧反应后变为5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)，也称血清素(Serotonin)。5-羟色胺在AANAT(Arylalkylamine-N-Acetyltransferase，芳烷基胺N-乙酰转移酶)的作用下生成N-乙酰-5-羟色胺(N-Acetyl-Serotonin，NAS)。最后在ASMT(acetylserotonin O-methyltransferase，乙酰-5-羟色胺-氧-甲基转移酶)的催化作用下发生甲基化进而生成最终的褪黑素。

ASMTL(acetylserotonin O-methyltransferase like)基因为ASMT基因在进化过程中发生复制、融合形成的旁系同源基因(Paralogous gene)，ASMTL与ASMT基因序列高度相似，但是，到目前为止，尚无该基因具体功能的相关报道。2020年一篇文章在研究猪的ASMT基因时，作者把ASMTL当做ASMT来使用(Bae et al.,2020)。还有一项有关研究人褪黑素生物合成的美国专利也将ASMTL等同于ASMT(Lin et al.,2020)。因此，人们对ASMT基因和ASMTL基因区别的认知不足。

小鼠是一种重要的模式动物，哺乳动物大多数基因功能的研究最先都是从小鼠开始的，而对于小鼠来说，NCBI数据库中并没有完整的ASMTL基因信息，这也进一步阻碍了大动物ASMTL基因功能及其褪黑素合成路径的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中小鼠ASMTL基因信息混乱不清楚的问题，运用生物信息学方法，重新定位并且明确了小鼠的ASMTL基因，为该基因进一步的生物学研究和应用提供新的参考。

具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供分离的小鼠ASMTL基因，该基因的CDS区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供小鼠ASMTL基因编码的蛋白质，其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

第三方面，本发明提供表达小鼠ASMTL基因的表达载体，其包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

第四方面，本发明提供表达小鼠ASMTL基因的宿主细胞，所述宿主细胞中外源转入了第三方面所述的表达载体。所述宿主细胞可以是大肠杆菌，也可以是真核细胞。

第五方面，本发明提供所述分离的小鼠ASMTL基因、小鼠ASMTL基因编码的蛋白质、所述表达载体或所述宿主细胞在褪黑素和/或其代谢产物相关的生理或病理研究中的应用。

第六方面，本发明提供所述分离的小鼠ASMTL基因、小鼠ASMTL基因编码的蛋白质、所述表达载体或所述宿主细胞在制备预防或治疗褪黑素和/或其代谢产物相关的疾病的药物中的应用。

第七方面，本发明提供小鼠ASMTL基因CDS区的特异性引物对，引物正义链具有SEQID NO.3所示的核苷酸序列，引物反义链具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明通过大量实验发现，上述引物对对于小鼠ASMTL基因的特异性强，扩增效率高，且引物的工作浓度较为合理。

第八方面，本发明提供一种用于检测小鼠ASMTL基因的试剂盒，该试剂盒中包含第七方面所述的特异性引物对。

第九方面，本发明提供所述特异性引物对或所述试剂盒在小鼠ASMTL基因检测中的应用。

本发明提供的引物对和包含该特异性引物对的试剂盒，可以用于小鼠ASMTL基因的快速、准确检测，为小鼠ASMTL基因相关生物合成以及生物节律、生殖生物学和神经内分泌的研究提供了便捷的途径。

相对于现有技术，本发明利用生信分析在小鼠基因组中首次成功定位到了ASMTL基因并证明了NCBI数据库机器注释错误，还通过分子克隆获得了其CDS编码序列，填补了小鼠ASMTL基因研究的空白，对于小鼠及大动物ASMTL基因的功能、生物节律、生殖生物学和神经内分泌的研究具有重要科学意义，可为哺乳动物褪黑素生物合成路径相关的研究提供新的参考。

附图说明

图1为NCBI数据库小鼠ASMTL基因检索结果示意图；其中，A为小鼠ASMTL基因缩写检索结果；B为小鼠ASMTL基因全称检索结果；

图2为小鼠2510022D24Rik基因分析结果示意图；

图3为小鼠1810009N02Rik基因分析结果示意图；

图4为1810009N02Rik基因BLAT及BLAST比对分析结果示意图；其中，A为1810009N02Rik基因BLAT比对结果，B为1810009N02Rik基因BLAST比对结果，C为Snapgene比对结果可视化；

图5为2510022D24Rik错误注释为Srrm1的示意图；其中，A为NCBI数据库小鼠Srrm1基因信息，B为2510022D24Rik基因组序列BLASTN分析结果；

图6为2510022D24Rik转录信息不完整的示意图；其中，A为2510022D24Rik不完整转录本XM_036162156CDS序列，B为2510022D24Rik不完整编码氨基酸序列；

图7为1810009N02Rik mRNA对应2510022D24Rik DNA位置的起始密码子发生突变的示意图；其中，A为1810009N02Rik CDS起始密码子ATG附近序列与2510022D24Rik比对结果，B为1810009N02Rik CDS区序列，C为C57BL/6和ICR小鼠1810009N02Rik CDS对应的2510022D24Rik DNA位置起始密码子发生ATG>ATT突变；

图8为1810009N02RikBLAT得到新转录本NM_026939的示意图；其中，A为1810009N02Rik BLAT结果，B为NM_026939转录本序列，C为NM_026939转录本对应的氨基酸序列；

图9为NM_026939Translate分析结果示意图；其中，A为NM_026939Translate获得的最长氨基酸序列，B为UCSC数据库NM_026939错误注释的CDS区，C为NM_026939Translate获得的最长CDS区；

图10为小鼠ASMTL基因CDS区扩增、测序、比对及翻译结果示意图；其中，A为小鼠ASMTL基因CDS区周围序列PCR扩增结果，B为PCR扩增产物Sanger测序峰图，C为实际扩增的CDS区与预测最长CDS区DNAman比对结果，D为实际扩增CDS区核苷酸序列及对应氨基酸序列；

图11为小鼠ASMTL蛋白结构域分析示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：现有信息检索

1.NCBI数据库中小鼠ASMTL基因信息混乱不清楚

首先在NCBI中检索小鼠ASMTL基因，如图1A所示，出现2510022D24Rik；然后，检索小鼠ASMTL基因的全称acetylserotonin O-methyltransferase，结果出现另一个基因1810009N02Rik(图1B)。

2.分析2510022D24Rik和1810009N02Rik

2510022D24Rik基因定位于小鼠X染色体-NC_000086.8(169090871..169098529,complement)，然而，其注释为serine/arginine repetitive matrixprotein 1；uncharacterizedprotein LOC66567(图2)，因此其是否为acetylserotonin O-methyltransferase-like待进一步研究。小鼠1810009N02Rik基因虽然注释为acetylserotonin O-methyltransferase-like并且标注定位于12号染色体，然而，其基因组信息缺失，并不知道1810009N02Rik基因的具体定位信息(图3)。

3.1810009N02Rik定位于X染色体2510022D24Rik位置

根据NCBI数据库提供的小鼠1810009N02Rik mRNA信息，利用UCSC(http://genome.ucsc.edu/)的BLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)工具将1810009N02Rik mRNA NM26939.1比对小鼠基因组，结果显示比对到染色体位置chrX:169090866-169094253，匹配序列共有10个block(图4A)。另外，用NCBI的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具比对结果为94.77％(图4B)，比对位置为X染色体(NC_000086.8)，这与2510022D24Rik基因位置重合，而且同样匹配上10个match。为了便于直观了解1810009N02Rik mRNA序列比对到小鼠基因组上的具体匹配情况及其与2510022D24Rik基因的位置关系，我们利用Snapgene软件进行可视化显示，结果如图4C所示，1810009N02Rik mRNA的10个block(标绿显示)基本上都比对到2510022D24Rik基因的外显子(标红显示)位置，这说明1810009N02Rik其实是来源于2510022D24Rik基因的一个转录本，而且，证明了NCBI标注其位于Chromosome 12是错误的。

实施例2：小鼠ASMTL基因的定位和转录信息

1.2510022D24Rik即为小鼠ASMTL基因

实施例1的分析结果已经证实1810009N02Rik是来源于2510022D24Rik基因的一个转录本，而且，NCBI上1810009N02Rik注释为acetylserotonin O-methyltransferase-like。进一步而言，2510022D24Rik却注释为serine/arginine repetitive matrixprotein 1，这一结果也是错误的：首先，在NCBI数据库中检索小鼠Srrm1(serine/argininerepetitive matrixprotein 1)，结果显示，Srrm1为小鼠已知的经过详细注释的独立基因，其位于Chromosome 4上(图5A)；进一步地，本发明对2510022D24Rik的基因组序列NC_000086.8进行BLASTN分析，结果显示，其与Srrm1(NC_000070.7)的Query Cover仅为44％(图5B)，这表明2510022D24Rik与Srrm1在序列上存在一定程度的相似性，但不应该注释为serine/arginine repetitive matrix protein1，而应该为acetylserotonin O-methyltransferase-like，2510022D24Rik即为小鼠ASMTL基因。

2.小鼠ASMTL基因转录信息更正

上述结果已证实2510022D24Rik就是小鼠ASMTL基因，然而，我们发现NCBI中2510022D24Rik的转录本XM_036162156CDS并不完整(图6A)，其缺失了起始密码子等部分上游序列，其编码的氨基酸序列也同样不完整(图6B)，这表明XM_036162156是ASMTL基因一个未研究清楚的转录本。本发明研究发现1810009N02Rik序列能比对上2510022D24Rik大部分外显子，1810009N02Rik是来源于2510022D24Rik的一个转录本，但是，进一步分析发现，1810009N02Rik mRNA(图7B)的起始密码子位置与2510022D24Rik DNA序列并不完全匹配，同样位置上2510022D24Rik为ATT，并非ATG(图7A)。我们初步推测这可能是不同品种的小鼠存在SNP造成的，于是，本发明分别对C57BL/6和ICR小鼠1810009N02Rik mRNA起始密码子附近对应的DNA序列进行了PCR扩增和Sanger测序，如图7C所示，结果两种小鼠都为ATT，这表明1810009N02Rik mRNA可能来源于2510022D24Rik DNA发生了SNP突变的其他小鼠。另外，本发明利用UCSC数据库将1810009N02Rik mRNA与小鼠基因组进行BLAT比对，结果在2510022D24Rik的同样位置上匹配到一个新的转录本NM_026939(图8A)，进一步分析发现，UCSC上的NM_026939序列没有起始密码子(图8B)，而其编码氨基酸也不是从Met开始的(图8C)。

本发明进一步利用ExPASy的Translate工具(https://www.expasy.org/resources/translate)分析NM_026939可能翻译的氨基酸序列，结果发现UCSC注释的氨基酸序列并非是最长的氨基酸序列，而是选择了一个较短的氨基酸序列(图9B)并且还多加了Met上游的一段(黑色虚线框出)，这也就是为什么对应的mRNA没有起始密码子的原因，这显然是错误的，真正的氨基酸序列应该是最长的(对应的CDS区也是最长的)，如图9A(红色框出)和C(红色突出显示)所示，共有104个氨基酸，起始密码子从NM_026939的第352个核苷酸开始。

实施例3：小鼠ASMTL基因CDS区扩增

上述研究证明了UCSC NM_026939的CDS区注释错误，本实施例进一步通过分子克隆来获得其实际的CDS区。

1.总RNA的提取

采集3只ICR小鼠的肝脏组织，将采取的组织迅速放入1.5ml EP管(DEPC水已处理过)投入液氮罐，然后保存在-80℃冰箱中。(1)试验开始前在高温条件下将所有玻璃器皿烤6h灭菌，用0.1％DEPC水将提取RNA所需的所有EP管、枪头等浸泡12-18h，121℃高压灭菌15min，在60℃的真空干燥箱中烘干备用。特别注意的是：提取RNA操作的所有步骤必须在RNA专用工作室及RNA专用超净工作台中进行，试验中用到的所有移液枪、枪头、等均为RNA专用，溶液的配置均需使用0.1％DEPC水；(2)提前打开低温高速离心机，使其4℃预冷；用DEPC水配制洗RNA用的75％乙醇并置于4℃冰箱中预冷；(3)从-80℃冰箱中取出样品后迅速称量(约0.05-0.1g)，使用液氮预冷的研钵进行组织研磨。研磨过程中需要持续间断的添加液氮，直至所有的块状组织研磨成粉末。然后用药匙将研磨好的组织；粉末转移至1.5ml的离心管(此过程要求快速准确)，加入1ml Ttrizol摇晃2～3min使充分裂解；(4)各样品中分别加入200μL氯仿，剧烈摇晃均匀，室温静置10min，12000r/min低温离心15min，4℃，吸上清；(5)加入等体积异丙醇，反复颠倒混匀，室温静置10min，12000r/min低温离心15min，弃上清，此时在管底可见沉淀；(6)加入500μL 75％的预冷酒精，小心清洗沉淀，7500r/min低温离心5min，弃乙醇；(7)重复步骤(6)一次；(8)将沉淀于放在通风处，挥发多余酒精，过程约12min，当沉淀由白色转变为近透明为止；再加入30μL DEPC水溶解沉淀，之后用NanoDrop检测总RNA纯度。

2.RNA的反转录

RNA去除基因组，取2μl 5×gDNA Eraser、1μl gDNA Eraser Buffer、1μl DEPC水、6μl RNA，将上述体系放入PCR仪中，42℃反应2min；再加入4μl

Buffer 2、1μl

RT Enzyme Mix I、1μl RT Primer Mix、4μl DEPC水，PCR仪中37℃反应20min，85℃反应5s，得到cDNA，-20℃保存。试剂盒PrimeScriptTMRT reagentKit withgDNAEraser(Perfect Real Time)购自Takara公司。

3.引物的设计与合成

针对小鼠ASMTL基因(NM_026939)，利用Primer Premier 6.0和Oligo 7.0软件设计引物，参数设置为长度在20-30bp之间，GC含量在50％左右，Tm值在60℃左右，TmDifference<1℃。上、下游引物跨最长CDS区。引物由北京生工生物有限公司合成。

具体信息如下：

小鼠ASMTL基因CDS区(SEQ ID NO.1)，具体序列如下：

ATGCTGCGCAGCCTGAGTGGGAAGCAGCACCGCGTCATCACCGGCGTCGCCATCGTCATCTGGGTCGGCTGTGAAGGCCCCACCCAGGAAGTGACGGCCTTCCACGAGGAGACGCGCTTGACGTTCTCGCCCCTTTCAGAGGAGCTGATCCGCGAGTACACGGCAGCGGTGAGGGCTGGGACAAGGCCGGGGCCTACGCCATCCAGGCGCGTGGCGCGATGCTGGTGCAGGGCGTGGCCGGCGACGTCCTCAACGCCGTGGGCTTCCCGCTCAACCGCTTCTGCCGCGAGCTCGCGCGGGTCCCGCCCACACGGACAGGAAGTGAGGAAGTGA

小鼠ASMTL基因CDS区编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，具体序列如下：

MLRSLSGKQHRVITGVAIVIWVGCEGPTQEVTAFHEETRLTFSPLSEELIREYTAAVRAGTRPGPTPSRRVARCWCRAWPATSSTPWASRSTASAASSRGSRPHGQEVRK

引物正义链(SEQ ID NO.3)，具体序列如下：

5'-CGTCACCCGGATTTCGCTGA-3'；

引物反义链(SEQ ID NO.4)，具体序列如下：

5'-AAGCCCTGTCGCCTGT-3'。

本发明设计了多组引物对，通过大量实验发现，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对对于小鼠ASMTL基因的特异性最强，扩增效率高，且引物的工作浓度较为合理。

4.RT-PCR

扩增体系为：高保真DNA聚合酶PrimeSTAR MAX DNA Polymerase(R045A，Takara)0.5μl，dNTP mix(2.5mM each)25μl，GC Buffer I(RR02AG，Takara)8μl，正义链引物1μl，反义链引物1μl，cDNA 2μl，11.5μl H2O。使用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

小鼠ASMTL基因NM_026939CDS区周围序列PCR扩增结果见图10A，扩增产物进行Sanger测序，测序峰图见图10B。如图10C所示，将实际扩增的CDS区(Lower line:DNAMAN1)与用ExPASy的Translate工具得到的最长CDS区(Upper line:DNAMAN2)进行DNAman序列比对，序列相似度为99.37％，实际CDS区(SEQ ID NO.1)对应的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)见图10D，共有110个氨基酸。

将上述获得的小鼠ASMTL基因NM_026939CDS区氨基酸序列利用SMART(SimpleModular Architecture Research Tool，http://smart.embl.de/)工具进行蛋白结构域分析，结果如图11所示，小鼠ASMTL基因编码的氨基酸序列含有哺乳动物ASMTL基因特有的典型结构域Maf(Pfam:PF02545)，进一步表明小鼠ASMTL基因CDS区扩增正确。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 小鼠ASMTL基因及其特异性引物对和检测试剂盒

<130> RYP2111191.6

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 333

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

atgctgcgca gcctgagtgg gaagcagcac cgcgtcatca ccggcgtcgc catcgtcatc 60

tgggtcggct gtgaaggccc cacccaggaa gtgacggcct tccacgagga gacgcgcttg 120

acgttctcgc ccctttcaga ggagctgatc cgcgagtaca cggcagcggt gagggctggg 180

acaaggccgg ggcctacgcc atccaggcgc gtggcgcgat gctggtgcag ggcgtggccg 240

gcgacgtcct caacgccgtg ggcttcccgc tcaaccgctt ctgccgcgag ctcgcgcggg 300

tcccgcccac acggacagga agtgaggaag tga 333

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Leu Arg Ser Leu Ser Gly Lys Gln His Arg Val Ile Thr Gly Val

1 5 10 15

Ala Ile Val Ile Trp Val Gly Cys Glu Gly Pro Thr Gln Glu Val Thr

20 25 30

Ala Phe His Glu Glu Thr Arg Leu Thr Phe Ser Pro Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Leu Ile Arg Glu Tyr Thr Ala Ala Val Arg Ala Gly Thr Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Thr Pro Ser Arg Arg Val Ala Arg Cys Trp Cys Arg Ala Trp Pro

65 70 75 80

Ala Thr Ser Ser Thr Pro Trp Ala Ser Arg Ser Thr Ala Ser Ala Ala

85 90 95

Ser Ser Arg Gly Ser Arg Pro His Gly Gln Glu Val Arg Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正义链

<400> 3

cgtcacccgg atttcgctga 20

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反义链

<400> 4

aagccctgtc gcctgt 16

Claims

1.分离的小鼠ASMTL基因，其特征在于，该基因的CDS区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.小鼠ASMTL基因编码的蛋白质，其特征在于，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.表达小鼠ASMTL基因的表达载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.表达小鼠ASMTL基因的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中外源转入了权利要求3所述的表达载体；

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌或者真核细胞。

5.权利要求1所述分离的小鼠ASMTL基因、权利要求2所述蛋白质、权利要求3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在褪黑素和/或其代谢产物相关的生理或病理研究中的应用。

6.权利要求1所述分离的小鼠ASMTL基因、权利要求2所述蛋白质、权利要求3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在制备预防或治疗褪黑素和/或其代谢产物相关的疾病的药物中的应用。

7.小鼠ASMTL基因CDS区的特异性引物对，其特征在于，引物正义链具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，引物反义链具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

8.一种用于检测小鼠ASMTL基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的特异性引物对。

9.权利要求7所述特异性引物对或权利要求8所述试剂盒在小鼠ASMTL基因检测中的应用。