CN109439763B - 一种鉴定817肉鸡和黄脚土鸡的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种817肉鸡和黄脚土鸡的分子标记及鉴定方法应用。所述分子标记为线粒体基因组的第1213bp处的C/T碱基突变，所述分子标记黄脚土鸡基因序列为C，817肉鸡为T。利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对含有所述分子的基因片段进行扩增，将所得扩增产物用限制性内切酶BspMI酶切，根据酶切结果来判断该突变位点的基因型。本方法操作简便，结果可靠。采用本发明的方法能够快速、准确鉴别817肉鸡和黄脚土鸡，该法易于操作，费用低，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种鉴定817肉鸡和黄脚土鸡的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴定817肉鸡和黄脚土鸡的分子标记及应用。
背景技术
817肉鸡又称肉杂鸡，是用快大型白羽肉鸡父母代父系公鸡作为父本与高产商品代褐壳蛋鸡杂交，生产小型肉鸡的一种杂交制种模式。用于生产西装鸡、分割鸡等产品时，一般饲养至42～49天上市，出栏体重1200～1500克，料肉比1.85～2.0。土鸡指地方品种或者不同品种的地方鸡种间的杂交培育而成，一般饲养至100天以上上市，出栏体重1200～1500克，料肉比3.5左右。
近年来禽流感等家禽重大疫病持续爆发，已经影响到公共卫生，取缔活禽交易，冷鲜上市成为一个趋势。冷鲜上市之前不同档次肉鸡可以通过羽色等外观进行区分，屠宰以后黄脚土鸡和817肉鸡从外观上难以区分，因此市场上好多不良商家以次充好，817当土鸡卖，造成了市场混乱。这些现象的发生，不仅阻碍肉鸡产业结构的升级，也间接造成肉鸡行业内诚信的缺乏，使整个行业面临信任危机，一些优秀的企业在发展中也必然会受到一定的负面影响。因此亟需一种快速、准确而有易于操作的技术鉴别817肉鸡和黄脚土鸡，保证我国肉鸡行业有序、健康、稳定发展，满足人民多元化的家禽产品需求。
线粒体属于细胞核外物质，遗传物质通过卵细胞质传递，祖先的线粒体基因组类型一般能得以保持，可以通过线粒体序列的不同追溯个体的母系祖先，家养畜禽虽然经过几千甚至上万年的杂交繁育，系统关系依然清晰明了。817肉鸡母系来源于西方高产蛋鸡，与国内黄脚土鸡母系有着不同的母系来源。迄今为止，也未见利用分子标记方法对817肉鸡和黄脚土鸡进行鉴定的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种鉴定817肉鸡和黄脚土鸡的SNP标记。
本发明的目的之二在于提供用于检测上述分子标记的引物。
本发明的第目的之三在于提供上述分子标记的用途。
本发明目的之四在于提供利用上述分子标记的检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种鉴别817肉鸡和黄脚土鸡分子标记，所述分子标记为位于线粒体基因组1213bp处的SNP位点，其存在T/C多态性，当该位置碱基为T时，为817肉鸡，当该位置碱基为C时，为黄脚土鸡。
一种鉴别817肉鸡和黄脚土鸡的方法，为提取鸡基因组DNA，检测线粒体基因组1213bp 处的碱基变异，当该位置碱基为T时，为817肉鸡，当该位置碱基为C为黄脚土鸡。
本发明还提供一种鉴别817肉鸡和黄脚土鸡分子标记，通过引物对SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2扩增鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶BspMI酶切扩增产物，获得一条694bp扩增片段的为黄脚土鸡，获得487bp和207bp两条扩增片段的为817肉鸡。
本发明还提供一种鉴别817肉鸡和黄脚土鸡分子标记的引物对，其中：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-CTGGACTACACCTGCGTTGCG-3'
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TGCCTGATACCTGCTCCTTTT-3'。
本发明还提供含有上述引物对的用于鉴别817肉鸡和黄脚土鸡基因型的试剂盒。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在鉴别817肉鸡和黄脚土鸡中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在筛选黄脚土鸡中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在筛选817肉鸡中的应用。
本发明还提供一种鉴别817肉鸡和黄脚土鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1/SEQID NO.2扩增鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶BspMI酶切扩增产物，获得一条694bp扩增片段的为黄脚土鸡，获得487bp和207bp两条扩增片段的为817肉鸡。
本发明还提供817肉鸡和黄脚土鸡的基因型快速鉴定方法，包括以下步骤：
1)提取待测鸡的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板(上述—817和黄脚土鸡)，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)步骤2中PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)10μL，10μmol/L 正方向引物各0.5μL，50-100μg/ml模板DNA 1μL，灭菌水8μL；
4)步骤2中PCR反应程序为：94℃5min，(95℃30s，55℃30s，72℃45s)35循环， 72℃10min；
5)用限制性内切酶BspMI酶切扩增产物，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果呈现2条带的为817肉鸡，仅为1条带的为黄脚土鸡。
有益效果：
本发明利用线粒体序列的差异鉴别817肉鸡和黄脚土鸡，优点在于能够快速、准确鉴别 817肉鸡和黄脚土鸡，可用于市场上不同档次冰鲜鸡的鉴别，打击以次充好的不良商家。并且该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
图1 817肉鸡和黄脚土鸡分子鉴定PCR扩增片段电泳结果。
图2碱基突变位置处测序峰图。
图3 BspMI酶切后琼脂糖电泳结果图。
具体实施方式
以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1 817肉鸡和黄脚土鸡分子检测方法的建立
1.1引物设计
申请人对817肉鸡群体和黄脚土鸡群体线粒体基因组进行全长测序，发现两个群体在 1213bp处存在变异，设计引物扩增该候选位点。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-CTGGACTACACCTGCGTTGCG-3'
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TGCCTGATACCTGCTCCTTTT-3'
1.2PCR扩增
PCR反应体系为：2×PCR Mix 10μL，10μmol/L正方向引物各0.5μL，50-100μg/ml模板DNA 1μL，灭菌水8μL。
PCR反应程序为：94℃5min，(95℃30s，55℃30s，72℃45s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。检测结果显示PCR产物均为特异的一条694bp的片段，其中，M为DNA Marker(DL 2000)，将PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，对测序序列进行比对筛选变异位点，在487bp处发现(C-T)变异位点，测序峰图见图2，其中上述扩增片段487bp处变异位点在鸡线粒体基因组上的位置是1213 bp(参考序列为GU261716)，并且仅当该位点碱基是T时，存在BspMI酶切位点，为817肉鸡，即利用此处变异位点可以区分黄脚土鸡和817肉鸡。
由于线粒体基因组序列不发生同源重组，因此无杂合子基因型，该位点碱基是C时是无酶切位点的CC纯合型，该位点碱基是T时为有酶切位点的TT纯合型。用BspMI酶切上述PCR产物，反应体系为PCR产物10μL，10×缓冲液1μL，BspMI酶(5U)0.5μL将样品混合均匀后离心，置于37℃水浴锅孵育5h。反应结束后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。CC型电泳检测只有一条694bp的条带，TT型为有酶切位点的纯合型，电泳检测时有487bp和207 bp的两条带，见结果如图3(其中1～3为817肉鸡，4～12为黄脚土鸡)。
实施例2本发明的分子标记在黄脚土鸡和817肉鸡中的应用
817肉鸡来自山东家禽科学研究所，黄脚土鸡为优质型黄羽肉鸡，上市日龄均在100天以上，粤禽皇3号来自广东粤禽育种有限公司，参皇鸡1号来自广西参皇养殖集团有限公司，京海黄鸡来自江苏京海禽业集团有限公司。每个品种60只，总数为240只。
表1是利用本发明的分子标记检测的817肉鸡和3个品种的黄脚土鸡基因型分布情况。
Figure BDA0001868629350000041
由表1可知，含有CC型的个体均为黄脚土鸡，具有TT型基因型的个体为817肉鸡，即817肉鸡和黄脚土鸡在在本发明发现的变异位点上存在差异，说明该方法能有效、可靠地鉴别817肉鸡和黄脚土鸡。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种鉴定817肉鸡和黄脚土鸡的分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggactaca cctgcgttgc g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcctgatac ctgctccttt t 21

Claims (1)

1.一种鉴别817肉鸡和黄脚土鸡的方法，其特征在于，通过引物对SEQ ID NO.1/ SEQID NO.2扩增鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶BspMI酶切扩增产物，获得一条694 bp扩增片段的为黄脚土鸡，获得487 bp和207 bp两条扩增片段的为817肉鸡。
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