CN116334235B - 与鸡屠体性状相关的serca2基因分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与鸡屠体性状相关的SERCA2基因分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，包括突变位点SNP1‑SNP4，所述SNP1‑SNP4分别为：NC_052546.1：g.5345294G>A，NC_052546.1：g.5345224G>A，NC_052546.1：g.5345007T>C，NC_052546.1：g.5344870T>A。利用上述分子标记检测麻黄鸡的基因组DNA，经过试验发现，上述4个SNP位点与麻黄鸡的屠体性状呈显著相关。因此，可以通过利用这些分子标记来选育屠体性状优良的麻黄鸡品系，使选育更加高效。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及与鸡屠体性状相关的SERCA2基因分子标记及其应用。
背景技术
鸡肉作为仅次于猪肉的第二大肉类消费品，具有维生素含量丰富，蛋白质含量高，脂肪含量低等特点，深受广大消费者的喜爱。肉鸡的生产性能包括屠宰性能和生长性能，其中屠宰性能主要包括活体重、腿肌率、胸肌率、半净膛率、全净膛率等指标。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是一种常见的动物可遗传变异，广泛存在于动物基因组中，占所有已知多态性的90％以上。具有稳定遗传，易于检测等特性。在动物生产实践中，SNP可用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assist Selection，MAS)从而突破传统育种的瓶颈来提高选种的准确性和目标性状的选育效果。
肌浆/内质网钙离子ATP酶2(sarcoplasmic/endoplasmic reticulumcalciumATPase2，SERCA2)是镶嵌于膜上的P型ATP酶，可通过水解ATP介导胞质Ca2+逆浓度梯度向肌浆网和内质网等细胞器的腔内转运。SERCA2可改善由氧化应激引起的肌无力和肌肉萎缩。此外，SERCA2活性的降低可导致内质网应激，诱发线粒体功能障碍和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，进而引起肌营养不良症。目前，SERCA2基因在鸟类中的具体作用少有报道，尤其是在鸡上的研究更少。
发明内容
本发明的目的是提供与鸡屠体性状相关的SERCA2基因分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，发现SERCA2基因序列上的SNP位点，并将其与麻黄鸡的屠体性状关联分析，为MAS提供新的SNP分子标记。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供与鸡屠体性状相关的分子标记，所述分子标记位于鸡SERCA2基因上；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核苷酸序列包括突变位点SNP1、SNP2、SNP3和SNP4；所述SNP1为NC_052546.1：g.5345294G>A，所述SNP2为NC_052546.1：g.5345224G>A，所述SNP3为NC_052546.1：g.5345007T>C，所述SNP4为NC_052546.1：g.5344870T>A。
优选的是，所述SNP1存在基因型GG、GA和AA；所述SNP2存在基因型GG、GA和AA；所述SNP3存在基因型TT、TC和CC；所述SNP4存在基因型TT、TA和AA。
本发明还提供一种用于扩增上述分子标记的引物，所述引物包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。
本发明还提供一种检测鸡屠体性状的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物。
本发明还提供一种利用上述分子标记鉴别鸡屠体性状的方法，包括以下步骤：
(1)以待测鸡基因组DNA为模板，利用所述引物或所述试剂盒扩增所述分子标记的基因片段，获取扩增产物；
(2)对所述扩增产物测序，检测所述分子标记相应SNP位点的基因型，其中，所述SNP1位点的基因型为AA时，鸡的胫长较长，基因型为GA或GG时，鸡的全净膛率较高；所述SNP2位点的基因型为GG时，鸡的胫围较大，基因型为GA或AA时，腿比率较高；所述SNP3位点的基因型为TT或TC基因型时，鸡的全净膛率较高；所述SNP4位点的基因型为AA或TA时，鸡的胸肌率、腿比率较高，基因型为TT时，鸡的全净膛率较高。
优选的是，扩增反应体系为：2×Es Taq MasterMix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL、模板DNA2μL以及ddH2O 19μL。
优选的是，扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。
本发明还提供所述的分子标记在鸡屠体性状选育中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过分析SERCA2基因，发现该基因有多个与麻黄鸡屠体性状显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证：
分子标记NC_052546.1：g.5345294G>A位点与胫长、全净膛率存在显著相关(p<0.05)，其中，AA突变纯合基因型个体的胫长显著长于GA杂合基因型个体(p<0.05)，但AA和GA与GG之间没有显著差异(p>0.05)；而GA杂合基因型个体和GG野生纯合基因型个体的全净膛率显著高于AA突变纯合基因型个体(p<0.05)，但GG和GA之间没有显著差异(p>0.05)；
分子标记NC_052546.1：g.5345224G>A位点与胫围和腿比率存在显著相关(p<0.05)，其中GG野生纯合基因型个体的胫围显著大于AA突变纯合基因型个体(p<0.05)，但AA和GG与GA之间没有显著差异(p>0.05)；而GA杂合基因型个体和AA突变纯合基因型个体的腿比率显著高于GG野生纯合基因型个体(p<0.05)，但GA和AA之间没有显著差异(p>0.05)；
分子标记NC_052546.1：g.5345007T>C位点与全净膛率存在显著相关(p<0.05)，其中TT野生纯合基因型个体和TC杂合基因型个体的全净膛率显著高于CC突变纯合基因型个体(p<0.05)，但TT和TC之间没有显著差异(p>0.05)；
分子标记NC_052546.1：g.5344870T>A位点与胸肌率、腿比率和全净膛率存在显著相关(p<0.05)，其中AA突变纯合基因型个体和TA杂合基因型个体的胸肌率和腿比率均显著高于TT野生纯合基因型个体(p<0.05)，而TT野生基因型个体的全净膛率显著高于(p<0.05)AA突变纯合基因型个体和TA杂合基因型个体(p<0.05)，但AA和TA之间无显著差异(p>0.05)。
上述可见，本申请提供的分子标记可以准确的鉴定麻黄鸡屠体性状，从而为麻黄鸡的选育提供科学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SERCA2引物配对位置及产物长度示意图；
图2为SERCA2基因序列SNP位点基因型分型图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。
实施例1
1材料与方法
1.1动物样品
试验动物为450只80日龄麻黄鸡，有表型记录的麻黄鸡有409只。通过采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。同时记录选择群体的皮下脂肪厚、肌间脂肪宽、全净膛重、半净膛重、腹脂重、腿重、胸肌重、胸肌率、腿比率、腹脂率、半净膛率、全净膛率和屠宰率等屠体性状。
1.2主要试剂
血样DNA提取试剂盒(品牌：OMEGA，货号：D3392，广州飞扬生物工程有限公司)；2×Es Taq MasterMix(Dye)(品牌：康为，货号：CW0690M，康为世纪生物科技股份有限公司)；DNAmarker(品牌：诺维赞，货号：MD101，江苏诺维赞生物科技股份有限公司)；高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科，货号：TSJ001，北京擎科生物科技有限公司)。
1.3实验方法
1.3.1引物设计
根据NCBI(National Center for Biotechnology Information Searchdatabase)公布的红色原鸡(Gallus)SERCA2基因的序列(Gene ID：396446)，使用NCBI的Primer-BLAST工具设计引物，由广州擎科生物科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示，引物在SERCA2基因上的配对位置如图1所示。
表1 PCR扩增引物序列
1.3.2血样DNA提取
参照血样DNA提取试剂盒操作手册提取血样DNA。
1.3.3SERCA2基因部分序列的PCR扩增
以上述409只麻黄鸡血样基因组DNA作为模板，扩增体系如表2，反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。
表2 PCR反应体系
1.3.4SNP确定与基因分型
利用通过DNAstar软件的SeqMan工具对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点，并通过该工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。
1.3.5基因型与屠体性状关联分析
SNP位点与基因型对应个体的屠体性状数据，采用SAS软件的GLM程序(GeneralLinear Models Procedure)进行SNP与生长性状之间的关联分析。
2结果
2.1SERCA2基因序列PCR扩增及SNP筛选
选取409只80日龄麻黄鸡个体，以每个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到8个SNP位点，分别为：NC_052546.1：g.5345567A>G，NC_052546.1：g.5345294G>A，NC_052546.1：g.5345233C>T，NC_052546.1：g.5345224G>A，NC_052546.1：g.5345093C>G，NC_052546.1：g.5345007T>C，NC_052546.1：g.5344870T>A，NC_052546.1：g.5344810G>A如图2所示。
SEQ ID NO：1
TGTCCACCTAAGCAGAGTTAGTGAAAAGATGCTGTACAATCAGCAGGAAATCTTTGGGATGGAGCTCGAGCTCAGGGGTTTGCCTTAAATTGGCTTGCAGTGCTCTGGGGGGCATAGTTCTGAGAGCTGTAGTGTGTAAGGGTTACTAAGCTACATTGTTTGTTTCTTAGAATTGATGAACTGAAAAAAAATCCAGATGCTGTCCTCAAACGGCTTTTCAGTTTGCCTGTCTTAAATGGATTAACCACCCTGCTCTGAAGCCTTAAGTTTATTGAAGGATGCACTCTAAATTGGTAACTGGTGACTGTCTTAATAGATTAAAGAGGTCCTTTGATGTTTCAATTGAATTTGTTTGCCATGGTTAAAGTAATATTTTAAAGAGAAACAAAACAGCATGGCCTTAGTTCTTAGAAGTTCTATCTGAAGCCCAGTCTGACAGGTTGGGATAAACAGTTGGCAAACTACTTACTTTTAGAAGAAGTACATTTGGGAATGGAAATTAACTTCGTATGCTTCTGTTACATTCCCCTGTCTAAAATGTTGTGCTTTAGATACTGGATCTAAATTTCTGTATTTTGATACACAAACGGTCACTAGATGTAATCCATAAGTGACCAAGCTGGGGTCACAGCAGTCTCCTTCCCTGAGATTCTGAGCATTGGTTCCTGTGATCTACTGTTCAGTCTGTAAGTACTCATAGCTTAAGAACTGACCCAGAGTTCCCAGAATTTCATGCTTATTTAATTGATGGATATGCTTAAATACTTAATTTTAAGTTTATGCCTGGCGTACAGTGTGCAAGTATGCTTTTCAAGGCTTTAAATTATAGCTGTAAAACACTTCAAGGCACTTTCTAAAGCATGGATACCTCATAATTAAGGGAGGAGAAGTTTTGGTGTCGAGAAAATTGGGAGGGAATGTTCTTGAGCCATATTATGTCAAACTCCAAAGTGATCATGAAGGACCTTCAAGTCTTACACAGTAAACATTGGTGTTGCAGATTTTTCTTCTGAGATCTTTCTCTGTGATGCTTTTTCTCATGGAAAAGTGGTTAGCTTAGGGAGCAAAAAACAGACAATGATGTGATGGAATGGGACTTA。
注：下划线处为突变位点。
2.2SERCA2基因序列SNP位点与屠体性状的关联分析
对上述8个SNP位点与屠体性状(全净膛重、半净膛重、活体重、胫长、胫围、屠体重、胸肌率、腿比率、半净膛率、全净膛率、屠宰率)进行关联分析，结果如表3所示。
NC_052546.1：g.5345294G>A位点与胫长、全净膛率存在显著相关(p<0.05)，其中，AA突变纯合基因型个体的胫长显著长于GA杂合基因型个体(p<0.05)，但AA与GG之间没有显著差异(p>0.05)，GA与GG之间没有显著差异(p>0.05)；而GA杂合基因型个体和GG野生纯合基因型个体的全净膛率显著高于AA突变纯合基因型个体(p<0.05)，但GG和GA之间没有显著差异(p>0.05)。
NC_052546.1：g.5345224G>A位点与胫围和腿比率存在显著相关(p<0.05)，其中GG野生纯合基因型个体的胫围显著大于AA突变纯合基因型个体(p<0.05)，但AA与GA之间没有显著差异(p>0.05)，GG与GA之间没有显著差异(p>0.05)；而GA杂合基因型个体和AA突变纯合基因型个体的腿比率显著高于GG野生纯合基因型个体(p<0.05)，但GA和AA之间没有显著差异(p>0.05)。
NC_052546.1：g.5345007T>C位点与全净膛率存在显著相关(p<0.05)，其中TT野生纯合基因型个体和TC杂合基因型个体的全净膛率显著高于CC突变纯合基因型个体(p<0.05)，但TT和TC之间没有显著差异(p>0.05)。
NC_052546.1：g.5344870T>A位点与胸肌率、腿比率和全净膛率存在显著相关(p<0.05)。其中AA突变纯合基因型个体和TA杂合基因型个体的胸肌率和腿比率均显著高于TT野生纯合基因型个体(p<0.05)，而TT野生基因型个体的全净膛率显著高于(p<0.05)AA突变纯合基因型个体和TA杂合基因型个体(p<0.05)，但AA和TA之间无显著差异(p>0.05)。
除上述4个SNP位点外，NC_052546.1：g.5345567A>G，NC_052546.1：g.5345233C>T，NC_052546.1：g.5345093C>G，NC_052546.1：g.5344810G>A四个位点与屠体性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。
表3鸡SERCA2基因的SNP与麻黄鸡屠宰性状的关联结果
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种利用与鸡屠体性状相关的分子标记鉴别鸡屠体性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以待测鸡基因组DNA为模板，利用引物或试剂盒对包含与鸡屠体性状相关的分子标记的基因片段进行扩增，获取扩增产物；所述分子标记位于鸡SERCA2基因上；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核苷酸序列包括突变位点SNP1、SNP2、SNP3和SNP4；所述SNP1为NC_052546.1：g.5345294 G>A；所述SNP2为NC_052546.1：g.5345224 G>A；所述SNP3为NC_052546.1：g.5345007 T>C；所述SNP4为NC_052546.1：g.5344870 T>A；所述SNP1存在基因型GG、GA和AA；所述SNP2存在基因型GG、GA和AA；所述SNP3存在基因型TT、TC和CC；所述SNP4存在基因型TT、TA和AA；所述引物包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ IDNO：3所示的下游引物；所述试剂盒包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物；
（2）对所述扩增产物测序，检测所述分子标记相应SNP位点的基因型，其中，所述SNP1位点的基因型为AA时，鸡的胫长较长，基因型为GA或GG时，鸡的全净膛率较高；所述SNP2位点的基因型为GG时，鸡的胫围较大，基因型为GA或AA时，腿比率较高；所述SNP3位点的基因型为TT或TC基因型时，鸡的全净膛率较高；所述SNP4位点的基因型为AA或TA时，鸡的胸肌率、腿比率较高，基因型为TT时，鸡的全净膛率较高。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；72 ℃最终延伸3min；4 ℃保存。
3.一种与鸡屠体性状相关的分子标记在鸡屠体性状选育中的应用，其特征在于，所述分子标记位于鸡SERCA2基因上；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核苷酸序列包括突变位点SNP1、SNP2、SNP3和SNP4；所述SNP1为NC_052546.1：g.5345294 G>A；所述SNP2为NC_052546.1：g.5345224 G>A；所述SNP3为NC_052546.1：g.5345007 T>C；所述SNP4为NC_052546.1：g.5344870 T>A；所述SNP1存在基因型GG、GA和AA；所述SNP2存在基因型GG、GA和AA；所述SNP3存在基因型TT、TC和CC；所述SNP4存在基因型TT、TA和AA；所述分子标记的表型为鸡的胫长、全净膛率、胫围、腿比率和胸肌率。
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