CN105087584A - 一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记领域，具体提供一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用。本发明利用高通量测序技术和miRNA-mRNA联合分析，筛选到调控脂肪沉积关键基因ACSL1的一种miRNA，所述的miRNA为gga-miR-19b-3p，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。所述miRNA可作为与鸡腹脂沉积相关的分子标记，在遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。

Description

一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体地说，涉及一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用。

背景技术

近二十年来，肉鸡遗传改良在体增重、生长速度及饲料报酬等方面取得了较大的进展，但同时也伴随着脂肪的过度沉积，特别是腹脂沉积。现代商业肉鸡品种每公斤体重就包含150-200g的脂肪，这些脂肪中约80％并非生理需求，从而大大降低了饲料利用率。这些多余的脂肪在屠宰时只能当废弃物丢弃，不但会直接影响肉产品的加工，而且还造成了一定的资源浪费和环境污染。脂肪的过度沉积已成为肉鸡生产中所面临的一个严峻问题。因此，低腹脂沉积一直是肉鸡品系选育的重要目标之一。

miRNA(MicroRNAs)是一类非编码单链RNA分子，在细胞增殖、分化和凋亡、肿瘤形成等生理过程中发挥重要的调控作用。近年来的研究表明，miRNA是人类和动物脂肪细胞分化、脂肪沉积过程中所不可缺少的调节因子。如果可以获得与主选性状及其关键基因相关的miRNA作为分子标记，即可以实现目标性状的早期选择，加快遗传选择进展。

miRNA对动物生长发育的调控作用是通过调控其特定靶基因来实现，仅仅借助于生物信息软件来预测靶基因，无疑将会是大海捞针。而通过某一特定时期、特定组织中miRNA和mRNA同时深度测序分析，根据miRNA和mRNA呈负相关表达的原理，并结合靶基因软件预测的结果，会大大缩小对目标miRNA靶基因的筛选范围。通过miRNA-mRNA联合分析，为鉴定调控腹脂沉积这类复杂性状的miRNA提供了一个全新手段。

综上所述，在当前家禽饲养成本急剧飙升的情势下，利用分子标记辅助选择法对腹脂沉积这一复杂性状进行选择提高，可较大的提高饲料报酬，进而节省新品系选育的成本。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA，所述miRNA的靶标基因是ACSL1。

进一步地，所述miRNA为gga-miR-19b-3p，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明进一步提供了前述miRNA在调控前脂肪细胞增殖和分化中的应用，所述miRNA通过调控ACSL1基因的表达，调控前脂肪细胞的增殖和分化。

本发明还提供了前述miRNA作为分子标记在遗传标记辅助育种和改善鸡腹脂沉积中的应用。

进一步地，所述应用具体为通过检测鸡腹脂组织中所述miRNA的表达水平，判断鸡腹脂重/率的高低从而进行筛选。

本发明还提供了检测前述miRNA表达水平的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测鸡腹脂组织中含有小RNA的总RNA；

(2)通过poly(A)聚合酶在miRNA的3’末端加上多聚A，以互补的多聚T为3’引物，利用反转录酶进行miRNA反转录；

(3)采用miRNA特异正向引物TGTGCAAATCCATGCAAAAC

TGA及适用于加尾法的荧光定量PCR试剂盒进行gga-miR-19b-3p的扩增；扩增后利用2^-ΔΔC法计算获得gga-miR-19b-3p表达水平。

本发明还提供了一种检测鸡腹脂组织中gga-miR-19b-3p表达水平的荧光定量PCR试剂盒。

所述试剂盒包括：反转录试剂、目的miRNA的特异性上游引物、内参引物和荧光定量PCR反应液。

所述目的miRNA的特异性上游引物序列为TGTGCAAATCCATGCAAAACT

GA。

内参上游引物可以为：CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCCCTGTCTC。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的miRNA(gga-miR-19b-3p)与鸡腹脂沉积具有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，gga-miR-19b-3p在高低腹脂组样本间差异表达10倍以上。本发明提供的miRNA可用于鸡腹脂重/率相关的辅助遗传育种中，可实现早期辅助选择。

本发明提供的检测gga-miR-19b-3p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便使用、简化操作，又保证了结果的一致性。

附图说明

图1为ACSL1的3’UTR与gga-miR19b-3p的结合位点。

图2为gga-miR-19b-3p在高低腹脂表型组中相对表达量结果，**p<0.01。

图3为ACSL1在高低腹脂表型组中相对表达量结果，**p<0.01。

图4为gga-miR-19b-3p的靶基因双荧光素酶验证，**p<0.01。

图5为转染gga-miR-19b-3p模拟物后gga-miR-19b-3p的表达变化。

图6为过表达gga-miR-19b-3p前脂肪细胞增殖的变化。

图7为过表达gga-miR-19b-3p后脂滴沉积变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1基于高通量测序技术的miRNA和mRNA联合分析获得腹脂沉积关键基因(ACSL1)及其调控miRNA(gga-miR-19b-3p)

1)实验动物和样本准备

以北京油鸡和科宝肉鸡杂交产生的F2代183只母鸡(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地)为试验素材来源。饲养至93天，进行屠宰、称取全净膛重和腹脂重，计算腹脂率(腹脂重/全净膛重)。采集腹脂组织样本迅速放入液氮中冻存。

根据腹脂重和腹脂率的表型数据，将腹脂重≥66.64g、腹脂率≥5.15％归为高表型组，而腹脂重≤34.50g、腹脂率≤1.84％归结为低表型组。从183只母鸡中选取6对具有极端表型值(极高和极低)的全同胞母鸡；将选出的高、低表型组样本，商业用试剂盒提取腹脂组织中总RNA，组建两个RNA等量混合池；分别构建用于miRNA和mRNA测序的cDNA文库。送测序公司进行测序。

2)基于高通量测序结果分析差异表达miRNA和mRNA

将RPM≥5、p<0.05(Fisher'sexacttest和Chisquare检验)且高低表型组间差异倍数≥1.5的miRNA定义为差异表达miRNA；miR-19b-3p在高、低表型组中，差异倍数达为5倍以上；差异表达mRNA的定义为：必须符合两组中有一组的FPKM≥10、p<0.05且差异倍数≥2或≤0.5。

3)差异表达miRNA和mRNA联合分析进行关键miRNA筛选

利用miRanda和Targetscan算法，基于鸡的Ensemble数据库，对所有差异表达miRNA和差异表达mRNA进行联合分析，即对差异表达miRNA进行靶基因预测。再将预测得到的靶基因与mRNA转录组测序中所鉴定的差异表达mRNA进行交集分析，交集部分定义为“交集基因”。通过进一步分析发现，交集基因ACSL1在多条脂代谢信号通路中发挥作用，同时参与不饱和脂肪酸的生物合成途径、代谢通路、过氧化物酶体和脂肪酸代谢途径。

靶基因预测结果表明，ACSL1的3’UTR区与gga-miR19b-3p种子序列有7个碱基互补结合(图1)。ACSL1基因为下调基因，gga-miR19b-3p为上调基因，符合miRNA负调控的功能预期，即大多数miRNA对靶基因表达具有负调控作用，因此推测差异表达miRNA，miR-19b-3p，参与调控ACSL1的表达。

实施例2利用不同群体对gga-miR-19b-3p标记与腹脂重/率的相关性进行验证

用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对miRNA和mRNA高通量测序中鉴定获得的关键gga-miR-19b-3p及ACSL1的表达进行扩大样本验证。

1)实验样本准备

200只北京油鸡(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所母鸡饲养至93日龄，进行屠宰、称取全净膛重和腹脂重，计算腹脂率(腹脂重/全净膛重)。采集腹脂组织样本迅速放入液氮中冻存。根据腹脂重和腹脂率的表型数据，基于高低组间腹脂重/率相差五倍以上的标准，共选择出12个(高、低表型组各6个)具有极端表型值的个体。

2)gga-miR-19b-3p差异表达验证

提取腹脂总RNA：北京天根公司总RNA提取试剂盒法ACSL1mRNA定量的条件为：试剂盒miScriptIIRTKit(Qiagen,德国)进行反转录；试剂盒QuantifastSYBRGreenPCRKit(Qiagen,德国)进行qRT-PCR。引物为(F:CAAAGGAGAAGGTGAGGTGTG；R:CTTCAACGTACCGTTTGGTAG)。引物的终浓度为10umol。检测每次设置3个平行管反应，以β-action作为内参。PCR程序为：95℃5min；35个循环(95℃10s，60℃30s)

gga-miR-19b-3p定量的条件为：利用试剂盒方法进行反转录(miScriptIIRTKit，Qiagen公司)和定量检测(miScriptSYBRGreenPCRKit，Qiagen公司)，其中gga-miR-19b-3p扩增特异性引物为TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。

miRNA的表达检测每次设置3个平行管反应，以U6作为内参。PCR程序为：95℃15min；40个循环(94℃15s，55℃30s，70℃30s)；

统计学分析：采用SAS8.0软件(SASInst.Cary,NC,USA)进行分析。统计方法均数间比较采用t检验，P＜0.05(差异显著)和P＜0.01(差异非常显著)定为有统计学意义，分析高、低表型组间表达差异。

qRT-PCR结果表明，miR-19b-3p在北京油鸡高、低表型组中，差异极显著(p<0.01)，且差异倍数达到10倍以上(图2)；ACSL1也在在北京油鸡高、低表型组中，差异极显著(图3，p<0.01)。

实施例3miRNAgga-miR-19b-3p对前脂肪细胞发育及ACSL1基因表达的调控

1)质粒的构建及miRNA的合成

ACSL1野生型载体构建：根据Genbank上鸡的ACSL1的3’UTR(NC_006091.3)序列设计引物，提取原鸡血液中的DNA为模板，利用PCR方法，扩增ACSL1全长3'UTR序列。经回收、纯化等步骤，将目的片段克隆到pmiR-RB-REPORT^TM载体中。具体的实验步骤包括：对ACSL1全长3'UTR序列进行酶切位点分析，并根据载体序列信息，选择XhoI和NotI两个内切酶切PCR产物；利用试剂盒进行目的片段的纯化、酶切和回收；将PCR产物与pmiR-RB-REPORT^TM载体连接；进行菌落PCR测序鉴定后获得ACSL1野生型载体。

ACSL1突变型载体构建：根据ACSL13’-UTR区域与对应miRNA种子区域结合位点，完成构建突变载体。引物如下：

gga-ACSL1-mut_F：CAACAAGGAAACGTGTAAGATTTGTGTGATTGT；

gga-ACSL1-mut_R：AAATCTTACACGTTTCCTTGTTGTGCTTGTATC。

其中斜体加粗部分为突变位点序列。

2)双荧光素酶试验验证ACSL1与gga-miRNA-19b-3p的靶向结合

以293T细胞为试验载体，采用脂质体转染的方法将ACSL1双荧光素酶野生型和突变型表达载体和gga-miR-19b-3p的模拟物(mimics)分别共转入细胞中。

试验分为对照组和试验组。具体分组如下：1)对照组(NC)：Negativecontrol(NC)和预测靶基因3’-UTR野生型表达载体的共转染；2)miRNA超表达组：gga-miR-19b-3p模拟物和ACSL1表达载体共转染。

在转染前一天，将细胞接种至96孔板培养板，当细胞融合度达60％时，即可进行转染。转染体系为10ul，具体转染体系如下：试验组：0.5ul终浓度为50nM的模拟物+50ngACSL13’-UTR表达载体+0.25ulFugene6；对照组:0.5ul终浓度为50nM的NC+50ngACSL13’-UTR表达载体+0.25ulFugene6，用opti-MEM培养基加至10ul。

转染后24h，采用双荧光素酶报告基因检测过表达组和对照组的荧光素酶活性。图4结果表明，与对照组相比，共转了gga-miR19b-3p模拟物和ACSL1野生型表达载体的试验组，荧光素酶的活性显著下降。而将ACSL1与gga-miR19b-3p种子序列结合位点突变后，荧光素酶的活性则没有显著变化。结果表明ACSL1是gga-miR19b-3p的靶基因。

3)gga-miR-19b-3p对前脂肪细胞增值和分化的影响

通过在前脂肪细胞中添加gga-miR-19b-3p模拟物的方法使得gga-miR-19b-3p过表达。结果与阴性对照组相比，gga-miR-19b-3p的表达极显著增加(p<0.001，图5)。

在前脂肪细胞培养基中加入50nm浓度的gga-miR-19b-3p模拟物进行培养。在增殖和分化的不同时间点，通过MTT法和油红O法分别检测前脂肪细胞的增殖和脂肪细胞脂滴沉积变化，结果表明，在转染后48小时，gga-miR-19b-3p模拟物添加组细胞数量显著高于对照组(p<0.01,图6)；而脂滴沉积在转染gga-miR-19b-3p模拟物24,48,and72小时三个时间点均显著高于对照组(p<0.01或p<0.001,图7)。试验证明gga-miR-19b-3p可促进前脂肪细胞增值和分化，促进脂肪沉积。

实施例4检测鸡腹脂组织中gga-miR-19b-3p表达水平的荧光定量PCR试剂盒。

所述试剂盒包括：反转录试剂、目的miRNA的特异性上游引物、内参引物和荧光定量PCR反应液。

反转录试剂：购自Qiagen公司的miScriptIIReverseTranscriptionKit，货号218060或218161，具体成分为：miScriptReverseTranscriptaseMix，miScriptHiSpecBuffer。

目的miRNA的特异性上游引物序列为TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。

内参引物为：CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCCCTGTCTC

荧光定量PCR反应液：购自Qiagen公司的miScriptSYBRGreenPCRKit，货号218073或218075，具体成分为QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix，miScriptUniversalPrimer。

所述试剂盒的工作程序为：95℃15min；94℃15s，55℃30s，70℃30s，40个循环。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA的靶标基因是ACSL1。

2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA为gga-miR-19b-3p，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

3.权利要求1或2所述的miRNA在调控前脂肪细胞增殖和分化中的应用，其特征在于，所述miRNA通过调控ACSL1基因的表达，调控前脂肪细胞的增殖和分化。

4.权利要求1或2所述的miRNA作为分子标记在遗传标记辅助育种和改善鸡腹脂沉积中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用具体为通过检测鸡腹脂组织中所述miRNA的表达水平，判断鸡腹脂重/率的高低从而进行筛选。

6.检测权利要求1或2所述miRNA表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测鸡腹脂组织中含有小RNA的总RNA；

(2)通过poly(A)聚合酶在miRNA的3’末端加上多聚A，以互补的多聚T为3’引物，利用反转录酶进行miRNA反转录；

(3)采用miRNA特异正向引物TGTGCAAATCCATGCAAAAC

TGA及适用于加尾法的荧光定量PCR试剂盒进行gga-miR-19b-3p的扩增；扩增后利用2^-ΔΔC法计算获得gga-miR-19b-3p表达水平。

7.一种检测鸡腹脂组织中gga-miR-19b-3p表达水平的荧光定量PCR试剂盒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：反转录试剂、目的miRNA的特异性上游引物、内参引物和荧光定量PCR反应液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述目的miRNA的特异性上游引物序列为TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。