CN108588193B - 猪plin1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用 - Google Patents

猪plin1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，提供了猪PLIN1基因克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用，公开了克隆猪PLIN1基因的两对引物，并以猪基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行回收、检测后进行混池测序，将猪PLIN1基因测序结果与公布的目标序列对比，确认是目标序列后与其他不同品种猪的DNA进行比对，判定多态性位点。本发明采用PCR的方法，成功的克隆了猪PLIN1基因的序列，进行单核苷酸多态性位点的检测，并用于品种的鉴定。

Description

猪PLIN1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猪PLIN1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用。
背景技术
中国自古以来都是养猪生产和猪肉消费的大国，猪肉在人们的日常生活中占据了及其重要的地位。人们不仅有很大的猪肉需求量，随着时代的不断发展，人们的消费水平和生活质量日益增长，对猪肉品质的要求也是愈来愈高。现如今，猪的育种方向在全世界都经历了高脂型猪肉向瘦肉型猪培育的转变，除了提高猪的繁殖性能、生长速度、肉的产量等，如何在猪育种方向和生产实践中，在“肉质量”和“肉产量”中取得平衡是当前生产优质猪领域的热点关注问题。猪是脂肪沉积型动物，脂肪含量是评定猪肉品质的重要指标，脂肪的分布与含量高低直接影响猪肉品质的优劣，肌内脂肪含量是猪肉品质的一个主要的决定因子，它与肉的嫩度、风味和多汁性等食用品质有极其密切的关联。通过改善肌内脂肪含量来改善猪肉品质，是目前猪肉质改良的主要方向之一。PLIN1基因与脂类代谢关系密切，它对脂肪中甘油三酯的代谢具有双向调控作用，它的磷酸化可促进甘油三酯水解，从而动员脂肪分解。
脂滴包被蛋白(perilipin,PLIN)是脂滴相关蛋白家族的核心成员之一。在20 世纪80年代晚期在大鼠附睾脂肪细胞的脂帽部分发现的一种可磷酸化蛋白，包被于脂滴外周表面。脂滴包被蛋白是定位于脂滴表面的高磷酸化的蛋白，被脂肪细胞和类固醇生成细胞内包裹。PLIN对脂肪中甘油三酯的代谢具有双向调控作用，它的磷酸化可促进甘油三酯水解，从而动员脂肪分解，同时也可通过阻止脂肪酶接近脂滴，降低基础状态下的脂解，因此被称为脂肪分解调控中的“分子开关”。脂滴包被蛋白合成于游离核糖体，由PLIN基因编码，其中人的PLIN基因定位于15q26，鼠的则定位于第7号染色体，根据结构可将其分为A、B、C、D共4种亚型，其中A含量最多，分子量为57kDa，在脂肪细胞和类固醇生成细胞中均有表达；B的分子量为46kDa，在两种细胞中有少量表达，C和D仅表达于类固醇生成细胞。随着脂肪分化成熟，PLIN在脂滴表面逐渐增加，包被相对成熟、体积较大的脂滴形成一道分子屏障，阻挡脂肪酶接触脂滴因而抑制脂肪分解。而当PLIN被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)磷酸化，该屏障被修饰而发生变化，从而使得脂肪酶接触并分解甘油三酯，因此PLIN磷酸化是控制脂肪分解反应的限速步骤。Brasaemle等报道，PLIN过表达使甘油三酯脂分解下降，导致甘油三酯(Triglyceride,TG)水平与对照组相比升高了6～30倍，另有研究表明这也可促使胆固醇的聚集，从而提高胆固醇的贮存量，可见其在胆固醇的代谢中的重要作用，故推测其在动脉粥硬化的发生中可能发挥重要的作用。诸多研究表明，PLIN蛋白在脂类代谢过程中扮演重要角色。PLIN1基因多态性对脂肪沉积有一定的影响。对外来猪PLIN1基因的研究表明，PLIN1基因多态性与猪的平均日增重、瘦肉率和背膘厚关联密切。
PLIN1基因在肥胖个体的脂肪组织中过量表达，且该基因的单核苷酸多态性与体脂重、低体重指数、肥胖风险以及总胆固醇水平关联。人的PLIN1基因定位于肥胖、糖尿病、高脂血症的易感基因的附近，对人类的脂代谢疾病具有调节作用。体内试验研究表明，虽然敲除PLIN基因的小鼠比野生型小鼠食物消耗量增多，但2种鼠的体重没有差异。敲除PLIN基因的小鼠还表现出组成型脂质水解、瘦的体型、小脂肪细胞构成的更小的脂肪垫。这些小鼠的氧消耗增加，对遗传性和食物诱导的肥胖具有抗性，同时，这些小鼠对脂解刺激物刺激的脂解表现出不敏感的反应。PLIN基因多态性与猪、牛、鹅、绵羊和鸭的胴体和脂肪性状有关。赵晓玲等研究发现，山地乌骨鸡腹脂中PLIN基因的发育性变化同皮脂厚的发育性变化呈极显著正相关，胸肌中PLIN基因的发育性变化同肌内脂肪含量的发育性变化呈极显著正相关。因此，推测PLIN基因在鸡脂肪性状形成中具有极重要的调控作用。虽然在人和其他动物上PLIN基因的生理功能较为清楚，但是关于猪PLIN基因功能的研究还并不多见。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了猪PLIN1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用，以不同品种猪PLIN1基因为目的基因，采用PCR和测序的方法，检测不同种猪PLIN1基因单核苷酸多态性位点，为PLIN1基因的功能研究提供基础资料，也为改善猪肉品质奠定基础。
本发明的技术方案为：一种猪PLIN1基因的克隆引物，所述引物为Exon3，包括正向引物和反向引物，序列如下：
正向引物F:GGGAAGGCACTGCTCTGG，
反向引物R:CTTCACTTGGCCCCACAG。
本发明还公开了另一种猪PLIN1基因的克隆引物，所述引物为Exon5，包括正向引物和反向引物，序列如下：
正向引物F:ATCCACCCTCACCGACCC，
反向引物R:GGATGCTTAACCCCCCGT。
本发明还公开了一种猪PLIN1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括：
a以猪基因组DNA为模板，利用Exon3或Exon5任一克隆引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
b对PCR扩增产物进行回收、检测，然后进行混池测序；
c将猪PLIN1基因测序结果与公布的目标序列对比，确认是目标序列后与其他不同品种猪的DNA进行比对，判定多态性位点。
进一步的，利用引物Exon3进行PCR扩增时，PCR扩增体系为25μL：2.5μ L 15mmol/L10×PCR Buffer，2.0μL 2.5mmol/L dNTPs，正反向引物各1.0μL， 1.0μL模板DNA，1.0μL5U/μL TaqE，13.5μL ddH2O；
PCR程序为：94℃预变性4min，之后进入PCR循环扩增，94℃变性40s， 56℃退火40s，72℃延伸50s，循环35次，最后72℃延伸10min；
利用引物引物Exon5进行PCR扩增时，PCR扩增体系为25μL：2.5μL 15 mmol/L 10×PCR Buffer，1.5μL 2.5mmol/L dNTPs，正反向引物各1.5μL，1.0μL 模板DNA，1.0μL 5U/μLTaqE，7μL ddH2O；
PCR程序为：94℃预变性5min，之后进入PCR循环扩增，94℃变性30s， 56℃退火30s，72℃延伸50s，循环35次，最后72℃延伸10min。
进一步的，所述猪的品种包括滇南小耳猪、枫泾猪、长白猪、大白猪、杜洛克、二花脸和藏猪。
进一步的，所述多态性位点为：在猪PLIN1基因外显子5中存在7个单核苷酸多态性位点，并引起氨基酸的变化：滇南小耳猪第5位点C→T突变，氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第158位点C→G突变，氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；大白猪第74位点 T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；二花脸第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；枫泾猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；长白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；
在猪PLIN1基因内含子4中存在5个单核苷酸多态性位点：滇南小耳猪256 位点T→C突变，二花脸中241位点G→A突变、256位点T→C突变，枫泾猪中241位点G→A突变、256位点上T→C突变。
本发明还公开了一种基于猪PLIN1基因外显子5中单核苷酸多态性位点鉴定猪品种的方法：
滇南小耳猪第5位点C→T突变，氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第158位点C→G突变，氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；大白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；二花脸第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；枫泾猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；长白猪第74位点T→C 突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸。
本发明还公开了一种前面所述鉴定方法使用的试剂盒，所述试剂盒包含有 Exon3或Exon5任一克隆引物。
本发明还公开了前面所述试剂盒在鉴定猪品种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明所采用的克隆引物，针对猪PLIN1基因特异性好。
2、本发明采用PCR的方法，成功的克隆了猪PLIN1基因的序列。这不仅说明了PCR在比较基因组学方面克隆基因上起到的重要作用，而且还可以继续通过序列测定的方法进一步研究猪PLIN1基因的序列变异、蛋白质性状和结构等不同的表达下对猪相关表型的影响。为猪PLIN1基因对脂类代谢和脂肪沉积调控作用的研究奠定基础，为改善猪肉品质奠定基础。
3、利用猪PLIN1单核苷酸多态性位点鉴定猪的品种，可以实现猪品种的准确、快速鉴定。
附图说明
图1为枫泾猪在在内含子5上突变的测序峰图；
图2为大白猪在在内含子5上突变的测序峰图；
图3中a和b均为大白猪在在外显子5上突变的测序峰图；
图4中a、b、c、d和e为滇南小耳猪在外显子5上突变的测序峰图；
图5为滇南小耳猪在外显子3上突变的测序峰图；
图6为长白猪和大白猪在内含子3上突变的测序峰图；
图7中a和b为不同品种猪外显子5上的突变序列比对图，a中自上到下每行依次为DN、大白猪、二花脸、枫泾、长白猪，b中自上到下每行依次为DN、大白猪、二花脸、枫泾猪、长白猪；
图8为不同品种猪内含子4上的突变序列比对图；
图9为PCR扩增后电泳胶图，其中a和b为Exon3引物扩增后电泳胶图，c 和d为Exon5引物扩增后电泳胶图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步地详述。
一种猪PLIN1基因的克隆引物，所述引物为Exon3，包括正向引物和反向引物，序列如下：
正向引物F:GGGAAGGCACTGCTCTGG，
反向引物R:CTTCACTTGGCCCCACAG。
一种猪PLIN1基因的克隆引物，所述引物为Exon5，包括正向引物和反向引物，序列如下：
正向引物F:ATCCACCCTCACCGACCC，
反向引物R:GGATGCTTAACCCCCCGT。
一种猪PLIN1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括：
a以猪基因组DNA为模板，利用Exon3或Exon5任一克隆引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
b对PCR扩增产物进行回收、检测，然后进行混池测序；
c将猪PLIN1基因测序结果与公布的目标序列对比，确认是目标序列后与其他不同品种猪的DNA进行比对，判定多态性位点。
进一步的，利用引物Exon3进行PCR扩增时，PCR扩增体系为25μL：2.5μ L 15mmol/L10×PCR Buffer，2.0μL 2.5mmol/L dNTPs，正反向引物各1.0μL，1.0μL模板DNA，1.0μL 5U/μL TaqE，13.5μL ddH2O；
PCR程序为：94℃预变性4min，之后进入PCR循环扩增，94℃变性40s， 56℃退火40s，72℃延伸50s，循环35次，最后72℃延伸10min；
利用引物引物Exon5进行PCR扩增时，PCR扩增体系为25μL：2.5μL 15 mmol/L 10×PCR Buffer，1.5μL 2.5mmol/L dNTPs，正反向引物各1.5μL，1.0μL 模板DNA，1.0μL 5U/μLTaqE，7μL ddH2O；
PCR程序为：94℃预变性5min，之后进入PCR循环扩增，94℃变性30s， 56℃退火30s，72℃延伸50s，循环35次，最后72℃延伸10min。
进一步的，所述猪的品种包括滇南小耳猪、枫泾猪、长白猪、大白猪、杜洛克、二花脸和藏猪。
进一步的，所述多态性位点为：在猪PLIN1基因外显子5中存在7个单核苷酸多态性位点(SNP位点)，并引起氨基酸的变化：滇南小耳猪第5位点C→T 突变，氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第158位点C→G突变，氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；大白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；二花脸第74位点T→C 突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；枫泾猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；长白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；
在猪PLIN1基因内含子4中存在5个单核苷酸多态性位点(SNP位点)：滇南小耳猪256位点T→C突变，二花脸中241位点G→A突变、256位点T→C 突变，枫泾猪中241位点G→A突变、256位点上T→C突变。
一种基于猪PLIN1基因外显子5中单核苷酸多态性位点鉴定猪品种的方法：
滇南小耳猪第5位点C→T突变，氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第158位点C→G突变，氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；大白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；二花脸第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；枫泾猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；长白猪第74位点T→C 突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸。
一种前面所述鉴定方法使用的试剂盒，所述试剂盒包含有前面所述Exon3 或Exon5任一克隆引物。
前面所述试剂盒在在鉴定猪品种中的应用。
1、实验材料
(1)实验猪种
本实施例实验中采用的样品是滇南小耳猪、枫泾猪、长白猪、大白猪、杜洛克、二花脸、藏猪各10头，由云南农业大学动物科学技术学院动物遗传育种实验室提供。
(2)主要仪器设备
本实施例实验所用的主要仪器设备见下表。
表1主要仪器设备
Figure BDA0001661554480000071
(2)实验药品及试剂
本实施例实验所用主要工具酶及试剂见表2。其他常规药品和试剂来自云南农业大学动物科学技术学院动物遗传育种与繁殖实验室。
表2实验所用工具酶及来源
Figure BDA0001661554480000072
Figure BDA0001661554480000081
2、实验方法
(1)猪基因组DNA的提取
本实验猪基因组DNA提取方法采用常规酚/氯仿抽提法进行提取，具体步骤如下：
1)取1块猪耳组织样(约10mg)置于1.5mL离心管内，用眼科手术小剪刀将其剪碎后放入37℃恒温中待酒精挥发30min。
2)向剪碎的耳组织样中加入650μL组织DNA提取液和18μL蛋白酶K(10 mg/mL)颠倒混匀30min后置于55-56℃的水浴中消化6-9h(最好放置过夜)，待到消化好时，可见离心管内的耳组织样清亮、均匀，且不见块状物。
3)向消化好的组织样中加入等体积的Tris-酚，轻轻摇动混匀10min后12000 r/min离心10min，吸其上清液约600μL置于另一1.5mL离心管内，注意尽量避免吸取白膜样物质。
4)向吸取的上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻摇混匀10min后12000r/min离心10min，吸上清液约500μL置于另一只1.5mL离心管内。
5)向吸取的上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻摇混匀10min 后12000r/min离心10min，吸其上清液约400μL，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒几次，可见白色DNA团出现，小心倒去无水乙醇，保留DNA团。
6)加入70％的乙醇清洗DNA团2次，清洗完毕倒置离心管，自然挥发2h。
7)加TE缓冲液200μL溶解DNA团，37℃水浴助溶过夜；68℃水浴约30min 灭活后，离心1-2min，-20℃长期贮存。
(2)PCR引物设计与合成
根据NCBI Ensembel网站上发表的序列(登录号：NC_010449)，使用PrimerPremier设计两对引物如下(1)Exon3：F:GGGAAGGCACTGCTCTGG，R: CTTCACTTGGCCCCACAG；(2)Exon5：F:ATCCACCCTCACCGACCC，R: GGATGCTTAACCCCCCGT。
(3)PCR反应体系
在进行PCR扩增前，需要对每一对引物的PCR反应体系进行预实验，根据预实验结果来确定适合的PCR反应体系。一般在保证模板DNA质量的条件下，主要针对退火温度进行调整，以优化整个PCR反应体系。本发明经过多次预实验摸索，最终确定PCR扩增体系如表3所示，并确定最终PCR扩增条件如表4。
表3PLIN1基因的PCR扩增体系
Figure BDA0001661554480000091
表4PLIN1基因的PCR扩增条件
Figure BDA0001661554480000092
实际实验中，整个过程必须在冰盒上操作。充分混匀，快速分装到各扩增 EP管中，逐一加入各样本DNA，再逐一加入容易失活的TaqDNA聚合酶，盖紧管盖、标号，离心后置于PCR扩增仪中扩增。
(4)进行琼脂糖凝胶电泳检测，步骤如下：
1)制胶：本实验所用为0.2％的琼脂糖凝胶。称取2g琼脂糖，加入100ml 1×TAE，于微波炉中加热溶解后，加入3μL EB，轻轻摇晃直至混匀，尽量避免气泡产生，事先在胶托中插好需要的梳子，待温度降至室温后慢慢地将溶解的琼脂糖倒入胶托中，制成厚度适宜的凝胶，待凝胶凝固后，将梳子垂直拔出，将凝胶放入泡胶池中，需要时取用即可。
2)加样：将制好的凝胶从泡胶池中取出放入电泳槽中，加入1×TAE没过点样孔。取2μl待检DNA溶液和2μl加样缓冲液混匀，在1％的琼脂糖凝胶上点样。
3)电泳：120V恒压20分钟左右
4)检测：将电泳后的凝胶置于紫外灯下观察条带情况，记录并拍照。
(5)PCR产物测序
将不同基因型的PCR产物进行回收、检测后送中美泰和(北京)生物技术有限公司进行混池测序。
3、结果与分析
(1)PLIN1基因PCR扩增结果
用所设计的PLIN1基因引物进行PCR扩增，经2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，特异性良好且片段大小与预期相符，符合PCR检测的要求，说明设计的引物特异性好，能够克隆出完整的PLIN1基因，为PLIN1基因的研究提供便利，电泳胶图见附图9。
(2)PLIN1基因测序结果
本发明将PLIN1基因测序结果用Chromas软件和DNAMAN 5.0软件分别与其他不同品种猪比对，不同品种猪的测序峰图见图1-6所示，序列比对见图 7-8。
结果显示，在PLIN1基因外显子5中检测到7个SNP位点，外显子5存在的突变位点引起氨基酸的变化：滇南小耳猪第5位点C→T突变，氨基酸由Pro (脯氨酸)→Leu(亮氨酸)，第74位点T→C突变，氨基酸由Leu(亮氨酸) →Pro(脯氨酸)，第158位点C→G突变，氨基酸由Pro(脯氨酸)→Arg(精氨酸)；大白猪第74位点T→C突变，氨基酸由Leu(亮氨酸)→Pro(脯氨酸)；二花脸第74位点T→C突变，氨基酸由Leu(亮氨酸)突变为Pro(脯氨酸)；枫泾猪第74位点T→C突变，氨基酸由Leu(亮氨酸)→Pro(脯氨酸)；长白猪第74位点T→C突变，氨基酸由Leu(亮氨酸)突变为Pro(脯氨酸)。
在PLIN1基因内含子4中检测到5个SNP位点：滇南小耳猪256位点T→C 突变；二花脸中241位点G→A突变、256位点T→C突变；枫泾猪中241位点 G→A突变、256位点上T→C突变。
(3)PLIN1基因同源性比对
不同物种DNA序列的相似性可能会意味着这些物种可能有着相似的功能，因此，通过多序列的比对找到其保守位点，可能会提示我们更容易的获取和了解该基因的功能和作用。通过NCBI和EBI，获得了猪、人、鼠、牛、羊基因的启动子序列、全长DNA序列和mRNA序列，对其进行的分析发现猪和人、鼠、牛、羊的氨基酸序列相似性分别为87％、83％、86％、86％。其氨基酸序列的相似性较高，编码325个氨基酸，包含大部分的编码区，可能有着相似的功能。
(4)蛋白质理化性质分析
通过ProtParam tool分析PLIN1基因外显子3蛋白质的分子式中蛋白质的分子式为C152H234N40O38S；分子量为3261.8D；理论等电点为10.45；氨基酸数为 27个氨基酸残基。在组分20种氨基酸中，丝氨酸(Ser)所占的比例最高，为 14.8％。
外显子5蛋白质的分子式为C267H419N81O73S2；分子量为5995.8D；理论等电点为11.7；氨基酸数为55个氨基酸残基。在组分20种氨基酸中，脯氨酸(Pro) 所占的比例最高，为21.8％。
(5)蛋白质跨膜区分析
通过TMHMM server v2.0对PLIN1基因蛋白进行跨膜区分析，结果表明， PLIN1基因不存在跨膜区。
(6)蛋白质信号肽分析
通过SignalP预测蛋白质信号肽，结果显示：S平均值(mean S-score)小于0.5。说明该蛋白质不属于分泌蛋白，不存在信号肽。
(7)蛋白质亚细胞定位
通过TargetP预测基因蛋白质亚细胞定位，结果表明外显子3的mTP值为 0.243、SP值为0.061、other值为0.749，说明该蛋白质的分泌途径为“-”型，即该蛋白质定位于其他细胞器。RC值即可靠性级别为3级，说明该预测的可靠性较高。外显子5的mTP值为0.773、SP值为0.016、other值为0.318，说明该蛋白质的分泌途径为“-”型，即该蛋白质定位于其他细胞器。RC值为3级,说明该预测的可靠性较高。
(8)蛋白质二级结构预测结果
通过APSSP对蛋白质二级结构预测表明猪PLIN1基因外显子3中蛋白质螺旋结构占37.04％，无规则卷曲结构占63.0％；外显子5中蛋白质螺旋结构占7.02％，无规则卷曲结构占93.0％。
(9)蛋白质超二级结构预测、蛋白质结构域、motif分析结果
用SAMRT服务器搜索PLIN1基因蛋白结构功能域，预测到PLIN1基因蛋白有9种高度保守的结构功能域：WAP、CTD、zf-3CxxC、CXC、DM、EGF Lam、 VWC out、TY、Amb V allergrn，他们相互间都有重叠区域。
根据NCBI dbSNP数据库统计，目前已发现人PLIN基因SNP位点有555 个，其中有十几个SNP位点目前被已证实与人肥胖、脂质代谢等疾病有密切关系。PLIN1基因多态位点与猪、牛、羊、鸭的胴体和脂肪性状相关，猪是典型的脂肪沉积型动物，大理石花纹、肌肉内脂肪含量、背膘厚是典型的脂肪沉积性状，这些性状的优劣直接影响肉产品品质，当肌肉内沉积适量脂肪时，其断面形成大理石花纹状，此时的肉品鲜嫩多汁。这说明在动物中PLIN1基因同样表现出丰富的多态性。PLIN1基因位于SSc7q11-14位点上，很多研究表明，7号染色体上存在影响脂肪性状的QTLs。机体的能量代谢主要来源于脂肪细胞的脂解，其主要反应是脂肪酸从甘油三酯(Triglyceride,TG)库释放后，通过血清蛋白的转运，从而到达机体的各个组织以满足机体的能量需要。以往研究认为，该脂解过程主要是由于蛋白激酶A(proteinkinase A,PKA)介导的激素敏感脂肪酶 (Hormone-sensitive lipase,HSL)的磷酸化实现的。然而最近几年研究证明，PLIN 磷酸化是HSL从胞浆移位至细胞内脂滴表面所必需的条件之一。PLIN是脂肪细胞内脂肪小滴包被蛋白中含量最多的一种，在脂肪组织，尤其是脂肪细胞内脂肪小滴在机体能量存储、消耗中有特殊地位。PLIN四种亚型中，PLIN A的作用是稳定储存在脂滴中的中性脂肪，抑制脂肪分解，而在活化状态则起到调节PKA 活化下的脂肪分解作用。本发明采用PCR的方法，成功的克隆了猪PLIN1基因的序列。这不仅说明了PCR在比较基因组学方面克隆基因上起到的重要作用，而且还可以继续通过序列测定的方法进一步研究猪PLIN1基因的序列变异、蛋白质性状和结构等不同的表达下对猪相关表型的影响。通过NCBI和EBI，获得了猪、人、鼠、牛、羊基因的启动子序列，对其进行分析发现猪和人、鼠、牛、羊的氨基酸序列相似性分别为87％、83％、86％、86％。不同物种DNA序列的相似性可能会意味着这些物种可能有着相似的功能，通过多序列的比对找到其保守位点，可能会提示我们更容易的获取和了解该基因的功能和作用。因此，可以推测猪PLIN基因可能对脂类代谢和脂肪沉积具有重要的调控作用。
本发明通过对猪PLIN1基因部分序列的克隆测序并分析滇南小耳猪、枫泾猪、长白猪、大白猪、杜洛克、二花脸、藏猪的PLIN1基因的多态性，发现外显子5和内含子4存在突变位点，外显子5存在的突变位点引起氨基酸的变化。对PLIN基因的多态性分析为其功能研究奠定了一定的基础。对进一步研究猪PLIN基因在脂类代谢和脂肪沉积及肉质中的生理作用具有重要的意义。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于猪PLIN1基因外显子5中单核苷酸多态性位点鉴定猪品种的方法，其特征在于：
滇南小耳猪第5位点C→T突变，氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，第158位点C→G突变，氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸；大白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；二花脸第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；枫泾猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸；长白猪第74位点T→C突变，氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸。
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