CN115323061A - 猪肌内脂肪含量性状相关的adig基因单倍型变异遗传标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪肌内脂肪含量性状相关的ADIG基因单倍型变异遗传标记，利用现有的PCR和测序技术，在ADIG基因第四外显子上251bp处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)，在426bp处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)，两个突变紧密连锁，且发现此多态位点与猪肌内脂肪含量性状显著相关，为猪肌内脂肪含量性状的遗传标记辅助育种提供了一个新的单倍型遗传标记，对猪生长性状和肉质性状的研究有一定帮助。

Description

猪肌内脂肪含量性状相关的ADIG基因单倍型变异遗传标记及 应用

技术领域

本发明属于家畜遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种猪ADIG基因第四外显子变异作为肌内脂肪含量性状的遗传标记及应用。

背景技术

猪肉消费长期占我国肉类消费的60％左右，是城乡居民不可或缺的“肉盘子”产品。当前，随着社会经济发展和人民生活水平的不断提高，猪肉消费已由满足量的需求逐步转为量与质并举的多元化、优质化转变。因此，猪肉品质遗传改良已越来越被重视。肌内脂肪含量(Intramuscular Fat,IMF) 是影响肉品质性状的一项重要指标，它与猪肉的嫩度、风味、多汁性存在显著相关(Lu et al.2008)。然而，猪肉质性状较难活体测量，很难用常规育种技术进行遗传改良，因此寻找控制猪肉质性状(尤其是IMF)的关键分子遗传标记，应用于该性状的分子辅助育种，对提高猪肉品质性能具有重要意义。

脂肪生成素(Adipogenin,ADIG)是一种在脂肪组织中分泌的核蛋白因子，其在调控脂肪生理功能方面起着重要作用。它仅在脂肪细胞中表达，而不在基质血管细胞群中表达(Kim et al.,2005)。Liu等(2017)通过对牛肌卫星细胞的诱导分化发现，ADIG基因过表达可以促进肌卫星细胞转分化并增加其脂肪的积累。Zhang等(2021)在对云岭牛背最长肌的转录组分析中也发现，ADIG基因在脂肪细胞质膜中特异性表达，可以调节脂肪组织的分化与增殖。ADIG基因在体外的过表达会促进脂肪堆积，相反，敲减ADIG 基因则会抑制脂肪生成。然而，还未见有关猪ADIG基因对脂肪细胞的影响报道。

申请人前期利用RNA-seq技术对比分析了猪高低IMF极端个体背最长肌组织基因表达差异情况，发现ADIG基因在高低IMF个体背肌组织中显著差异表达。因此，申请人扩增了猪ADIG基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了遗传变异位点的筛选鉴定及与IMF性状的关联分析研究，以期获得与猪IMF性状相关的新分子育种标记。

发明内容

本发明的目的在于扩增猪ADIG基因的部分核苷酸序列，以寻找该序列突变位点多态性，获得一种与猪肌内脂肪含量性状相关的遗传标记，并利用该遗传标记辅助选择目标性状的猪，提高育种效率。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明获得了一种猪肌内脂肪含量性状相关基因ADIG的单倍型遗传标记，它是含猪ADIG基因第四外显子的DNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(长度为685bp)和SEQ ID NO：2(长度为 685bp)所示。在SEQ ID NO：1和第SEQ ID NO：2第251碱基处存在一个G>A碱基突变(如图3所示)，在该序列第426碱基处存在一个G>A碱基突变(如图4所示)。

第二方面，本发明还提供了一种用于获得上述遗传标记的引物对，该引物对为：

正向引物：5’-CCCCTTTCATCTCACAAC-3’(SEQ ID NO：3)

负向引物：5’-ACAATCTACCCAGGCTCT-3’(SEQ ID NO：4)。

第三方面，本发明还提供了一种上述遗传标记的获得方法，以硒都黑猪基因组DNA混合池为模板，采用以下引物对：

正向引物：5’-CCCCTTTCATCTCACAAC-3’(SEQ ID NO：3)

负向引物：5’-ACAATCTACCCAGGCTCT-3’(SEQ ID NO：4)

进行PCR扩增，PCR产物纯化及测序，得到如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

第四方面，本发明还提供一种利用上述遗传标记鉴定猪肌内脂肪含量性状的方法，包括如下步骤：

1)引物对的设计

根据猪ADIG基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010459.5) 设计以下引物对：

正向引物：5’-CCCCTTTCATCTCACAAC-3’

负向引物：5’-ACAATCTACCCAGGCTCT-3’；

2)PCR扩增

利用上述引物在硒都黑猪混合基因组DNA池中进行PCR扩增，PCR 反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含 Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶；

PCR的运行程序为：95℃预热2min；94℃变性20s，58℃退火40s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

3)PCR产物纯化及测序，得到如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列，根据序列峰形图进行单倍型基因分型。

根据测序结果筛查DNA序列变异，在251bp处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)，在426bp处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)，所述的遗传标记如图3和图4所示，利用以上两个突变位点组成的单倍型遗传标记在对硒都黑猪群中基因型检测。

最后，本发明还提供一种上述遗传标记和上述遗传标记的引物对在相关遗传标记辅助育种中的应用。在硒都黑猪群(来自湖北天之力优质猪育种有限公司)检测本发明获得的单倍型遗传标记与猪肌内脂肪含量性状的关联性。

通过PCR直接测序方法来进行基因分型检测，采用SPSS统计软件 (StatisticalPackage for the Social Sciences,Version 26.0)一般线性模型GLM 进行统计分析。所采用模型为：Yijklm＝μ+Gi+Aj+Xk+Sl+eijklm，其中：Yijklm 表示IMF值；μ表示群体均值；Gi表示基因型效应；Aj表示年季效应；Xk 表示性别效应；Sl表示父本效应；eijklm表示随机残差效应。结果以最小二乘均值±标准误表示，P<0.05判定为差异显著；P<0.01判定为差异极显著。

关联分析结果发现g.16433G>A和g.16608G>A紧密连锁，当ADIG基因全序列第16433bp处为GG纯合基因型时，第16608bp处也为GG纯合基因型；当ADIG基因全序列第16433bp处为AA纯合基因型时，第16608bp 处也为AA纯合基因型；而当ADIG基因全序列第16433bp处为杂合基因型时，第16608bp处也为GA杂合基因型。群体中只存在GG/GG、GA/GA、AA/AA等3种组合单倍型，且不同单倍型IMF性状差异极显著(P<0.01)。 AA/AA基因型个体IMF极显著高于GG/GG基因型个体，且IMF存在 AA/AA>GA/GA>GG/GG的趋势。综上，ADIG基因全序列第16433bp处的 A等位基因以及第16608bp处的A等位基因是IMF的优势等位基因，在育种中应予以保留携带这些优势等位基因的个体，有利于提高群体的肌内脂肪含量性状。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明利用现有的PCR和测序技术，在ADIG基因第四外显子上251bp 处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)，在426bp处存在一个G>A 碱基突变(即等位基因突变)，两个突变紧密连锁，且发现此多态位点与猪肌内脂肪含量性状显著相关，为猪肌内脂肪含量性状的遗传标记辅助育种提供了一个新的单倍型遗传标记，对猪生长性状和肉质性状的研究有一定帮助。

附图说明

图1为本发明的总体技术流程图；

图2为本发明中猪ADIG基因第四外显子PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道M是D2000Plus DNA Ladder，泳道B1、B2是扩增的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2特异基因片段；

图3为本发明中猪ADIG基因g.16433G>A的测序图谱，从上往下依次是GG纯合型、GA杂合型和AA纯合型；

图4为本发明中猪ADIG基因g.16608G>A的测序图谱，从上往下依次是GG纯合型、GA杂合型和AA纯合型；

图5为猪ADIG基因第四外显子片段核苷酸序列直观图(与上述SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的序列表相对应)，加粗带框字母代表存在突变处，突变位置分为位于该序列的第251碱基处和第426碱基处，带下划线序列代表引物位置。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1猪ADIG基因片段的获得及多态性检测方法的建立

1.猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为硒都黑猪，样本来源于湖北天之力优质猪育种有限公司。硒都黑猪是以恩施黑猪、梅山猪、湖北白猪等为基础，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北天之力优质猪育种有限公司等单位历经12年培育而成的黑猪新品种。猪基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作) 提取，具体步骤如下所述：

(1)采取猪背最长肌组织，放入2mL的离心管中，加入200μL裂解液TL，用枪头吹打均匀；

(2)加入20μL蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜；

(3)加入200μL结合液CB(试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置 10min；

(4)冷却后加入100μL异丙醇，剧烈颠倒充分混匀；

(5)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(6)加入500μL抑制物去除液IR(该试剂盒自带)，12000rpm离心 30s，弃废液；

(7)加入700μL漂洗液WB(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液；

(8)重复操作步骤7；

(9)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应；

(10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μL洗脱缓冲液EB(该试剂盒自带)，室温放置3-5min，12000rpm 离心1min，将溶液收集到离心管中；

(11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。

剩下肌肉样本封袋保存于干冰中，送至华中农业大学农业部种猪质量监督检验测试中心(武汉)用于IMF的测定。

2.猪ADIG基因第四外显子片段的获得

(1)PCR扩增

根据猪ADIG基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010459.5) 设计以下引物对：

正向引物ADIG-E4-F：5'CCCCTTTCATCTCACAAC 3'，

反向引物ADIG-E4-R：5'ACAATCTACCCAGGCTCT 3'。

利用上述引物在37个硒都黑猪混合基因组DNA池中进行PCR扩增， PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含 Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶。

PCR的运行程序为：95℃预热2min；94℃变性20s，58℃退火40s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

(2)PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化(按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液， 50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min 离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL 离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(Ph>7.0)，室温或37℃放置2-3min； 12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3.猪ADIG基因第四外显子片段变异位点的获得

将上述回收获得的DNA片段送到武汉奥科鼎盛生物科技有限公司采用ABI3730XL测序仪测序，发现了2个单碱基突变位点(图3和图4)，分别位于ADIG基因组核苷酸序列(即全序列)(GenBank NC_010459.5)的第16433bp处的G>A突变，以及第16608bp处的G>A突变，对应于本发明的ADIG基因片段的突变位点分别是：在SEQ ID NO：1是251bp处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)，在462bp处存在一个G>A碱基突变(即等位基因突变)；在SEQID NO：2是251bp处存处存在一个A>G 碱基突变(即等位基因突变)，在462bp处存在一个A>G碱基突变(即等位基因突变)，如图5所示。

4.分子标记基因分型

将待检测个体的DNA样本作为模板，按照以上步骤2所述方法进行猪 ADIG基因第四外显子序列片段的扩增，将获得的PCR纯化产物直接送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，直接从测序结果中读取基因分型结果。

实施例2本发明制备的遗传变异标记在猪IMF性状的关联分析中的应用

申请人在252头硒都黑猪群(来自湖北天之力优质猪育种有限公司) 检测本发明制备的两个分子遗传标记与猪IMF性状的关联性。

采用实施例1建立的PCR直接测序方法来进行基因分型检测，采用 SPSS统计软件(Statistical Package for the Social Sciences,Version 17.0)一般线性模型GLM进行统计分析。所采用模型为： Yijklm＝μ+Gi+Aj+Xk+Sl+eijklm，其中：Yijklm表示IMF值；μ表示群体均值；Gi表示基因型效应；Aj表示年季效应；Xk表示性别效应；Sl表示父本效应；eijklm表示随机残差效应。结果以最小二乘均值±标准误表示， P<0.05判定为差异显著；P<0.01判定为差异极显著。

关联分析结果如表1所示，发现g.16433G>A和g.16608G>A紧密连锁，当ADIG基因全序列第16433bp处为GG纯合基因型时，第16608bp处也为GG纯合基因型；当ADIG基因全序列第16433bp处为AA纯合基因型时，第16608bp处也为AA纯合基因型；而当ADIG基因全序列第16433bp处为杂合基因型时，第16608bp处也为GA杂合基因型。群体中只存在GG/GG、 GA/GA、AA/AA等3种组合单倍型，且不同单倍型IMF性状差异极显著 (P<0.01)。AA/AA基因型个体IMF极显著高于GG/GG基因型个体，且IMF 存在AA/AA>GA/GA>GG/GG的趋势。综上，ADIG基因全序列第16433bp 处的A等位基因以及第16608bp处的A等位基因是IMF的优势等位基因，在育种中应予以保留携带这些优势等位基因的个体，有利于提高群体的肌内脂肪含量性状。

表1 ADIG基因g.16433G>A和g.16609G>A单倍型与IMF性状关联分析

表1注：肩标不同小写字母表示同一行的数据之间差异显著，P<0.05；不同大写字母表示同一行的数据之间差异极显著，P<0.01。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>猪肌内脂肪含量性状相关的ADIG基因单倍型变异遗传标记及应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>682

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>1

<210>2

<211>682

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

cccctttcat ctcacaac 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

acaatctacc caggctct 18。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 猪肌内脂肪含量性状相关的ADIG基因单倍型变异遗传标记及应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 682

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 1

cccctttcat ctcacaactt atgacctctt tacaggagaa gaaaactgag tctctgaaag 60

ttagtgttac tcagccacat ggccagtaag tgacaggatt taattctaat gcaggttagt 120

ctggtgtcaa gatgcaggct cttaagtatt ttggatcata aatccaaact gttcctccct 180

aaatacccaa atttaaaagt attttagtga taatcacttc ctccatctcc ctctttctct 240

cctctcctcg cacagcacaa acgccaagaa ggaaccaaga taacctagtg aggtggggtt 300

gacatgaatc ctggaactgc atggcagggt gtttggagat tgtagcaggt tatgggcctt 360

taagtgacct cagtttctcc aaagagccca gactggatga agcatgaatt tagcccagca 420

gtaggcccac agttctatga ggtaagtggt accatggtcc cattctacac acaaaggaac 480

tgaagcccag agaggctatc catgagtcca aagtcacaca gagagtgaga atcttggatg 540

cccaattctg aatccagacc tctttcaatc acactacagt tgcttgaagt aggatcagga 600

cctgggaggt gctagtgaga gaggacagtc aagaacagaa gtggagagcc tgggtagatt 660

gtctagagcc tgggtagatt gt 682

<210> 2

<211> 682

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 2

cccctttcat ctcacaactt atgacctctt tacaggagaa gaaaactgag tctctgaaag 60

ttagtgttac tcagccacat ggccagtaag tgacaggatt taattctaat gcaggttagt 120

ctggtgtcaa gatgcaggct cttaagtatt ttggatcata aatccaaact gttcctccct 180

aaatacccaa atttaaaagt attttagtga taatcacttc ctccatctcc ctctttctct 240

cctctcctca cacagcacaa acgccaagaa ggaaccaaga taacctagtg aggtggggtt 300

gacatgaatc ctggaactgc atggcagggt gtttggagat tgtagcaggt tatgggcctt 360

taagtgacct cagtttctcc aaagagccca gactggatga agcatgaatt tagcccagca 420

gtagacccac agttctatga ggtaagtggt accatggtcc cattctacac acaaaggaac 480

tgaagcccag agaggctatc catgagtcca aagtcacaca gagagtgaga atcttggatg 540

cccaattctg aatccagacc tctttcaatc acactacagt tgcttgaagt aggatcagga 600

cctgggaggt gctagtgaga gaggacagtc aagaacagaa gtggagagcc tgggtagatt 660

gtctagagcc tgggtagatt gt 682

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccctttcat ctcacaac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acaatctacc caggctct 18

Claims (6)

1.一种猪肌内脂肪含量性状相关的ADIG基因单倍型变异遗传标记，其特征在于：其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该遗传标记的核苷酸序列的251bp处有一个G>A突变位点，该遗传标记的核苷酸序列的426bp处有一个G>A突变位点，两个突变位点完全连锁。

2.一种用于获得权利要求1所述遗传标记的引物对，其特征在于：该引物对为：

正向引物：5’-CCCCTTTCATCTCACAAC-3’

负向引物：5’-ACAATCTACCCAGGCTCT-3’。

3.一种权利要求1所述遗传标记的获得方法，其特征在于：以硒都黑猪基因组DNA混合池为模板，采用以下引物对：

正向引物：5’-CCCCTTTCATCTCACAAC-3’

负向引物：5’-ACAATCTACCCAGGCTCT-3’

进行PCR扩增，其获得的遗传标记为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

4.一种利用权利要求1所述遗传标记鉴定猪肌内脂肪含量性状的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)引物对的设计

根据猪ADIG基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010459.5)设计以下引物对：

正向引物：5’-CCCCTTTCATCTCACAAC-3’

负向引物：5’-ACAATCTACCCAGGCTCT-3’；

2)PCR扩增

利用上述引物在硒都黑猪混合基因组DNA池中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μMdNTPs、1U TaqDNA聚合酶；

PCR的运行程序为：95℃预热2min；94℃变性20s，58℃退火40s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

3)PCR产物纯化及测序，得到如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列，根据序列峰形图进行单倍型基因分型。

5.一种权利要求1所述遗传标记在猪肌内脂肪含量性状相关遗传标记辅助育种中的应用。

6.一种权利要求2所述遗传标记的引物对在猪肌内脂肪含量性状相关遗传标记辅助育种中的应用。

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