KR101472025B1 - 한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린 및 이중특이적 탈인산화효소 27을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린 및 이중특이적 탈인산화효소 27을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 기술로서, 보다 상세하게는 피검체에서 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 발현량을 조사하여 한우의 근내지방조직을 검출할 수 있는 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 근내지방 특이 유전자 검출용 키트의 상품화가 가능하고, 한우에서 등심근 내 특이적 지방축적 유도를 통한 고급육의 생산 및 한우의 지방의 함량조절을 통한 체조성 조절 기술의 개발이 가능하며, 이를 통한 체지방 조절 정보를 다른 축종에 적용할 수 있다.

Description

한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린 및 이중특이적 탈인산화효소 27을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법{Kits and methods for detecting intramuscular fat tissue of Hanwoo using TNMD and DUSP27}
한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 기술로서, 보다 상세하게는 피검체에서 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 발현량을 조사하여 한우의 근내지방조직을 검출할 수 있는 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
한우에서 복부, 피하, 등 불가식 지방의 함량을 감소시키고 등심 내 근내지방과 같은 가식지방의 함량을 증가시켜(하이 마아블링) 고품질 한우고기 생산을 유도하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이의 일환으로 근내지방조직 특이적 차별발현 유전자 발굴을 통해 한우에서 지방조직 부위별 지방의 축적을 조절하기 위한 원천 소재 확보 및 이를 검출하기 위한 관련 기술이 요구되고 있다.
유전적으로 우수한 형질을 가지고 있는 가축을 정확히 선발하기 위한 보조적 수단으로 개체의 DNA 정보를 이용하기 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 이를 한우 개량에도 적용하는 연구는 필요하다.
한우의 개량은 당대검정과 후대검정을 병행하여 보증씨수소를 선발하고 있는데, 당대 검정에서 개체의 성장능력을 평가하여 후보씨수소를 선발하고, 이 개체들의 자손들, 즉 거세우들의 성장과 도체성적을 검정하여, 후보씨수소들 중에서 보증씨수소를 선발하는 이원 검정체제가 수행되고 있다. 그러나, 당대검정시 개체의 유전능력을 평가하는 형질은 주로 성장만 평가할 뿐 육질 자료 측정이 불가능하여, 부모의 육종가에 근거하여 평가하기 때문에 해당 개체의 육질에 대한 정확한 평가가 어려운 실정이다. 따라서, 육질의 유전적 능력을 추정할 수 있는 유전자 마커를 적용하여 당대검정시에 선발한다면 한우개량의 속도와 정확성을 높일 수 있게 될 것이다. 최근 한미 FTA 협상 타결 이후 값싼 미국산 쇠고기 수입개방에 따른 한우고기의 육량증가 및 육질고급화가 매우 중요한 과제이다. 특히, 수입쇠고기와 품질 차별화 및 경쟁력 향상을 위하여, 고급육 한우육 생산을 위한 첨단 과학기술의 활용을 포함한 다각적인 방안이 모색되어야한다. 한우육의 도체가격은 육량 및 육질의 등급으로 평가하는데 육량은 도체중, 등지방두께, 및 배장근 단면적에 근거하여 등급을 판정하고 육질은 근내지방도, 육색, 지방색, 조직감 및 성숙도 등으로 판정한다(축산물등급판정소, 2004). 근내지방도는 쇠고기의 관능적 특성의 기준이 되는 연도, 다즙성 및 풍미 등과 깊이 관련되어 있어 고급육 생산을 위해서는 근내지방 함량을 높이는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다. DNA 수준에서의 한우의 경제적 능력에 대한 유전적 정보는 생산자뿐만 아니라 육종가들에게 우수 한우개체를 조기 선발하는데 중요한 정보를 제공해준다. 이러한 DNA 정보는 육량 및 육질에 대하여 마커도움선발(marker-assisted selection, MAS) 방법을 적용하여 선발의 정확도를 높이고, 후대검정에 소요되는 적지 않은 경비와 시간(세대간격)을 절약하여 개량의 효율성을 높일 것으로 기대된다.
본 발명과 관련된 선행기술로는 한국 공개특허 2012-0011728이 있다.
상기와 같은 기술적 배경하에서 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)을 이용한 한우의 근내지방조직 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 한우의 근내지방조직 검출용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면,
(a) 한우에서 조직을 추출하여 준비하는 단계;
(a) 한우에서 근내, 피하, 복부의 지방조직을 추출하여 준비하는 단계;
(b) 제1항의 키트를 이용하여, 한우에서 추출된 상기 지방 조직들에 존재하는 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 및 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)유전자 중 적어도 하나의 전사체의 양을 증폭시키는 단계;
(c) 상기 증폭된 전사체를 동일 조직 내의 액틴 베타(Actin, beta, ACTB) 또는 글리세랄데히드 3-포스페이트 디하이드로기나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 유전자의 발현량과 비교하여 정량화하는 단계; 및
(d) 상기 정량화된 발현량을 비교하여, 상기 이중특이적 탈인산화효소 27 또는 상기 테노모둘린 유전자 중 적어도 하나의 유전자가 가장 높게 발현되는 지방조직을 근내지방조직으로 판정하는 단계;
를 포함하는 한우의 근내지방조직 검출 방법.이 제공될 수 있다.
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일 실시예에 따르면, 상기 전사체의 양을 증폭시키는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)을 통해 수행될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 대조구는 액틴 베타(Actin, beta, ACTB) 또는 글리세랄데히드 3-포스페이트 디하이드로기나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 유전자일 수 있다.
본 발명에 따르면 근내지방 특이 유전자 검출용 키트의 상품화가 가능하고, 한우에서 등심근 내 특이적 지방축적 유도를 통한 고급육의 생산 및 한우의 지방의 함량조절을 통한 체조성 조절 기술의 개발이 가능하며, 이를 통한 체지방 조절 정보를 다른 축종에 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 이용하여 증폭된 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)와 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)의 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 2는 상기 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자에 대한 그레디언트 PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 상기 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)와 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자에 대한 조직별 정량적 발현 양상 분석결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 용어 “프라이머”란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에 기재된 유전자의 발현량은 해당 유전자의 게놈 DNA가 mRNA로 전사(transcription)된 양을 의미한다.
본 발명에서는 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)와 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자에 대한 조직별 정량적 발현 양상을 분석하고 그 결과를 검증하여 이들 유전자의 발현량을 근내지방조직의 판별에 사용하고자 하는 것이다.
이를 위해, 우선 RNA 시퀀싱 방법을 사용하여 한우의 피하, 복부, 근내지방조직에서 부위 특이적으로 발현량 차이를 보여 주는 유전자들을 발굴 (FDR<0.01)하였다.
상기 RNA 시퀀싱은 RNA의 염기배열을 결정하는 화학적 방법이다. tRNA나 5S RNA처럼 저분자인 동시에 분자 중에 수식뉴클레오티드를 많이 포함하는 RNA의 염기순서결정에는, 2차원 박층크로마토그래피를 병용한 포름아미드분해법을 사용하는 것이 최적이다. mRNA나 rRNA 같은 고분자 RNA의 경우에는, 먼저 말단영역의 염기순서를 다양한 리보핵산가수분해효소를 사용해 시행하는 도니스-켈러(Donis-Keller)법이나, 화학적으로 RNA를 분해하여 시행하는 피아티(Peattie)법 등을 사용하여 결정한다. 이어 그 순서를 토대로 제작한 올리고 뉴클레오티드 시발체를 사용하여 역전사 PCR을 시행하고, 목적으로 하는 RNA를 DNA로 치환한 후에 그 순서를 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert)방법이나 생어(Sanger)법 등을 사용하여 결정한다.
상기 RNA 시퀀싱을 통해 동정된 유전자들 중, 발현량의 차이가 logFC≥2 이상되는 유전자들을 선별하였다. 상기와 같이 선별된 유전자들은 사람이나 다른 동물들에서 지방조직 간의 부위 특이적인 발현차이가 보고되어 있지 않고, 특히 소에서는 관련 연구가 전혀 되어 있지 않은 유전자인 것으로 밝혀졌다.
상기 선별된 유전자들을 용이하게 검출하기 위하여 각 유전자별로 프라이머를 디자인하였다. 상기 디자인된 프라이머를 이용하여, 상기 선별된 유전자에 대해 RT-PCR을 수행함으로써, 각각의 유전자에 대해 나타나는 발현산물이 근내지방에서 특이적 발현양상을 나타내는지를 확인하였다. 그 결과는 하기 표와 도면에 나타나 있다.
본 발명에서는 상기 디자인된 각각의 프라이머 특성을 적용한 근내지방 특이적 유전자 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법을 제시한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 2의 염기서열을 갖는 프라이머 세트 및 서열번호 3 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 한우 근내지방조직 검출용 키트가 제공될 수 있다.
상기 키트는 통상적으로 당업계에 잘 알려진 바와 같이 피검체의 핵산을 증폭할 수 있는 시약 및 조성물을 더 포함할 수 있다. 일반적으로는 피검체의 핵산은 PCR을 통해 증폭되는 것이 일반적이므로, PCR에 사용되는 각종 완충액과 염, 기타 뉴클레오시드 및 중합효소 등이 포함될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 키트는 서열번호 1 내지 2, 또는 3 내지 4, 또는 1 내지 4의 프라이머를 갖는 프라이머 세트; Taq DNA 중합효소(polymerase); dNTP; MgCl2; 10 x 반응완충액; ddH2O; 및 DMSO를 포함하는 것일 수 있으며, 추가로 대상 시료인 판별 대상 한우의 전사체를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 검출키트는 추가로 PCR을 수행하기 위한 온도 조절 기능이 있는 통상적인 PCR용 기기를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 의미하는 유전자의 발현량은 여러 가지 방법을 통해 알 수 있으며, mRNA에 상보적인 올리고 뉴클레오티드를 이용하는 것일 수 있다. 본원발명에서는 DNA 올리고머, 즉 프라이머를 이용하여 리얼 타임 PCR을 수행함으로써 발현량을 검출하는 것을 일 예로 들고 있으나, 노던 블롯, 마이크로 어레이와 같이 프라이머의 단편을 이용하는 방법, 또는 대용량 정보처리기를 이용한 프로그램을 이용한 것일 수도 있다.
상기 키트에 포함된 프라이머를 이용하여 PCR이 아닌 다른 방법으로 한우의 근내지방조직을 검출하고자 하는 경우에는 그에 맞는 다른 시약을 포함할 수 있다. 핵산물질간의 상보성을 이용한 하이브리드 분석법을 이용하고자 할 경우에는 당업계에 잘 알려진 시약군을 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 상기 개시된 유전자의 발현량을 알 수 있는 서열정보를 포함하고 있는 것이라면, 뉴클레오티드 핵산에 국한되지 않으며, PNA나 LNA 등도 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, (a) 한우에서 조직을 추출하여 준비하는 단계; (b) 제1항의 키트를 이용하여, 한우에서 추출된 조직에 존재하는 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 및 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자 중 적어도 하나의 전사체의 양을 증폭시키는 단계; (c) 상기 증폭된 전사체를 정량하는 단계; 및 (d) 상기 정량된 전사체를 대조구의 발현량와 비교하여 분석 단계를 포함하는 한우 근내지방조직 검출 방법이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 (a) 단계에서 한우의 조직을 추출하는 것은, 여러 종류의 조직이 혼합된 상태로 추출하는 것이 아닌, 단일 조직으로 추출되도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 경우, 근내지방조직, 피하지방조직, 복부지방조직에 대한 판정이 이루어져야 하므로, 이들 조직 간의 혼합이 있을 경우 판정결과에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있어 바람직하지 않다.
상기 (a) 단계에서의 '준비'라 함은 자연상태로 얻어진 한우의 조직을 키트에 투입하여 분석하기 용이한 상태로 만드는 것을 의미한다. 이에는 한우 조직의 파쇄, 세포의 용혈, 핵산의 분리, RNA의 보존, 게놈 DNA의 제거, 분석에 필요하지 않은 세포 소기관과 생체물질의 제거 등의 생화학적 처리과정이 포함될 수 있다. 이에는 특별한 제한은 없으며, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 조직을 추출하여 RT RCR을 수행할 수 있도록 검증된 프로토콜이면 무방하다.
일 실시예에 따르면, 상기 전사체의 양을 증폭시키는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)을 통해 수행될 수 있다.
상기 전사체의 양을 증폭시키는 단계를 통해 증폭된 DNA는 한우의 근내지방조직의 판별에 사용될 수 있다. 그 방법은 여러가지가 있을 수 있는데, 상기 DNA의 크기 및 형광정도를 이용하여 분석하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 PAGE(Polyacrylamid Gel Electrophoresis)를 이용하는 방법이나, 상기 자동염기서열분석장치를 이용하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 자동염기서열분석장치를 이용하는 방법은 구체적으로는 ABI PRISM 3130XL Genetic analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 ABI PRISM 3130XL Genetic analyzer를 사용하는 경우에는 상기 프라이머의 5' 부위에 존재하는 첫 번째 염기에 형광물질(fluorescein)의 최대 흡광도 범위에서의 형광정도 및 DNA의 크기를 이용하여 분석할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 대조구는 ACTB 유전자 또는 GAPDH 유전자일 수 있다.
이 때, 상기 ACTB 유전자 또는 GAPDH 유전자의 발현량을 검출하기 위한 프라이머 등의 재료는 상기 키트에 포함될 수 있다.
하기 실시예의 데이터를 통해 잘 나타나 있지만, 본 발명에서 마커로 사용하는 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 발현량은 근내지방조직에서 유의적으로 높다. 이들 대조구의 발현량은 상기 피검출 유전자의 발현량을 보정하거나, 비교하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 피검출 유전자의 발현량이 상기 대조구의 발현량에 비해 높을 경우, 피검출 유전자의 발현량을 '과발현'으로 판정할 수 있다.
또한, 상기 피검출 유전자의 발현량이 각각의 조직별로 다르게 나타나는 경우, 이들의 상이한 발현량을 상기 대조구의 발현량으로 보정(Normalize)함으로써, 실험상 발생하는 내재된 오차를 줄일 수 있다. 본 발명의 실시예에도 나타나 있는 바와 같이, 상기 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 발현량은 피하지방조직 및 복부지방조직에 비해 근내지방조직에서 유의적으로 높으므로, 이를 이용하여 피검체 조직이 근내지방조직인지의 여부를 판정할 수 있다.
또한, 이들의 발현량의 비를 조사함으로써, 보다 우수한 형질을 갖는 한우 개체의 발현량의 비를 데이터로 축적할 수도 있다. 이 데이터를 활용할 경우, 근내지방함량이 우수한 한우 개체를 현장에서 용이하게 판정할 수도 있다.
예를 들면, 우수한 근내지방조직 함량을 갖는 한우 개체들을 조사하여 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자의 발현량과 DUSP23 발현량을 조사하여 이를 데이터베이스화 할 수 있으며, 이를 통해 우수한 근내지방조직을 갖는 개체들의 평균 발현량을 산출할 수 있다. 이후 근내지방조직의 판정이 필요한 피검체의 상기 유전자의 발현량을 조사하여 이들 우수 개체로 부터 산출된 상기 데이터베이스와 비교함으로써, 임의의 한우 개체의 근내지방우수도를 판정할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
30 개월된 한우 9두로부터 각각 근내, 피하, 복부지방을 분리해 낸 다음, 각각의 지방조직들로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 지방의 RNA 들은 cDNA로 전환되어, Illumina HiSeq2000을 사용하여 RNA 시퀀싱 방법을 통해, 각 지방 조직의 유전자 발현 프로필(gene profile)을 생성하였다. 생성된 유전자들의 염기서열들로부터 조직에서 발현된 유전자들의 발현량을 측정할 수 있고, EdgeR을 이용하여 조직 간의 발현량을 서로 비교함으로써, 그 중에서 근내지방조직 특이적으로 발현량의 차이를 보이는 유전자들을 선별하였다.
해당 유전자의 발현 여부 확인을 위하여 각각의 유전자별 프라이머를 디자인하였으며 제작된 프라이머를 통한 PCR과정에서의 해당 DNA의 증폭 조건을 온도별 테스트를 통해 결정하였다. 최종적으로 Realtime PCR의 진행을 위한 조건을 gradient PCR을 통하여 확인하였고 이를 바탕으로 최적 조건을 결정하였다
디자인된 프라이머를 이용한 Realtime-PCR을 통해 해당 유전자의 조직별 발현 양상의 차이를 규명하였다.
실험결과
한우 근내지방 조직의 부위 특이적 발현 유전자 중 발현이 감소하는 것은 다음 표 1과 같다.
서열번호 특이조직 유전자 발현량 프라이머 방향
 염기서열
1 근내지방
 DUSP27 Up Forward ggtcaaggaagatgaggatgagg
2 Reverse cagggaggagaaggtgtctgttt
3 근내지방 TNMD Up Forward ctcttattgtcctgttttggggg
4 Reverse tcttcttcttctctccattgctgt
상기 유전자의 정량적 발현 양상 분석을 위한 Realtime PCR 조건의 RT-PCR 결과가 도 1에 나타나 있다.
도 1은 해당 유전자의 프라이머에 대한 테스트 결과를 나타낸다. 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)와 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 프라이머가 RT-PCR을 통하여 확인되었으며, M은 DNA 마커를 의미한다. Asterik(*, **)은 각각 200bp, 100bp의 크기를 의미한다. PCR 조건은 다음과 같다. 95℃ 5분(1 cycle) ; 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 (40 cycles) ; 72℃ 10분 (1 cycle).
Tm 계산기(calculator)를 통하여 확인된 각 프라이머의 Tm 값을 바탕으로 RT-PCR을 진행하였다. 전기영동 결과 위와 같은 결과를 확인할 수 있었다. 각 유전자의 프라이머를 통한 증폭 결과 테노모둘린(tenomodulin, TNMD), CCL2 및 CD136의 경우 해당 조건에서 실시간(real time) PCR을 수행하기에 부적합한 조건임을 판단. 해당 유전자의 최적 조건을 찾기 위해 그레디언트(gradient) PCR을 수행하여 최적의 조건을 확립하였다.
도 1에는 상기 서열번호 1 및 2에 의한 산물인 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 PCR 산물의 전기영동 사진과, 상기 서열번호 3 및 4에 의한 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자의 PCR 산물의 전기영동 사진이 나타나 있다.
도 2는 그레디언트 PCR 결과를 통해 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자에 대한 상기 프라이머가 56℃의 어닐링 온도에서 PCR 효율이 가장 높음을 나타낸다.
상기 서열번호 1 및 2에 의한 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자에 대한 실시간(Realtime) PCR 산물의 크기는 133bp이고, 서열번호 3 및 4에 의한 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자 산물의 크기는 105bp이다. 시퀀싱이나 RFRP를 이용할 경우 상기 유전자로부터 증폭된 산물인지의 여부를 보다 정확하게 확인할 수 있다.
하기 표 2 및 표 3은 상기 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)와 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 조직별 정량적 발현 양상의 분석결과이다. 이는 실시간(Realtime) PCR을 통하여 확인된 것이다. 레퍼런스(reference) 유전자로는 ACTB와 GAPDH가 이용되었다. 즉, ACTB의 발현양 및 GAPDH의 발현량을 1로 보았을 때의 각 유전자의 상대적 발현양을 계산하여 나타낸 것이다.
상기 각 유전자의 발현량의 차이를 보다 정확하게 산출하기 위하여, 암소 한우 3두, 거세우 3두 및 수소 한우 3두로 부터 피하지방조직, 근내지방조직, 복부지방조직을 추출하여 상기 기재된 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
하기 표 2에서 '보정'은 통계학상의 노멀라이즈(Normalize) 처리를 의미한다.

TNMD DUSP27
ACTB로 보정시 GAPDH로 보정시 ACTB로 보정시 GAPDH로 보정시
복부지방 5.8E-05 0.00076 0.00068 0.01228
피하지방 6.1E-05 0.00169 0.00021 0.00195
근내지방 0.00719 0.15542 0.00068 0.00784
상기 표 2를 참조하면, 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 유전자의 발현량을 레퍼런스 유전자인 ACTB 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)으로 보정한 2가지 경우에 있어서, 타 지방조직에 비해 근내지방에서 그 발현량이 높음을 알 수 있다. 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)의 경우에는 일 개체에 있어서의 측정값이 극히 높아 평균치 상으로는 근내지방의 값이 가장 높게 나타나고 있지는 않다.

 TNMD DUSP27
ACTB로 보정시 GAPDH로 보정시 ACTB로 보정시 GAPDH로 보정시
근내지방 / 복부지방 165.605 251.814 27.07 29.90
근내지방 / 피하지방 429.139 723.695 34.31 137.93
표 3을 참조하면, 상기 표 2에서 나타난 결과에 대하여, 오차를 고려하여 상기 레퍼런스 유전자로 보정한 결과를 알 수있다. 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자의 근내지방조직에서의 발현량이 복부지방조직 및 피하지방조직에 비해 165%~723% 수준에 이름을 알 알 수 있다.
상기 결과를 종합하면, 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 유전자의 발현은 복부지방과 피하지방의 경우에 비하여 근내지방에서 각각 166~429배, 251~723배로 고발현되었고, 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)의 경우 27~34배, 29~137배 고발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 실시간(realtime) PCR의 분석 방법이 근내지방 특이적 마커 확립 분석에 적용될 수 있음을 확인할 수 있다.
상기 표 3은 도 3에 그래프로도 나타나 있는데, 도 3의 그래프에서 세로축은 복부 및 피하지방을 기준으로 하였을 경우 근내지방에서의 상대적 발현양을 의미한다.
상기와 같은 결과를 참고할 때, 본 발명은 한우의 근내지방조직 특이적 발현 유전자 테노모둘린(tenomodulin, TNMD) 및 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27)을 이용한 한우의 근내지방조직 검출용 키트 및 검출 방법을 제공함을 알 수 있다. 본 발명에 따르면 근내지방 특이 유전자 검출용 키트의 상품화가 가능하고, 한우에서 등심근 내 특이적 지방축적 유도를 통한 고급육의 생산 및 한우의 지방의 함량조절을 통한 체조성 조절 기술의 개발이 가능하며, 이를 통한 체지방 조절 정보를 다른 축종에 적용할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Kits and methods for detecting intramuscular fat tissue of Hanwoo using TNMD and DUSP27 <130> NPF22805 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Bos taurus coreanae <400> 1 ggtcaaggaa gatgaggatg agg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Bos taurus coreanae <400> 2 cagggaggag aaggtgtctg ttt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Bos taurus coreanae <400> 3 ctcttattgt cctgttttgg ggg 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Bos taurus coreanae <400> 4 tcttcttctt ctctccattg ctgt 24

Claims (4)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, 및 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 한우의 근내지방조직 검출용 키트.
  2. (a) 한우에서 근내, 피하, 복부의 지방조직을 추출하여 준비하는 단계;
    (b) 제1항의 키트를 이용하여, 한우에서 추출된 상기 지방 조직들에 존재하는 이중특이적 탈인산화효소 27(Dual specificity phosphatase 27, DUSP27) 및 테노모둘린(tenomodulin, TNMD)유전자 중 적어도 하나의 전사체의 양을 증폭시키는 단계;
    (c) 상기 증폭된 전사체를 동일 조직 내의 액틴 베타(Actin, beta, ACTB) 또는 글리세랄데히드 3-포스페이트 디하이드로기나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 유전자의 발현량과 비교하여 정량화하는 단계; 및
    (d) 상기 정량화된 발현량을 비교하여, 상기 이중특이적 탈인산화효소 27 또는 상기 테노모둘린 유전자 중 적어도 하나의 유전자가 가장 높게 발현되는 지방조직을 근내지방조직으로 판정하는 단계;
    를 포함하는 한우의 근내지방조직 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 전사체의 양을 증폭시키는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 한우의 근내지방조직검출 방법.
  4. 삭제
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