CN112646897B - 一种与边鸡体重相关的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与边鸡体重相关的miRNA，所述miRNA其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了用于检测所述的与边鸡体重相关的miRNA的表达量的特异性引物。本发明还公开了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物。本发明还公开了所述的miRNA、特异性引物、所述的检测试剂盒在判断边鸡体重的高低中的应用。本发明公开了检测试剂盒的检测方法。本发明最后公开了一种提高或降低边鸡体重的方法。本发明提供的检测试剂盒可用于检测该miRNA在鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷。本发明还可以利用该miRNA的表达量控制边鸡的体重，在实际的养殖过程中根据实际需要提高或降低边鸡的体重。

Description

一种与边鸡体重相关的miRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种与边鸡体重相关的miRNA及其应用。

背景技术

边鸡是山西省唯一被列入“国家级遗传资源保护名录”的优良原始地方鸡品种，具有耐粗饲、耐严寒、肉质鲜美等特点。随着人们对畜产品品质需求的提高，地方鸡品种因其独特的口感和风味受到广泛关注，并且需求量逐年增高，但地方鸡品种一般生长较慢，饲料利用率低，所以提高地方鸡品种的生长性能成为研究的热点。

miRNA是一类长度约18-24nt左右的单链内源性非编码RNA，在动物中主要通过种子序列与mRNA的3′UTR互补结合，抑制mRNA翻译或引起mRNA降解来发挥作用。骨骼肌是鸡肉的重要组成部分，大量研究表明作为骨骼肌主要贡献者之一的腿肌与鸡的生产性能和体重密切相关。

因此，采用高通量测序技术，对边鸡腿肌进行转录组测序，以期发现一些与边鸡体重密切相关的miRNAs，并用于后续的生产以及生长性状的调控机制研究。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种与边鸡体重相关的miRNA。

本发明还要解决的技术问题是提供了用于检测所述的与边鸡体重相关的miRNA的表达量的特异性引物。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种检测试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的miRNA、所述的特异性引物、所述的检测试剂盒在判断边鸡体重的高低中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种提高边鸡体重的方法和一种减低边鸡体重的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种与边鸡体重相关的miRNA，所述miRNA其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明内容还包括用于检测所述的与边鸡体重相关的miRNA的表达量的特异性引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明内容还包括一种检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物。

其中，所述检测试剂盒还包括2×miRcute Plus miRNA PreMix、通用反向引物和无酶双蒸水组成。

其中，所述检测试剂盒还包括内参U6的引物对，所述内参U6的引物序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明内容还包括所述的miRNA、所述的特异性引物、所述的检测试剂盒在判断边鸡体重的高低中的应用。

其中，所述应用为通过荧光定量PCR检测边鸡腿肌组织中所述的miRNA的表达量来判断边鸡体重的高低。

本发明内容还包括所述的检测试剂盒的检测方法，具体方法为通过荧光定量PCR检测所述的miRNA在边鸡肌肉组织的表达量判断边鸡体重的高低。

本发明内容还包括一种提高边鸡体重的方法，其方法包括降低所述的miRNA的表达量。

本发明内容还包括一种降低边鸡体重的方法，其方法包括提高所述的miRNA的表达量。

本发明的原理是：提取边鸡肌肉组织总RNA进行反转录，得到cDNA。利用所述的miRNA的特异性上游引物、内参U6引物等组成的试剂盒进行荧光定量PCR，PCR反应体系和扩增程序同常规的荧光定量PCR，并且采用2^-ΔΔCT方法对该miRNA在边鸡各个体中的表达水平进行判定，确定其表达量与体重的关系。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明首次研究获得了影响边鸡体重相关的miRNA，本发明提供的miRNA可用于开发边鸡生长性状的辅助选择标记，同时用于研究非编码RNA在鸡生长性状中的调控机制；并且同时基于该miRNA进一步研究获得了检测该miRNA表达量的特异性引物，并进一步研发获得了检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒可用于检测miRNA在边鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷。本发明还可以利用该miRNA的表达量控制边鸡的体重，在实际的养殖过程中根据实际需要提高或降低边鸡的体重。

附图说明

图1、miRNA与核心靶基因调控网络；

图2、qPCR验证结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1基于RNA-seq和mRNA联合分析获得影响边鸡体重的miRNA

1.测序样本的采集

实验样本采自山西农业大学(原山西省农科院畜牧研究所)饲养管理水平一致的边鸡群体。16周龄时，在边鸡快、慢品系中分别随机选择3只体重相近的健康个体，采集其腿肌组织用于高通量测序，测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。所采集的快、慢品系个体的体重结果见表1。

表1.快、慢品系边鸡测定指标

注：同一行肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

2.差异表达miRNA的筛选和靶基因预测

首先，对采集的腿肌组织提取总RNA，质检合格后进行建库测序，然后对下机数据进行质控，最后是与参考基因组进行比对获得已知的和新的miRNAs。以P≤0.05作为差异miRNA的筛选标准，在慢长组和快长组之间共筛选到42个差异表达的miRNA，其中包括gga-miR-455-3p，gga-miR-460b-5p，gga-miR-7b，gga-miR-205a，gga-miR-184-3p，gga-miR-194等22个已知的miRNA，以及novel-gga-miR-144，novel-gga-miR-158，novel-gga-miR-204，novel-gga-miR-183，novel-gga-miR-81，novel-gga-miR-292等20个新的miRNA。随后，使用miRanda和RNAhybrid两个软件对差异miRNA进行靶基因预测，取其交集后的靶基因用于后续KEGG通路富集分析以及PPI蛋白互作分析。

3.KEGG通路分析

使用KOBAS软件对上述获得的靶基因进行KEGG通路富集分析，以P-value≤0.05为筛选标准，共获得7条显著富集通路，该miRNA的靶基因富集到了其中的4条通路(表2)。

表2该miRNA靶基因显著富集的通路

4.PPI蛋白互作分析

使用STRING数据库对上述获得的靶基因蛋白互作关系进行分析，利用Cytoscape(3.6.1)对其调控关系网络进行可视化，同时筛选核心基因，并且发现该miRNA靶基因在其中发挥了重要作用(图1)。

5.对miRNA测序结果进行验证

提取腿肌总RNA，反转录后得到cDNA，根据北京百迈客生物科技有限公司高通量测序获得的该miRNA的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1，设计上游引物即特异性引物SEQ IDNO.2，内参基因引物序列根据NCBI中U6的mRNA序列(登录号：NM_001006337.2)进行设计。采用包含特异性引物的荧光定量试剂盒，按照常规反应体系和扩增程序对该miRNA的表达量进行测定。

该试剂盒由特异性引物、内参U6的引物对、2×miRcute Plus miRNA PreMix(含SYBR&ROX)、通用反向引物和无酶双蒸水(ddH₂O)组成，其中所述的特异性引物的序列如SEQID NO.2；内参U6的引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；2×miRcute Plus miRNAPreMix(含SYBR&ROX)、通用反向引物和无酶双蒸水均来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司的荧光定量试剂盒(ChamQTM

qPCR Master Mix)。

miRNA：5′-cucaugcccucucugugccagg-3′(SEQ ID NO.1)

miRNA：F：5′-GCGCTCATGCCCTCTCTGT-3’(SEQ ID NO.2)

U6：F：5′-GTCACTTCTGGTGGCGGTAA-3′(SEQ ID NO.3)

R：5′-GTTCAGTAGAGGGTCAAA-3′(SEQ ID NO.4)

荧光定量反应体系为20μl：2×miRcute Plus miRNAPreMix 10.0μl；特异性引物0.4μl；通用反向引物0.4μl；模板cDNA 2.0μl；ddH₂O7.2μl。荧光定量反应程序：95℃预变性5min；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec获得溶解曲线。

采用2^-ΔΔCT方法对定量结果进行分析，结果发现边鸡慢长个体中该miRNA表达量显著高于快长个体，与RNA-seq测序结果一致。本发明提供的试剂盒可用于检测该miRNA在鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷，本发明发现的该miRNA可用于开展边鸡体重相关的生产以及生长性状的调控机制研究。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种与边鸡体重相关的miRNA及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA(Novel-gga-miR-144)

<400> 1

cucaugcccu cucugugcca gg 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 特异性引物(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgctcatgc cctctctgt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> U6上游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcacttctg gtggcggtaa 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> U6下游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

gttcagtaga gggtcaaa 18

Claims (7)

1.用于检测与边鸡体重相关的miRNA的表达量的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述与边鸡体重相关的miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括2×miRcutePlus miRNA PreMix、通用反向引物和无酶双蒸水组成。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内参U6的引物对，所述内参U6的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2~4任一项所述的检测试剂盒在判断边鸡体重的高低中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为通过荧光定量PCR检测边鸡腿肌组织中miRNA的表达量来判断边鸡体重的高低，所述与边鸡体重相关的miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.权利要求2~4任一项所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体方法为通过荧光定量PCR检测所述的miRNA在边鸡肌肉组织的表达量判断边鸡体重的高低，所述与边鸡体重相关的miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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