CN112760385B - 一种与肉牛肉用性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记及其应用。本发明利用PCR测序的方法检测草原红牛群体中ORL1基因全部外显子的SNP位点，结果发现草原红牛群体中OLR1基因仅外显子4存在A/G突变(Chr5：99812807bp处)，卡方检验证明该SNP位点在草原红牛群体中处于Hardy‑Weinberg平衡状态，遗传分析发现该基因的遗传纯合度为0.672、遗传杂合度为0.328、有效等位基因数为1.489，多态信息含量为0.274，属于中度多态。关联分析结果表明，OLR1基因外显子4基因型与草原红牛眼肌面积等肉用性状存在显著差异。

Description

一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

氧化型低密度脂蛋白受体OLR1最初由Sawamura T等人在牛主动脉内皮细胞中首次发现，并成功克隆牛内皮细胞OLR1。OLR1基因主要参与调控肝脏和乳腺中的脂代谢，通常在肺、肝和脂肪组织中呈高表达水平，但在心脏、卵巢等器官中的表达水平较低。研究表明敲除OLR1基因将抑制调节脂肪生成的关键酶活性，如：Acly、Acaca、Fasn和ELOVL6。牛OLR1基因位于5号染色体，由270个氨基酸组成，全长11306bp，共包含6个外显子，与人氨基酸序列相似性约72％。Liao CH等在小鼠脂肪组织中发现，当OLR1基因呈高表达水平时，能够优化胆固醇含量、游离脂肪酸摄入量和脂滴含量，说明OLR1与脂代谢相关。此外Sun C等以猪脂肪组织为研究对象，发现OLR1表达量与过氧化物酶体激活受体γ、细胞表面脂肪酸合成酶Fas受体以及结合转录因子1c的胆固醇调节元件相关，表明OLR1基因能够影响脂肪沉积，并参与调控相关基因转录。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记，所述SNP标记为OLR1基因外显子4存在A/G突变，位于Chr5：99812807bp处。

进一步地，所述SNP标记的扩增引物序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本发明还提供了上述的一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记的检测方法，以SEQID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，对牛基因组DNA进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；56-60℃退火30s；72℃延伸14s；共34个循环；72℃延伸5min；4℃保存；PCR扩增体系20μL：2×Taq MasterMix 10μL，DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O 8μL。

本发明还提供了如上述的一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记在肉牛肉用性状检测中的应用。

本发明还提供了如上述的一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记的检测方法在肉牛肉用性状检测中的应用。

进一步地，所述肉牛包括草原红牛。

进一步地，所述肉用性状包括失水率及眼肌面积及中的至少一种。

随着优良种牛和高品质牛肉需求的日益增加，分子育种技术在肉牛遗传改良过程中发挥了积极作用。氧化型低密度脂蛋白受体1(Oxidized lowdensity lipoproteinreceeptor,OLR1)参与调控肝脏和乳腺中的脂代谢，与甘油三酯储存及肥胖密切相关，推测其可能与肉牛品质具有一定的连锁关系。牛肉用品质受肌内脂肪含量影响，而肌内脂肪含量通常由遗传物质调控，如：氧化型低密度脂蛋白受体OLR1、脂肪酸结合蛋白(FABP7)、脂联素基因ADIPOQ以及过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子αPPARGC1A等系列候选基因，通过各种途径参与调控脂肪合成、脂代谢和脂肪沉积过程。基于OLR1基因在哺乳动物氧化型低密度脂蛋白降解以及脂肪细胞增殖过程中所发挥的重要作用，本试验旨在探究OLR1基因在草原红牛群体中的遗传变异水平及基因多态性与草原红牛肉用性状的相关性，为草原红牛品种改良和肉用性能的改善提供基础素材。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本试验利用PCR测序的方法检测草原红牛群体中ORL1基因全部外显子的SNP位点，结果发现草原红牛群体中OLR1基因仅外显子4存在A/G突变(Chr5：99812807bp处)，卡方检验证明该SNP位点在草原红牛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态，遗传分析发现该基因的遗传纯合度(Ho)为0.672、遗传杂合度(He)为0.328、有效等位基因数(Ne)为1.489，多态信息含量(PIC)为0.274，属于中度多态(0.25＜PIC＜0.5)。关联分析结果表明，OLR1基因外显子4基因型与草原红牛眼肌面积等肉用性状存在显著差异(P＜0.05)，研究结果可为草原红牛分子育种的实际应用提供参考标记。

附图说明

图1是：草原红牛OLR1基因第四外显子PCR扩增产物的电泳图；

图2是：OLR1基因第四外显子的核苷酸序列比对结果；

图3是：OLR1基因外显子4AA、AG、GG基因型测序峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记及其应用，本发明涉及的试验动物：本发明所使用的草原红牛样品全部来自吉林省农业科学院畜牧分院，随机选取58头健康的30月龄草原红牛，屠宰后采集肝脏、肌肉、脂肪等组织，用锡纸包好并迅速放入液氮中冻存，部分放入-80℃冰箱用于提取DNA。主要试剂及仪器：DNA提取试剂盒购买于Axygen公司；反转录试剂盒购买于TaKaRa公司；超微量分光光度计(Quawell-Q5000)购买于北京鼎盛生物技术有限责任公司；PCR仪(T100)购买于上海伯乐生命医学产品有限公司。具体如下实施例所示。

实施例1

1、基因组DNA提取

利用DNA试剂盒提取牛肝组织DNA样，具体操作步骤参照试剂盒自带说明书；利用Quawell-Q5000超微量分光光度计检测提取的DNA浓度及纯度；利用1％琼脂糖凝胶电泳检测D260nm/D280nm比值范围在1.9-2.1之间的样品完整度。

2、引物设计与合成

根据GenBank中发表的牛OLR1基因DNA序列(登录号：NC-037332.1)，以外显子1-6为目标，利用Primer Premier5.0软件设计引物，经苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示：

表1引物序列

3、PCR扩增及SNP位点检测

以牛肝组织DNA为模板，对OLR1基因的第一、二、三、四、五、六外显子进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；56-60℃退火30s；72℃延伸14s；共34个循环；72℃延伸5min；4℃保存。PCR扩增体系20μL：2×Taq MasterMix 10μL，DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O 8μL。

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，将符合预期片段大小的PCR产物送至苏州金唯智公司进行Sanger测序；利用DNAMAN和Chromas软件分析测序结果，根据显示的核苷酸序列和图谱寻找SNP位点进行基因分型。

统计分析

根据分型结果利用牛等家养动物群体遗传分析工具V1.0计算基因型频率、基因频率，计算遗传杂合度(He)、遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(Ne)。利用SPSS 19.0软件中One-Way ANOVA程序分析不同基因型与肉用性状相关性，结果以平均值±标注差表示，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

4、实验结果

利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，OLR1基因第四外显子的扩增片段长度为390bp，与预期片段大小相一致，如图1。

序列比对分析：经DNAMAN软件比对发现，OLR1基因第四外显子存在A/G突变(图2)，该位点的突变并未引起氨基酸序列发生改变。利用Chromas软件比对测序结果的波峰图，将与GenBank中牛OLR1基因具有相同序列的定义为AA和GG基因型，将具有套峰的碱基序列定义为AG基因型(图3)；其他5个外显子暂未发现突变。

实施例2

1、OLR1基因外显子4的遗传多样性

OLR1基因在草原红牛群体中AA、AG和GG基因型频率分别为：64.51％、27.59％、6.90％；A、G等位基因频率分别为79.31％和20.69％。AA基因型为优势基因型，A基因为优势等位基因。卡方适合性检验表明，草原红牛群体A/G位点符合Hardy-Wednberg平衡状态(P＞0.05)。OLR1基因第4外显子多态位点在草原红牛群体中的遗传纯合度(Ho)为0.672、遗传杂合度(He)为0.328、有效等位基因数(Ne)为1.489、多态信息含量(PIC)为0.274。计算结果表明OLR1基因第4外显子突变位点遗传杂合度(He)相对较低，说明其在草原红牛群体中的变异较小；多态信息含量为0.274(0.25＜PIC＜0.5)，表现其为中度多态，表明上述遗传标记能够提供遗传信息，具有统计学意义。

2、OLR1基因第四外显子不同基因型与草原红牛肉用性状的相关性分析

OLR1基因第四外显子不同基因型与草原红牛肉用相关性状见表2。由表2可知，OLR1基因第四外显子不同基因型与草原红牛部分肉用性状指标分别存在显著差异和极显著差异，其中AA基因型的失水率和眼肌面积均显著高于AG基因型(P＜0.05)，其余性状在不同基因型间均无显著差异(P＞0.05)。

表2草原红牛OLR1基因4外显子不同基因型与肉用性状的相关性

同行数据肩标不同大(小)字母表示差异(极)显著(P＜0.05,P＜0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P＞0.05)。

肉牛肉质通常与肌内脂肪含量有关，提高肌内脂肪含量有利于提高嫩度、大理石花纹丰富度，而氧化型低密度脂蛋白(OLR1)则能够影响脂肪沉积度。OLR1作为细胞表面主要受体，具有较为复杂的生物学功能特性，主要参与调控乳腺组织中葡萄糖和脂质代谢过程，此外OLR1不仅是乳品质等相关性状的候选基因，还与肉牛生长、脂肪沉积等肉质性状形成密切相关。脂肪中的OLR1不仅能够降解、结合、吞噬低密度脂蛋白，还可以与多种配体结合。

本试验在草原红牛OLR1基因外显子4处检测到A/G突变，且存在3种基因型和两种等位基因，突变位点的纯合度Ho(0.672)比例高于杂合度He(0.328)，说明该突变位点在草原红牛群体中遗传均匀性较高；多态信息含量呈中度多态说明，该位点具有较高的遗传变异水平，且该遗传标记多态性可提供一定遗传信息。

本试验中OLR1基因多态性，对失水率和眼肌面积等影响显著，说明AA和AG基因型是影响草原红肉牛用性状的关键基因型，且OLR1基因遗传多态性可能影响草原红肉牛质性状形成。

目前对OLR1基因的研究仍以人心血管疾病方面为主，而OLR1基因在家畜禽主要经济性状方面的研究报道较少。本试验发现，OLR1基因多态性与草原红牛部分肉用性状相关，以期为草原红肉牛质改良和寻找有效遗传标记提供参考依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林省农业科学院

<120> 一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> OLR1-4F

<400> 1

ggagtcctga gaggtgaac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> OLR1-4R

<400> 2

catgcacata tccagtggc 19

Claims (3)

1.一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记的检测方法，其特征在于：所述肉牛为草原红牛；所述SNP标记为OLR1基因外显子4存在A/G 突变，位于Chr5：99812807bp处；所述SNP标记的扩增引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，对牛基因组DNA进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；56-60℃退火30s；72℃延伸14s；共34个循环；72℃延伸5min；4℃保存；PCR扩增体系20μL：2×TaqMasterMix 10μL，DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O 8μL。

2.一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记在肉牛肉用性状检测中的应用；所述肉牛为草原红牛；所述SNP标记为OLR1基因外显子4存在A/G 突变，位于Chr5：99812807bp处；所述SNP标记的扩增引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述肉用性状为失水率及眼肌面积中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种与肉牛肉用性状相关的SNP标记的检测方法在肉牛肉用性状检测中的应用；所述肉用性状为失水率及眼肌面积中的至少一种。

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