CN116162714A - Syk基因中与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SYK基因中与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记及应用，所述单倍型分子标记位于猪SYK基因第十五外显子中且序列如SEQ ID NO.1所示，所述单倍型分子标记包括：SEQ ID NO.1所示序列的第399bp处的G/C多态位点，第400bp处的C/A多态位点。本发明首次发掘了猪SYK基因中与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记，为猪肌内脂肪性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种猪SYK基因第十五外显子内与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记及其应用。
背景技术
肌内脂肪含量是猪肉品质的重要评定指标，肌内脂肪含量直接影响了猪肉口感和风味。肌内脂肪性状属于中等遗传力性状，遗传力在0.2-0.4之间，但由于肉质性状的活体测定较为困难，通过常规育种改良较为困难。因此寻找影响肉质性状的分子标记，通过常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以加快猪肌内脂肪性状的遗传改良。
MAS利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种，具有快速、准确、不受环境影响等优点，能够减少现场测定人员的工作量，且能缩短育种时限。单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中单个核苷酸的突变而引起的基因多态性，在基因组中广泛存在，常被通过MAS的方法应用于育种实践中，对重要性状的遗传改良具有关键作用。
SYK基因是编码非受体型Tyr蛋白激酶家族的一个成员。该蛋白在造血细胞中广泛表达，参与了转移酶活性、转移含磷基团和蛋白酪氨酸激酶活性等生物学过程，且参与细胞增殖、分化和吞噬。被认为是上皮细胞生长的调节剂和人类乳腺癌潜在的肿瘤抑制因子。目前对于SYK基因SNPs作为分子标记，特别是作为猪肌内脂肪性状相关的分子标记应用于筛选或预测具备优良肌内脂肪性状的猪品种还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了猪SYK基因中与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记，该分子标记可为猪肉质性状标记辅助选择提供参考依据。
本发明的技术方案具体如下：
猪SYK基因内与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记，该单倍型分子标记位于猪SYK基因第十五外显子内，且其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列的长度为700bp，该单倍型分子标记包括2个SNP位点：
SNP1位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第399bp处存在G/C多态性位点；
SNP2位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第400bp处存在C/A多态性位点。
本发明还提供了用于检测所述单倍型分子标记的检测试剂或试剂盒。
进一步地，在上述检测试剂或试剂盒中，包括用于扩增所述单倍型分子标记的引物对，其中引物对具体为：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物，核苷酸序列如SEQID NO.3所示的下游引物。
在上述试剂盒中，还可以包括PCR扩增用的常规试剂，还可以包括测序用常规试剂。
本发明还提供了所述单倍型分子标记或用于检测所述单倍型分子标记的试剂或试剂盒的应用，为如下A1)、A2)或A3)：
A1)鉴定或辅助鉴定猪肌内脂肪性状中的应用；
A2)猪育种；
A3)筛选高肌内脂肪含量猪品种。
本发明还提供了一种猪基因型的检测方法，其中单倍型为CC/AA、CG/AC和GG/CC基因型，检测方法为：检测待测猪基因组中对应于SEQ ID NO.1所示DNA分子第399bp和400bp处的核苷酸，如所述待测猪两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测猪为CC/AA单倍型；如所述待测猪两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测猪为GG/CC单倍型；如所述待测猪两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测猪为CG/AC基因型；
g1)对应于SEQ ID NO.1所示序列的第399bp处的核苷酸为C，第400bp处的核苷酸为A；
g2)对应于SEQ ID NO.1所示序列的第399bp处的核苷酸为G，第400bp处的核苷酸为C。
在上述方法中，待测猪共有3种单倍型：CC/AA、CG/AC或GG/CC；根据待测猪的单倍型与硒都黑猪肌内脂肪性状关联，其中单倍型CC/AA的肌内脂肪极显著高于CG/AC和GG/CC。
在上述方法中，以待测猪基因组为模板，采用引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1所示DNA分子，步骤2)所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
进一步地，在上述方法中，PCR扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增的体系为：共50μL，100ng模板DNA、10×buffer 4μL、上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶，ddH2O余量。
本发明还提供了利用所述单倍型分子标记进行猪育种方法，具体为：检测待测猪的单倍型组合，选择CC/AA单倍型猪进行育种。
本发明的有益效果：本发明发掘了位于猪SYK基因第十五外显子内与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记(rs3474158576和rs3472228547)，该单倍型分子标记可以作为猪肌内脂肪性状的分子标记，为猪肌内脂肪性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。
附图说明
图1是猪SYK基因中如SEQ ID NO.1所述的序列片段的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是本发明中猪SYK基因rs3474158576和rs3472228547位点的SANGER测序读取结果图；其中，A图为CC/AA单倍型，B图为CG/AC单倍型，C图为GG/CC单倍型。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪SYK基因片段的获得及多态性检测方法的建立
1、猪基因组DNA的提取。
本发明的试验猪品种为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和湖北天之力优质猪育种有限公司联合培育的硒都黑猪新品种。
采用北京擎科新业生物技术有限公司生产的动物组织基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)从猪耳缘组织中提取猪基因组DNA。
2、猪SYK基因片段的获得。
(1)PCR扩增：
根据猪SYK基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010456.5)设计以下引物对：
扩增SEQ ID NO.1序列上游引物：5’-ATCAAACCTGCGTCCTCACA-3’(SEQ ID NO.2所示)，
扩增SEQ ID NO.1序列下游引物：5’-CTGCCACCCAGACAAGAAAC-3’(SEQ ID NO.3所示)。
利用上述引物在硒都黑猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μMdNTPs、1U TaqDNA聚合酶。
PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(2)PCR产物纯化：采用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。
3、将纯化回收后的PCR产物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行SANGER测序，以检测分子标记。
经检测，PCR产物的长度为700bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，且其琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
实施例2分子标记在硒都黑猪中的多态性分布检测
本实施例按照实施例1建立的方法在硒都黑猪中检测猪SYK基因第十五外显子rs3474158576位点(即SEQ ID NO.1所示序列的399bp处)和rs3472228547位点(即SEQIDNO.1所示序列的400bp处)的多态性，检测结果如表1和图2所示。
表1SYK基因rs3474158576和rs3472228547位点在硒都黑猪中的基因型频率和等位基因频率
表1结果表明：在硒都黑猪中SYK基因rs3474158576和rs3472228547位点表现为CC/AA、CG/AC或GG/CC三种单倍型；其中GC等位基因频率为0.51，是优势等位基因。
实施例3分子标记与猪肌内脂肪性状的关联分析及应用
为了确定猪SYK基因rs3474158576和rs3472228547位点与猪肌内脂肪差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析猪SYK基因rs3474158576和rs3472228547位点的不同基因型与猪肌内脂肪性状的相关性。
采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Fj+eij；
式中，Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表CC/AA、CG/AC和GG/CC单倍型，显性效应用1，-1和1分别代表CC/AA、CG/AC和GG/CC单倍型)；Fj为猪场综合效应；eij为残差效应。
在硒都黑猪中进行不同基因型与肌内脂肪性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示：
表2-SYK基因rs3474158576和rs3472228547位点与猪肌内脂肪性状的关联分析
注：A和B表示差异极显著(P<0.01)，**表示差异显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)。
由表2可以看出：在硒都黑猪中，rs3474158576和rs3472228547位点的CC/AA单倍型的肌内脂肪极显著高于CG/AC单倍型和GG/CC单倍型(P<0.01)。但在该群体中GC等位基因是优势等位基因，因此，在育种中应予以保留携带CC/AA单倍型的个体，从而有利于提高群体的肌内脂肪含量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.SYK基因中与猪肌内脂肪性状相关的单倍型分子标记，其特征在于，所述的单倍型分子标记位于猪SYK基因第十五外显子内，所述的单倍型分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，该序列的长度为700bp，所述的单倍型分子标记包括2个SNP位点：
SNP1位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第399bp处存在G/C多态性位点；
SNP2位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第400bp处存在C/A多态性位点。
2.用于检测权利要求1所述单倍型分子标记的检测试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的检测试剂或试剂盒，其特征在于，包括用于扩增权利要求1所述单倍型分子标记的引物对，所述引物对具体为：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物。
4.如权利要求1所述的单倍型分子标记或如权利要求2或3所述的检测试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定猪肌内脂肪性状中的应用。
5.如权利要求1所述的单倍型分子标记或如权利要求2或3所述的检测试剂或试剂盒在猪育种中的应用。
6.如权利要求1所述的单倍型分子标记或如权利要求2或3所述的检测试剂或试剂盒在筛选高肌内脂肪含量猪中的应用。
7.一种猪基因型的检测方法，其特征在于，单倍型为CC/AA、CG/AC和GG/CC基因型，所述检测方法为：检测待测猪基因组中对应于SEQ ID NO.1所示DNA分子第399bp和400bp处的核苷酸，如所述待测猪两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测猪为CC/AA单倍型；如所述待测猪两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测猪为GG/CC单倍型；如所述待测猪两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测猪为CG/AC基因型；
g1)对应于SEQ ID NO.1所示序列的第399bp处的核苷酸为C，第400bp处的核苷酸为A；
g2)对应于SEQ ID NO.1所示序列的第399bp处的核苷酸为G，第400bp处的核苷酸为C。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以待测猪基因组为模板，采用引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1所示DNA分子，其中引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
10.一种猪育种方法，其特征在于，按照权利要求7～9任一权利要求所述的方法检测待测猪的单倍型组合，选择CC/AA单倍型猪进行育种。
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|---|---|---|---|---|
| KR20100070511A (ko) * | 2008-12-18 | 2010-06-28 | 대한민국(농촌진흥청장) | 돼지 근내 지방 함량에 관여하는 표지 인자 및 이를 이용한종돈의 선발 방법 |
| CN114107518A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-01 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种猪eepd1基因第八外显子变异作为肌内脂肪含量性状的遗传标记及应用 |
| CN114959066A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-08-30 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种影响猪肌内脂肪含量性状的分子标记及应用 |
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2022
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|---|
| "Primary_assembly 14_ 2, 160, 407-2, 160, 507 - Variant table - Sus_scrofa", EMBL, pages 1 - 6 * |
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