CN114369670B - 一种位于srebf2基因的与番鸭性早熟性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种位于SREBF2基因的与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记及应用，涉及生物技术领域；所述分子标记为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4；所述SNP1位于SEQIDNO:1所示序列的68bp，碱基为C或T；所述SNP2位于SEQIDNO:1所示序列的409bp，碱基为T或C；所述SNP3位于SEQIDNO:1所示序列的415bp，碱基为G或A；所述SNP4位于SEQIDNO:1所示序列的636bp，碱基为G或A。本发明发现了SREBF2基因的4个SNP位点，并将其与番鸭性早熟性状关联分析，为分子标记辅助选择提供新的SNP分子标记。

Description

一种位于SREBF2基因的与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标 记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种位于SREBF2基因的与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记及应用。

背景技术

繁殖性能与番鸭的饲养成本息息相关，番鸭产蛋量越高，意味着饲养成本更低，能够带来更高的经济价值。同时番鸭蛋也是非常好的蛋白质商品，番鸭蛋富含钙、锌和铁，更适合用于烘焙。开产日龄、产蛋量、蛋重和受精率等是番鸭繁殖性能的关键指标，繁殖性状作为复杂的微效多基因控制的数量遗传性状，不仅受到许多基因的调控，还受到饲养条件等环境因素的影响。多个繁殖性能指标中，开产日龄的遗传力较高，规模化养殖能够很好的控制饲养环境以便符合番鸭的生理需求，从基因上进行改良能够带来更好的效果。开产日龄早代表着性早熟，性早熟个体在饲养周期内更早的进入产蛋高峰，产蛋周期内产生更多的种蛋，带来更高的经济价值。而开产日龄晚则意味着性晚熟，会导致受精率降低，产蛋高峰持续时间短，较早的进入衰退期，不利于产蛋周期内种蛋的获取。因此在育种过程中，根据开产日龄进行选择有利于提高番鸭的繁殖性能。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指基因组水平上由于随机的某个单核苷酸的变异引起的DNA序列的多态性，广泛存在于动植物基因组中。基因外显子和内含子的SNP可能会影响基因转录调控，转录本剪接，蛋白质翻译和剪辑修饰等，从而影响基因的表达效率，进而对表观性状产生影响。因此SNP定位表型性状后，可作为分子标记用于分子标记辅助育种选择。

目前可用于番鸭育种选择，尤其是对于繁殖性状育种选择的分子标记较少，大大限制了番鸭繁殖性能的育种进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种位于SREBF2基因的与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现了SREBF2基因的4个SNP位点，并将其与番鸭性早熟性状关联分析，为分子标记辅助选择提供新的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记，所述分子标记为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4；所述SNP1位于SEQ ID NO:1所示序列的68bp，碱基为C或T；所述SNP2位于SEQ ID NO:1所示序列的409bp，碱基为T或C；所述SNP3位于SEQ ID NO:1所示序列的415bp，碱基为G或A；所述SNP4位于SEQ ID NO:1所示序列的636bp，碱基为G或A。

进一步地，所述SNP1的基因型为CC、TT或CT；所述SNP2的基因型为TT、CC或TC；所述SNP3的基因型为GG、AA或GA；所述SNP4的基因型为GG、AA或GA。

本发明还提供一种利用的SNP分子标记鉴别番鸭性早熟性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测番鸭基因组DNA，进行PCR扩增，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的扩增产物；

(2)对所述扩增产物测序；

(3)上述的SNP1、SNP2、SNP3和SNP4组成单倍型块，当所述单倍型块的基因型为AATT/AATT，则番鸭开产日龄早。

进一步地，在步骤(1)中，所述PCR扩增的引物对序列为SEQ ID NO:2-3所示序列。

进一步地，在步骤(1)中，扩增体系为：金牌Mix 25.6μL、上游引物1.2μL、下游引物1.2μL、DNA2μL。

进一步地，在步骤(1)中，扩增反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸20s，30个循环；72℃彻底延伸2min；4℃保存。

本发明还提供一种鉴别番鸭性早熟性状的试剂盒，包含上述的引物对。

本发明还提供上述的与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记或试剂盒在番鸭遗传育种中的应用。

进一步地，所述番鸭遗传育种为选育开产日龄早的番鸭品种。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分析SREBF2基因，发现4个SNP位点：SNP1(C42404486T)、SNP2(T42404145C)、SNP3(G42404139A)和SNP4(G42403918A)。通过GLM模型分析，发现SNP1、SNP2和SNP3与开产日龄显著相关(P<0.05)。SNP1-4之间出现连锁现象，可组成一个单倍型块，可分为两种单倍型：GGCC(0.696)和AATT(0.299)。单倍型块与开产日龄关联显著(P<0.05)，GGCC/GGCC型番鸭开产日龄显著晚于GGCC/AATT和AATT/AATT型，AATT/AATT型开产最早，因此，AATT/AATT可作为分子标记用于育种选择，提高番鸭57周龄产蛋量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为57周龄产蛋量适合性诊断；

图2为开产日龄对57周龄产蛋量的适合性检验，其中EP＝57周龄产蛋量；AFE＝开产日龄；

图3为57周龄产蛋量与开产日龄的线性拟合，其中EP＝57周龄产蛋量；AFE＝开产日龄；

图4为SNP分型与峰图；

图5为单倍型块及单倍型频率，其中A：SNP1、SNP2、SNP3和SNP4组成一个单倍型块；B：单倍型及其频率。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1材料与方法

1.1动物样品

选取736只60周龄左右的雌性白番鸭(两个批次，来自广东温氏南方家禽育种有限公司仁马种鸭场)。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。记录选择群体的家系信息和开产日龄、每日产蛋量、总产蛋数以及产蛋合格数等繁殖性状。

1.2主要仪器

BIO-RAD T100 PCR仪(品牌：BIO-RAD；货号：1861096；美国伯乐)、北京六一DYCP-31DN核酸电泳仪(品牌：北京六一；货号：413-1402；北京六一生物科技有限公司)。

1.3主要试剂

动物基因组DNA提取试剂盒(品牌：擎科；货号：TSP201-50；北京擎科生物科技有限公司)、金牌Mix(含染料)(品牌：擎科；货号：TSE102；北京擎科生物科技有限公司)、DNAmarker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。

2实验方法

2.1引物设计

根据Ensembl(https://asia.ensembl.org/index.html)公布的番鸭(domestictype)(Cairina moschata domestica)基因组(GCA_009194515.1)注释的SREBF2基因(ENSCMMG00000001445)，使用DNAstar 11PrimerSelect设计引物，由北京擎科生物科技有限公司进行引物合成。引物序列如表1所示。

表1 PCR扩增引物序列

2.2血液基因组DNA提取

参照动物基因组DNA提取试剂盒操作手册提取血液基因组DNA。

2.3 SREBF2基因外显子序列的PCR扩增

以上述736只白番鸭半同胞个体的血液基因组DNA为模板配制PCR扩增反应体系(表2)。反应程序如表3所示。反应完成后，由北京擎科生物科技有限公司提供Sanger测序服务。

表2反应体系

表3反应程序

SREBF2的PCR扩增产物基因序列(SEQ ID NO:1)：

CTGTCTCTTCTGGTGCAGGTAAACTTCCCTCCAGCTCCGCTTACTCTGGCTTGCACATGGCCCTGTGCGCCGTGAATCTGGCCGAGTGCGCGGAAGAAAAGATCCCCCCCAGCACCATGGCCGAAATCCACCTGACGGCCGCCGTTGGCTTGAAGACCCGCTGCGGGGGCAAGCTGGGCTTCCTGGCGGTGAGTGATGGAGTCCTCTGCACCTCCAGGCAGAGCTCTGGGAAGGGCTGCGAGCAGCCACAGCGCCTCTGTTAGCGCTGCTGTTCTGCAGCCTGCAGCCCTGGTCCCTGGTGGTGTGTCTTTCCCTGGGTGCTGTTCTCAGCCCTCGTCTCTCCCTTCCCTAGAGCTACTTCCTGAGCCAGGCTCAGAGCCTGTGCAGCTCGGAGCGCAGCGCCATCCCTGACTCGCTGCGCTGGCTGTGCCACCCCCTGGGACAGAAGTTTTTTGTGGAGCGAAGCTGGACGGTGAAGTCTGCTGCCAAGGAGAGCCTGTACTGCACCCAGAGGAACCCTGGTGAGAGCCGCTCGTGCTCTGGCTGCACGGCCTCTCTGTGCTGTGTTTGCCCTGATAATTAGTAAATCTGATGGCTGATAGTTAGTAAAACCTGTTGTTAAAAAGGCCTTCAAAGCTCGGTCTTCAGAAGTCTTTGCAGTAATTCCCTCAGGAATTTCCCTCTACCGCTCTTCCTCTTGCTCCTAAAATGGGATTCTTCGTTACAGCTGCCCTTGTCTCTATCAGGAGGCGTGGCTGCCACTGCAGATAAGAAAAACAGTTTGTTTTCTTTCTCTGTAGCGGATCCCATTGCACAAGTTCATCAGGCGTTCTGTGAGAACCTGCTGGAGAGAGCTGTGGATTCACTTGTGAAACCTCAGACTCGGAAAGAGGTGGTGGGACAAGAGGAGGAGGAACAGTGGT.

2.4SNPs确定与基因分型

随机从736只番鸭中抽取30只番鸭的基因组DNA等量混合作为检测SNP位置的模板。利用SnapGene4.3.6软件对PCR扩增产物的Sanger测序结果进行比对处理，查找SNP位点，通过SNP点的碱基峰图进行基因分型。

2.5基因型与繁殖性状的关联分析

利用plink1.9软件进行SNP与表型数据GLM模型的关联分析。模型为：

Y_ij＝μ+αG_i+βB_j+e_ij

Yij表示表型值向量；μ表示随机的效应向量；α为SNP效应系数；Gi为SNP基因型；β协变量批次效应系数；Bj为批次效应；eij为残差矩阵。

使用plink1.9软件进行基因频率和大地温伯格平衡(HWE)计算，使用Haploview4.6进行单倍型分析，用PHASE2.1进行基因型填充和单倍型分型，分型完成后按照上述GLM模型进行关联分析。

3结果

3.1产蛋量与开产日龄呈负相关

开产日龄与57周龄产蛋量相关性显著(P<0.0001)(表5)。通过开产日龄与产蛋量的线性回归分析，发现57周龄产蛋量与开产日龄呈负相关(图1-3)，即“57周龄产蛋量＝310.87-0.7053×开产日龄”(P<0.0001)，意味着开产日龄早，产蛋量高。

表4产蛋量与开产日龄的统计描述

表5 57周龄产蛋量与开产日龄Pearson相关性检验

3.2 SREBF2基因的的4个SNP

利用表1中引物进行PCR扩增，获得923bp的PCR产物，包含SREBF2基因的第11外显子、11内含子、12外显子、12内含子和13外显子序列，共4个SNP位点(图4)：SNP1(C42404486T)、SNP2(T42404145C)、SNP3(G42404139A)和SNP4(G42403918A)(表4)。4个SNP位点皆处于哈迪温伯格平衡状态(P>0.05)(表5)。

3.3 SNP位点与繁殖性状的关联

通过GLM模型分析，SNP1、SNP2和SNP3与开产日龄显著相关(P<0.05)(表6)。SNP1-4之间出现连锁现象(表7)，可组成一个单倍型块(图5A)，可分为两种单倍型：GGCC(0.696)和AATT(0.299)(图5B)。单倍型块与开产日龄关联显著(P<0.05)，GGCC/GGCC型番鸭开产日龄显著晚于GGCC/AATT和AATT/AATT型，AATT/AATT型开产最早(表8)，因此，AATT/AATT可作为分子标记用于育种选择，提高番鸭57周龄产蛋量(总产蛋量)。

表6 SNP基本信息

表7哈迪温伯格平衡

表8开产日龄与SNP关联

N表示观测用于分析的个体数；BETA表示回归系数；STAT表示T统计量；

表9 SNP之间相关系数

表10单倍型块与开产日龄关联

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种位于SREBF2基因的与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 923

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtctcttc tggtgcaggt aaacttccct ccagctccgc ttactctggc ttgcacatgg 60

ccctgtgcgc cgtgaatctg gccgagtgcg cggaagaaaa gatccccccc agcaccatgg 120

ccgaaatcca cctgacggcc gccgttggct tgaagacccg ctgcgggggc aagctgggct 180

tcctggcggt gagtgatgga gtcctctgca cctccaggca gagctctggg aagggctgcg 240

agcagccaca gcgcctctgt tagcgctgct gttctgcagc ctgcagccct ggtccctggt 300

ggtgtgtctt tccctgggtg ctgttctcag ccctcgtctc tcccttccct agagctactt 360

cctgagccag gctcagagcc tgtgcagctc ggagcgcagc gccatccctg actcgctgcg 420

ctggctgtgc caccccctgg gacagaagtt ttttgtggag cgaagctgga cggtgaagtc 480

tgctgccaag gagagcctgt actgcaccca gaggaaccct ggtgagagcc gctcgtgctc 540

tggctgcacg gcctctctgt gctgtgtttg ccctgataat tagtaaatct gatggctgat 600

agttagtaaa acctgttgtt aaaaaggcct tcaaagctcg gtcttcagaa gtctttgcag 660

taattccctc aggaatttcc ctctaccgct cttcctcttg ctcctaaaat gggattcttc 720

gttacagctg cccttgtctc tatcaggagg cgtggctgcc actgcagata agaaaaacag 780

tttgttttct ttctctgtag cggatcccat tgcacaagtt catcaggcgt tctgtgagaa 840

cctgctggag agagctgtgg attcacttgt gaaacctcag actcggaaag aggtggtggg 900

acaagaggag gaggaacagt ggt 923

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtctcttc tggtgcaggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accactgttc ctcctcctct 20

Claims (1)

1.一种与番鸭性早熟性状相关的SNP分子标记在选育开产日龄早的番鸭品种中的应用，其特征在于，所述分子标记为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4组成的单倍型块；所述SNP1位于SEQ ID NO:1所示序列的68bp，碱基为C或T；所述SNP2位于SEQ ID NO:1所示序列的409bp，碱基为T或C；所述SNP3位于SEQ ID NO:1所示序列的415bp，碱基为G或A；所述SNP4位于SEQID NO:1所示序列的636bp，碱基为G或A；当所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4依次为T、T、A和A时，为开产日龄早的番鸭品种。

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