CN115851962A - 一种与鸡的腹脂重性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与鸡的腹脂重性状相关的分子标记及其应用，属于分子育种技术领域。该SNP分子标记对应于NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus6.0版本序列信息11号染色体第18,362,638位，此处碱基为G/A，GG基因型个体的腹脂重显著小于AA基因型个体。使用该分子标记进行标记辅助选择，能够降低鸡腹脂的沉积，节省生产成本并加快遗传进展。利用本发明分子标记构建的检测方法，成本低、操作简便，具有重要的实际应用价值。

Description

一种与鸡的腹脂重性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种与鸡的腹脂重性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

随着肉鸡行业的快速发展和集约化选择，导致肉鸡体内脂肪(尤其是腹部脂肪)过度沉积。而肉鸡腹部脂肪沉积过多会对胴体产量、饲料转化率、生育率和孵化率等产生不利影响。这些问题是造成全球肉鸡生产者遭受重大经济损失的原因。因此控制鸡腹部脂肪沉积，是肉鸡育种者们的主要目标之一。然而，由于鸡腹部脂肪测量的复杂性，大大阻碍基于腹部脂肪测量的遗传改良，因此在这种情况下，分子标记辅助选择(MAS)是提高选择效率的有效方法，用于促进生产低腹脂的鸡。

肉鸡的腹脂是一个高遗传力的性状，腹脂遗传力在0.50-0.80，表明遗传选择能有效减少肉鸡腹脂过度沉积。目前对肉鸡的腹脂含量采用直接选择育种已经取得了一定的进展，而通过分子标记手段从遗传上可进一步降低肉鸡的腹脂沉积。与腹脂重相关的遗传变异可以用遗传标记进行关联，通过对标记的选择而同时改善肉鸡的腹脂沉积。全基因组关联分析是鉴定表型和基因型之间遗传联系的最主要手段之一。为鉴定表型和基因型之间的遗传联系，便于对腹脂重进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，更好地服务于鸡的育种。因此，与肉鸡腹脂重性状相关的分子标记的研究具有重要意义。

发明内容

本发明为了准确地确定待测鸡的基因型以方便对腹脂重性状进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，提供了一种与鸡腹脂性状相关的分子标记及其应用，为分子标记育种选育工作提供基础。

一种与鸡腹脂重性状相关的SNP分子标记，所述SNP(单核苷酸多态性)分子标记位于11号染色体第18,362,638,rs14028856。

本发明中，分子标记chr11:18362638所含多态性位点的基因型为GG，对应于低腹脂重水平，所含多态性位点的基因型为GA，对应于腹脂重水平居中，所含多态性位点的基因型为AA，对应于高腹脂重水平。

本发明还提供一种上述的与鸡腹脂重相关的分子标记的检测试剂在检测鸡腹脂重中的应用。

本发明还提供一种用于扩增chr11:18362638分子标记的引物。其序列如SEQ IDNO:1-2所示。

上游引物F：ATGCTCACCTGGAATAACCCC(SEQ ID NO.1)

下游引物R：GCGCAGATAAGATGGCAGGTA(SEQ ID NO.2)

本发明还提供一种上述的引物在检测鸡的腹脂重或制备检测鸡的腹脂重的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种用于检测鸡腹脂重的试剂盒，包括上述的引物。

本发明还提供一种检测鸡腹脂重的方法，检测待测样本鸡中如上述的分子标记的基因型。

一种与鸡的腹脂重性状相关的分子标记及其应用，为根据上述SNP位点的基因型对鸡腹脂重性状进行早期选择，包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA；

(2)利用上述的引物进行PCR扩增，检测待测鸡11号染色体第18,362,638位SNP位点的基因型；

(3)将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；

(4)根据基因分型结果，判断所述待测样本鸡的腹脂性状。

步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH₂O溶解。

步骤(2)中PCR方法的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。

步骤(2)中所述PCR扩增的扩增体系包括：DNA 1μL，2xTaqMasterMix 10μL，上下游引物各1μL，ddH₂O 7μL。

本发明还提供一种上述的与鸡腹脂重相关的分子标记、上述的引物、上述的试剂盒在鸡育种中的应用。

本发明还提供一种与鸡的腹脂重性状相关的分子标记及其应用，并可以在低腹脂鸡的鸡育种中的应用。基于上述方法检测并判断基因型；当基因型为GG时，说明待测鸡的具有低腹脂重。

本发明公开了以下有益效果：

鸡的腹脂脂肪沉积过多不仅能造成经济效益下降，而且还会影响鸡的健康。本发明为了解决这一难题，提供一种与鸡腹脂重相关的分子标记，该分子标记位于鸡11号染色体18362638位置，通过研究发现，该位点的等位基因GG有利于降低鸡腹脂的沉积。对比市面上采用酶切的方法进行鉴定与腹脂重的分子标记，我们提供的方法更加简便，准确，并且测定成本和条件低，不存在假阳性的结果，并且可以对肉鸡腹脂重进行早期选择，淘汰不符合标准的基因型，节省养殖成本，提高优势基因型进行留种率，提高经济效益并加快遗传进展。

附图说明

图1为京星黄鸡在11号染色体上关于腹脂重的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；横坐标表示为鸡的染色体编号；纵坐标表示为SNP位点的-logP值。

图2为chr11:18362638不同纯合基因型腹脂重的表型。

图3为chr11:18362638在多群体中腹脂重的表型。

图4为chr11:18362638纯合基因型鉴定。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1.与鸡腹脂重相关SNP标记的确定

(1)动物材料

本发明使用来自于第十六世代鸡IMF选择系(n＝256)和对照系(n＝264)群体，共计520只母鸡。IMF选择系和对照系群体源于同一个基础群(京星黄鸡，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所)，自2000年起以IMF性状为主选性状进行定向选育。与对照系相比，选育后可使IMF选择系群体的IMF含量显著提高(P<0.001)，腹脂重也显著提高。饲养过程中采用自由采食和饮水，日粮参考黄羽肉鸡饲养标准(NY/T33-2004)。

(2)DNA提取与表型测定

用采血管收集所有试验鸡的翅静脉血0.5mL，使用标准的苯酚-氯仿发提取全基因组DNA，经NanoPhotometer核酸蛋白检测仪准确测定DNA样品的浓度和纯度(OD值：OD260/280、OD260/230)；检测合格的DNA样品，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA样品的纯度和完整性。

所有待测鸡于98日龄屠宰。采集520个个体的腹脂组织样品，并称重。

(3)腹脂重全基因组SNP关联分析

所有待测鸡的DNA样品送到北京博奥公司进行全基因组重测序检测，共得到17,915,382个SNP位点。在GWAS模型中对批次效应，群体结构进行了校正固定。本研究利用GEMMA软件，将质控后的516个个体(选择系,n＝252；对照系,n＝264)以及8,940,029个SNPs用于腹部脂肪性状的GWAS分析。经Bonferroni多重检验校正后得到基因组显著性阈值为-log10(0.05/8,940,029＝8.246，建议性阈值为-log10(1/8,940,029)＝6.945。

GWAS分析结果如图1所示，腹脂重与11号染色体上0.4Mb的区域(chr11:18308001-18710000)存在显著关联，进一步对基因组关联区域所有位点进行验证，最终锁定了11:18362638位点作为候选位点。

实施例2.chr11:18362638基因型与鸡腹脂重性状的相关性

(1)表型优势基因型确定

使用与实施例1中GWAS分析相同的动物群体(第十六世代鸡IMF选择系，n＝252；和对照系，n＝264)，采用R 4.0.4软件ggpubr包对表型进行计算。

在京星黄鸡群体中(图2)，chr11:18362638位点的GG型比GA型和AA型腹脂重低，说明GG基因型对筛选低腹脂重个体有利。

实施例3.位点chr11:18362638突变对多群体肉鸡腹脂重表型、贡献率影响

(1)chr11:18362638对全基因组腹脂重表型变异的贡献

分析过程如下：

基于所使用的全部个体的腹脂重表型和个体基因型，使用GEMMA软件，构建G矩阵；

计算PVE(相当于广义遗传力，根据公式即基因型方差/表型方差＝Vg/Vp)；

进行Linear Mixed Model(LMM)分析；

GEMMA输出结果，用R4.0.4计算PVE(相当于广义遗传力，即基因型方差/表型方差＝Vg/Vp),算法如下：

位点PVE占全基因组PVE的比例，即为位点贡献率，具体结果见表1。

表1 chr11:18362638对京星黄鸡全基因组腹脂重性状变异的贡献率分析

¹V(g):基因型变异；²V(p):表型变异；³PVE:可解释的表型变异(全基因水平的百分比)。

(2)多群体验证

选取京星黄鸡(n＝516)、广西黄鸡(n＝65)、文昌鸡(n＝69)、科宝白羽肉鸡(n＝78),清远麻鸡(n＝105)群体共833只母鸡个体，于98日龄屠宰测量腹部脂肪重量。同时采静脉血，提取基因组DNA。根据Chr11:18362638的位置设计特异性引物，使用KASP技术对广西黄鸡、文昌鸡群体、科宝白羽肉鸡,清远麻鸡进行基因型分型，京星黄鸡为GWAS分析的群体数据。

对所有个体基因型和腹脂重进行最小二乘关联分析，确定Chr11:18362638在多群体中与腹脂重显著相关(图3)。说明Chr11:18362638可作为因果突变广泛性影响肉鸡的腹脂重，可通过对该位点的辅助选择，降低肉鸡的腹脂重。多群体的显著差异与现实屠宰验证结果相符，可以证实上述SNP位点的正确性和可操作性。

实施例4.位点chr11:18362638分子标记检测方法建立及其在育种中的应用

(1)分子标记方法建立

引物设计

根据Ensemble网站(6.0版本)提供的鸡11号染色体DNA序列，利用NCBI引物设计软件设计包含扩增chr11:18362638的1对特异性引物，引物由北京华大基因公司合成。引物的DNA序列如下所示：

上游引物F：ATGCTCACCTGGAATAACCCC(SEQ ID NO.1)

下游引物R：GCGCAGATAAGATGGCAGGTA(SEQ ID NO.2)

PCR反应程序优化

反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。PCR反应体系以20μl计为：血液DNA 1μl，2×TaqMasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，ddH2O7μl。

DNA序列鉴定采用直接测序法，由北京华大基因公司进行。每个PCR扩增片段测序执行正向测序。所测得的PCR产物序列与NCBI基因组序列比对，确认扩增序列的真实性；同时，确认对应SNP位点的突变。PCR扩增产物测序结果显示chr11:18362638位点的不同等位基因如图3所示。

(2)利用本发明SNP分子标记进行辅助选择降低肉鸡腹脂的育种方法

选择京星黄鸡为选育对象，随机挑选1000只个体作为待测群体，公母比例1:1。记为F0代。

所有个体于30日龄左右翅静脉采血，加入ACD抗凝剂，-20℃保存备用。采用常规酚仿法提取基因组DNA,溶于ddH₂O中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释至浓度50ng/μl。

采用上述1个SNP的特异性引物进行PCR扩增反应；采用直接测序法对chr11:18362638位点基因型进行分型；根据基因分型结果选留chr11:18362638位点的GG或AA基因型的健康公、母鸡。

每个基因型公鸡不低于30只，公、母比例不低于1:3的数量留种。记录每只鸡的编号建立系谱，产蛋高峰期按照公鸡半同胞、母鸡全同胞家系的方法组建GG基因型个体或AA基因型个体的纯系，记为F1代。

对于GG基因型个体或AA基因型个体的纯系，每个家系至少随机选择1只后代母鸡个体，合计每个纯系屠宰50只，记为F2代。所有选择的100只个体均于98日龄屠宰，采集腹脂脂肪，称量腹脂重，统计选育后chr11:18362638位点GG基因型或AA基因型的腹脂重。

本发明通过提供鸡chr11:18362638的GWAS分析获得、突变位点的检测、以及在优质鸡育种中的应用等方法，为鸡腹脂沉积的分子标记辅助选择及全基因组选择提供了一个新的分子标记。

以上所述的实施例仅是对本发明的技术方案进行描述，非对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种与鸡的腹脂重性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记序列为ACACATCAGATTTCAATCTCG/AGCAGCCATGGGATCATTTTC，对应于NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus-6.0版本序列信息11号染色体，其中第18,362,638位的碱基为G或A，基因型为GG、GA、AA；GG基因型腹脂重低于GA型和AA基因型。

2.一种检测权利要求1所述的与鸡腹脂重性状相关的SNP分子标记的引物，其特征在于，包括：

上游引物F：ATGCTCACCTGGAATAACCCC；

下游引物R：GCGCAGATAAGATGGCAGGTA。

3.一种权利要求2所述的引物在检测鸡的腹脂重性状或制备检测鸡的腹脂性状的试剂盒中的应用，其特征包括权利要求2中的引物。

4.一种检测鸡腹脂重性状的方法，其特征在于，检测待测样本鸡中如权利要求1所述的SNP分子标记的基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA；

(2)检测待测鸡11号染色体第18,362,638位SNP分子标记的基因型；

(3)利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，获取扩增产物；

(3)直接测序法对获得的PCR扩增产物进行等位基因测序；

(4)基于所述测序结果，确定待测鸡如权利要求1所述的SNP标记的基因型。

6.权利要求1所述SNP分子标记在鉴定鸡腹脂重基因型并应用于低腹脂鸡育种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，检测鸡国际参考基因组6.0版本11号染色体上chr11:18362638的基因型,表明携带GG基因型的个体具有较低的腹脂沉积。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH₂O溶解。

9.一种权利要求1所述的SNP分子标记和\或权利要求2所述的引物在鸡育种中的应用。

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