CN114990231B

CN114990231B - 用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物、其检测试剂盒和应用

Info

Publication number: CN114990231B
Application number: CN202210714738.9A
Authority: CN
Inventors: 魏岳; 张危红; 谢金防; 武艳平; 黄江南; 唐维国; 谢明贵; 陈介文
Original assignee: Institute Of Animal Husbandry Veterinary Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Animal Husbandry Veterinary Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN114990231A

Abstract

本发明公开了用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物、其检测试剂盒和应用，所述特异性引物序列为SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了检测试剂盒及其应用和检测方法。本发明首次研究获得了影响鸡羽速性状的miRNA，本发明提供的Novel‑miR‑33可用于开发鸡羽速性状的辅助选择标记，同时用于研究miRNA在鸡羽速性状中的调控机制及信号通路；并且同时基于该miRNA研究获得了检测该miRNA表达量的特异性引物，并研发获得了检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒可用于检测Novel‑miR33在鸡皮肤组织中的表达量，筛选或选育不同羽速性状的群体，检测方法简单快捷、准确可靠。

Description

用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物、其检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的的特异性引物、其检测试剂盒和应用。

背景技术

羽毛属于家禽的表皮附属物，雏鸡出壳时，根据主翼羽与覆主翼羽的长短差异，可以区分为快羽和慢羽。研究发现，雏鸡羽毛生长速度的差异是由于位于性染色体Z上的一对等位基因决定的，其中慢羽相对于快羽表现为显性，用K表示。利用鸡羽速性状伴性遗传特点，建立的自别雌雄技术，具有快速简便、减少应激和疾病传播等优点，已在生产中得到广泛应用，国内外许多品种都采用羽速差别建立了自别雌雄配套系，如国外的海兰、罗曼蛋鸡、贵妃鸡等，我国的杏花鸡、狼山鸡、清远麻鸡等(宋素芳，康相涛，竹学军.羽速基因在养鸡业中的应用[J].中国家禽，2003，25(18)：33-36.)。然而，通过单一表型鉴定区分快羽和慢羽有时会出现判断不准(如不同羽翼间差距较小造成判断模糊)等情况，最终造成表型与实际基因型不符的问题，影响生产应用中的可靠性。因而，利用分子标记筛选，提高表型选择的可靠性，对于加快育种进度和选种的准确性具有重要意义。早期研究发现，K基因与禽白血病内源性病毒ev21(endogenous virus 21)插入片段存在紧密连锁的关系，因而常常被作为区分快慢羽类型的一个重要的分子标记来使用(韩瑾润.影响羽毛发育的生长因子及相关ev21调控的研究[D].北京：中国农业大学，2007.)(初芹，张剑，张爱平，等.北京油鸡羽速基因分子检测及其对生产性能的影响[J].中国家禽，2011，33(6)：30-33.)。然而，ev21的整合不是造成慢羽的直接原因，同时由于ev21属于是E亚型内源性白血病病毒家族成员之一，可以编码出可感染性的病毒序列，还可以弥补其它缺陷型病毒形成完整的病毒，也能与其它evs互作，调节其它前病毒的表达水平(Smith E.J.，Fadly A.M..Influence ofcongenital transmission of endogenous virus 21 on the immune response toavian leucosis virus infection and the incidence of tumors in chickens[J].Poultry Science，1988，67(12)：1674-1679.)。即使ev21的表达不直接引发鸡的白血病，但是也在一定程度上抑制鸡的免疫力，使鸡处于长期带毒状态从而影响多个生产性状，对鸡群的健康存在潜在的威胁(Fadly A.M.，Smith E.J.Influence of maternal antibodyon avian leukosis virus infection in white leghom chickens harboringendogenous virus-21(EV21)[J].Avian Diseases，1991，35(3)：443-451.)(Fadly A.M.，Smith E.J.Role of contact and genetic transmission of endogenous virus-21 inthe susceptibility of chickens to avian leukosis virus infection and tumors[J].Poultry Science，1997，76(7)：968-973.)。另外，通过对羽速基因K/k位点的研究发现，K基因上存在的串联重复，使泌乳刺激素受体(PRLR)基因和编码精子鞭毛蛋白2(SPEF2)的基因发生了部分重复，进而将PRLR基因、SPEF2基因和融合基因dPRLR/dSPEF2作为羽速的候选基因(Elferink M.G.，Vallée A.A.，Jungerius A.P.，et al.Partial duplicationof the PRLR and SPEF2 genes at the late feathering locus in chicken[J].BMCGenomics，2008，9：391.)。

现有检测羽速性状的分子标记，主要以ev21或融合基因dPRLR/dSPEF2在鸡基因组中的存在与否作为判断慢羽还是快羽的标准，或者根据羽速候选基因PRLR或SPEF2基因的表达量的变化作为判断标准。然而，ev21只是与羽速基因紧密连锁并不是造成羽速差异的直接原因，同时由于ev21的存在抑制鸡的免疫力，对鸡群的健康存在潜在的威胁，因而需要寻找新的标记为筛选不含ev21的慢羽鸡做准备。羽速候选基因DNA片段或mRNA表达量的检测可能会因为检测片段核苷酸序列的变化或其他原因造成引物扩增效率低或特异性差等问题影响判断结果。

近年来，RNA测序(RNA-seq)作为一种高通量测序技术已被广泛用于寻找与重要性状相关的关键调控非编码RNA。miRNA是长度大约在20nt的非编码RNA，其广泛存在于真核生物中并且在相近物种甚至不同物种间均具有高度进化保守性。miRNA通过与靶基因的3′UTR区结合进行转录调控，影响靶基因的表达，进而产生性状的差异。已有大量的研究表明miRNA在细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动过程中发挥着重要作用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物、其检测试剂盒和应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种简单快捷、准确可靠的检测Novel-miR33在鸡皮肤组织中表达量的检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，所述影响鸡羽速性状的miRNA为Novel-miR33，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明内容还包括一种检测影响鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物和荧光定量引物对SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

其中，所述试剂盒还包括2×RT Easy^TM Mix、2×Easy^TM Mix-SYBR、内参基因引物和Rnase-FreeddH₂O。

其中，所述内参基因引物包括内参基因反转录引物SEQ ID NO.8和内参基因荧光定量引物对SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明内容还包括所述的特异性引物或所述的检测试剂盒在鸡羽速性状鉴定、筛选或选育不同羽速性状的群体中的应用。

其中，所述应用为通过反转录和荧光定量PCR检测翅尖皮肤组织中miRNA的表达量来判断鸡羽速类型，所述影响鸡羽速性状的miRNA为Novel-miR33，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明内容还包括所述的试剂盒的检测方法，具体方法为通过反转录和荧光定量PCR检测所述的miRNA在翅尖皮肤组织的表达量判断鸡羽毛发育快慢，所述影响鸡羽速性状的miRNA为Novel-miR33，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明首次研究获得了影响鸡羽速性状的miRNA，本发明提供的Novel-miR33可用于开发鸡羽速性状的辅助选择标记，同时用于研究miRNA在鸡羽速性状中的调控机制及信号通路；并且同时基于该miRNA进一步研究获得了检测该miRNA表达量的特异性引物，并进一步研发获得了检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒可用于检测Novel-miR33在鸡皮肤组织中的表达量，用于筛选或培育不同羽速类型的群体，检测方法简单快捷、准确可靠。

附图说明

图1双荧光素酶相对活性检测结果；PRLR-NC表示为商业化的pmirGLO质粒、PRLR-3′-UTR-WT表示pmirGLO质粒中WT片段、PRLR-3′-UTR-MT表示pmirGLO质粒中WT片段，miRNA-NC表示miRNAmimics的阴性对照；

图2 Novel-miR33在不同羽速个体皮肤组织中相对表达量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1基于RNA-seq和mRNA联合分析获得影响鸡羽速性状的miRNA---Novel-miR33

1、测序样本采集

实验所用群体来自江西省农业科学院畜牧兽医研究所饲养管理水平一致的崇仁麻鸡快羽和慢羽群体。经过多个世代选育，保证羽速基因型与表型性状相一致，并在各自群体中保持纯合。收集快羽和慢羽各自群体孵化15天和18天的鸡胚以及初生雏鸡的翅尖皮肤组织，每个阶段每组4个样品，保存于液氮中，miRNAs和mRNAs的测序由武汉华大医学检验所有限公司高通量实验室完成。

2、差异表达miRNA的筛选及其靶基因关联分析

将测序得到的各个样本中差异表达miRNA按组内和组间进行比较，得到组间各时期特异差异表达miRNA和各时期均特异差异表达miRNA。使用常用生物信息软件如RNAhybrid、miRanda和TargetScan预测各差异表达miRNA的靶基因，然后选择对应的交集或者并集作为预测结果。同时，基于相同样品在两个组学的表达量，进一步分析miRNA及其靶基因的关联关系，使用R包计算pearson相关系数，选择相关系数绝对值在0.6的靶关系，对每组差异的结果进行分类，显示miRNA与靶基因呈负相关还是正相关，并重新进行GO和KEGG富集分析。共筛选到7个与羽速性状候选基因PRLR和SPEF2基因互作miRNA且均表现为高度负相关，其中，gga-miR-1560-3p、novel-miR33和novel-miR311与PRLR基因高度负相关，novel-miR158和SPEF2基因高度负相关。进一步筛选发现，novel-miR33在各检测时期两组间的样品中均表现为差异表达，且在显著富集的前20个信号通路中，novel-miR33的多个靶基因处于多个重要的信号通路中(表1)。根据测序结果得到的novel-miR33序列如SEQ IDNO.1所示，经多个生物信息软件交集预测，得到novel-miR33与靶基因PRLR基因的结合序列(WT，SEQ ID NO.2)。

Novel-miR33：5′-AAGCUGCUGCCCGUGUUCAGGUG-3′(SEQ ID NO.1)

WT：5′-GCTAGCCTACTGATAGAGTATCTGGAAGTAGAGGACAGCGAGGATCAGCAGCTTATGCCAAGTCATGACAATTCTAGA-3′(SEQ ID NO.2)

表1 Novel-miR33靶基因显著富集的通路

3、双荧光素酶验证miRNA与靶基因结合位点

根据武汉华大医学检验所有限公司高通量测序获得的novel-miR33核苷酸序列(SEQ ID NO.1)及预测的靶基因结合序列(SEQ ID NO.2)，合成novel-miR33 mimics(SEQID NO.1)和阴性对照miRNA-NC(SEQ ID NO.3)，由广州市锐博生物科技有限公司完成。将靶基因原始结合序列(WT，SEQ ID NO.2)和靶基因突变序列(MT，SEQ ID NO.4)分别连接到含双荧光素酶报告基因的pmirGLO质粒上，分别构建PRLR-3′-UTR-WT和PRLR-3′-UTR-MT载体，由武汉金开瑞生物工程有限公司完成。

将miRNA与不同的靶基因序列载体组合，共设计6组实验组合(表2)，利用脂质体Lipofectamine2000共转染鸡胚成纤维细胞(DF-1)，脂质体和DF-1细胞分别购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司和赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，转染24-48h后裂解细胞，利用购自上海碧云天生物技术有限公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒，检测各组别萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性值并计算相对比值。结果显示，novel-miR33 mimics与含WT序列载体组合中双荧光素酶的相对比值要极显著低于空白对照与相同载体的组合，同时极显著低于novel-miR33 mimics与含MT序列载体组合，而其他组别差异不显著，表明novel-miR33与其靶基因即羽速候选基因PRLR存在确定的靶向关系(图1)。

miRNA-NC：5′-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3′(SEQ ID NO.3)

MT：5′-GCTAGCCTACTGATAGAGTATCTGGAATGCAGAAGAGATGTTCACACAAGGACTATGCCAAGTCATGACAATTCTAGA-3′(SEQ ID NO.4)

表2双荧光素酶实验转染设计分组

4、qPCR对不同羽速个体皮肤组织中novel-miR33表达量验证

采集崇仁麻鸡初生雏鸡的快羽和慢羽个体各4只的翅尖皮肤组织，分别提取总RNA。根据武汉华大医学检验所有限公司高通量测序获得的novel-miR33核苷酸序列，即SEQID NO.1，设计特异性反转录引物(SEQ ID NO.4)和荧光定量引物(SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6)。内参基因引物序列根据NCBI中GGA-5s rRNA序列(登录号：X01309.1)设计反转录引物(SEQ ID NO.7)和荧光定量引物(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)。利用购自成都福际生物技术有限公司的反转录RT Easy^TM I试剂盒和荧光定量RT-qPCR Easy^TM-SYBR Green I试剂盒，按照常规反应体系和扩增程序，对该miRNA在不同羽速个体皮肤组织中的表达量进行测定。

novel-miR33 RT：

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACCTG-3′(SEQ ID NO.5)

novel-miR33：F：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′(SEQ ID NO.6)

R：5′-TGCCCGAAGCTGCTGCCCGTG-3′(SEQ ID NO.7)

gga-5s RT：5′-CTCGGCTGCTGTTGGAAACTCC-3′(SEQ ID NO.8)

gga-5s：F：5′-GAGGTCTCCCATCCAAGTACTAAC-3′(SEQ ID NO.9)

R：5′-CCTGGGCTGCTTTGAAGA-3′(SEQ ID NO.10)

反转录体系为20μl：2×RT Easy^TM Mix 10.0μl；特异性反转录引物(SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.8)(浓度2μM)1μl；RNA4.0μg；补足Rnase-Free ddH₂O至20μl。反转录反应程序：42℃逆转录20min；85℃失活5min；-20℃保存。

荧光定量反应体系为20μl：2×Real PCR Easy^TM Mix-SYBR 10.0μl；上下游引物(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7；或SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)(浓度10μM)各0.8μl；模板cDNA 2.0μl；ddH₂O 6.4μl。荧光定量反应程序：95℃预变性3min；95℃10sec，60℃20sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec获得溶解曲线。运用2^-ΔΔCT方法分析边鸡快羽和慢羽个体皮肤组织中novel-miR33的相对表达量。由图2可知，qPCR显示快羽个体中该miRNA的表达量为慢羽个体的64倍左右，与RNA-seq的测序结果趋势一致。本发明提供的试剂盒可用于检测novel-miR33在鸡皮肤组织的表达量，检测方法简单快捷，本发明提供的novel-miR33可用于鸡羽速性状的辅助选择标记，同时用于研究miRNA涉及鸡羽毛发育过程中的调控机制。

序列表

<110> 江西省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物、其检测试剂盒和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcugcugc ccguguucag gug 23

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctagcctac tgatagagta tctggaagta gaggacagcg aggatcagca gcttatgcca 60

agtcatgaca attctaga 78

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uuuguacuac acaaaaguac ug 22

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctagcctac tgatagagta tctggaatgc agaagagatg ttcacacaag gactatgcca 60

agtcatgaca attctaga 78

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccacctg 50

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atccagtgca gggtccgagg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcccgaagc tgctgcccgt g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcggctgct gttggaaact cc 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggtctccc atccaagtac taac 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctgggctgc tttgaaga 18

Claims

1.一种检测影响崇仁麻鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性引物如SEQ ID NO.5所示和荧光定量引物对SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求 1所述的检测影响崇仁麻鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×RT Easy^TM Mix、2×Easy^TM Mix-SYBR、内参基因引物和Rnase-FreeddH₂O。

3.根据权利要求 2所述的检测影响崇仁麻鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒，其特征在于，所述内参基因引物包括内参基因反转录引物SEQ ID NO.8和内参基因荧光定量引物对SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4.权利要求1所述的试剂盒在鸡羽速性状鉴定、筛选或选育不同羽速性状的群体中的应用，其特征在于，所述应用为通过反转录和荧光定量PCR检测翅尖皮肤组织中miRNA的表达量来判断崇仁麻鸡羽速类型，所述影响鸡羽速性状的miRNA为 Novel-miR33，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求1~3任一项所述试剂盒的检测方法，其特征在于，具体方法为通过反转录和荧光定量PCR检测所述的miRNA在翅尖皮肤组织的表达量判断崇仁麻鸡羽毛发育快慢，所述影响鸡羽速性状的miRNA为 Novel-miR33，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。