CN111926085B - 一种影响鸡肌肉亮度的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种影响鸡肌肉亮度的分子标记及其应用，属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域。本发明影响鸡肌肉亮度的分子标记是通过对大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡组建的F2代资源群体741只试验鸡进行全基因组关联(GWAS)分析得到，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本1号染色体上的第194652137bp处有一个C>T的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.1194652137C>T)，定位在其附近的基因为肌凝蛋白7A（myosin VIIA，MYO7A）基因，突变显著影响了鸡的胸肌肌肉亮度。本发明公开了该分子标记的获得及应用。本发明还提供了一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型检测方法，利用方法可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡肉品质遗传改良中，从而提高鸡的肉品质。

Description

一种影响鸡肌肉亮度的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域，特别涉及一种影响鸡肌肉亮度的分子标记及其应用。

背景技术

鸡肉是世界第一大肉类产品，占所有肉类的39％(FAO，2017)。鸡肉是中国第二大肉类产品，占肉类总产量的15.2％。2018年我国猪肉产量和牛奶产量分别下降4.71％和17.44％的情况下，禽肉产量增加了13.90％，禽蛋产量增加了8.09％，到2019年，我国肉鸡产量预计达到1680万吨(白羽肉鸡1100万吨，黄羽肉鸡580万吨)，将增长43.59％。因此，家禽产业已成为我国畜牧业重要的组成部分。

目前，中国的肉鸡主要分为白羽肉鸡、黄羽肉鸡及肉杂鸡三类，其中白羽肉鸡和黄羽肉鸡生长速度快，周期短，因此成为肉鸡养殖户的主要养殖对象。数据显示2014年—2019年中国白羽鸡肉出栏量始终高于黄羽鸡肉出栏量。白羽肉鸡抗逆性差，发病率高，肉质风味不能满足消费者需求。随着消费者对鸡肉品质要求的不断提高，白羽肉鸡难以满足市场需求。然而，我国优质肉鸡育种在体型外貌及体尺、生长速度等高遗传力性状方面取得一定的遗传进展，但对肉品质、繁殖和饲料利用率等重要经济性状的选择进展缓慢。随着消费水平的提高，对优质肉鸡的需求逐年增长，优质肉鸡产品研发与产业化将成为新一轮推动肉鸡产业持续发展的强大动力，优质禽肉的供给是满足我国乃至世界禽肉市场的迫切需求。

作为影响家鸡重要经济性状指标的肉品质特性的重要指标，肉色是指生肉的颜色和光泽，其反映了肌肉生理学、生物化学的变化，是肌肉外观评定的重要内容。常以用L值(亮度)、a值(红度)及b值(黄度)作为肉色的测定指标，其中L越低，肉色越好，主要是因为肌肉的亮度与肌肉表面光反射特性有关，而肌肉表面光反射强度又与肉面水分含量呈正相关关系。因此，肌肉亮度是家鸡肉品质选育中重要的表型性状。

在当前优质肉鸡需求不断增加的时代，采用全基因组关联分析的方法，开展以肉品质为重点的相关遗传机理研究，找到与家鸡肌肉亮度相关的SNP分子标记，深入挖掘地方鸡肉品质性状的功能基因和多态位点，可促进肉品质性状选育进度，进而节省新品系选育的成本，并可充分发挥云南地方鸡种资源的优势。

发明内容

鉴于以上研究背景，本发明的首要目的在于提供一个影响鸡肌肉亮度的SNP分子标记。本发明基于云南地方鸡种大围山微型鸡与隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，运用全基因组关联分析的方法寻找与鸡肌肉亮度相关的SNP分子标记，以此作为鸡肌肉亮度相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述影响鸡肌肉亮度的分子标记在鉴定鸡肉品质和遗传育种中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型检测方法。

本发明的第四个目的在于提供一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型在鉴定鸡肉品质中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种影响鸡肌肉亮度的SNP分子标记的获得方法，其在于下列步骤：

1)组建大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，获得741只试验鸡，均于90日龄时测定胸肌肌肉亮度；

2)提取F2代群体鸡基因组DNA；

3)构建DNA文库，进行全基因组重测序；

4)对测序原始数据质控、过滤后，利用BWA、Samtools等软件进行SNP检测；

5)结合肌肉亮度表型数据，采用GEMMA软件进行表型和基因型以及协变量的关联分析，确定与鸡肌肉亮度相关联的SNP。利用ANNOVAR软件对目标区域内的基因进行功能注释；

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与鸡肌肉亮度相关联的SNP分子标记，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本1号染色体上的第194652137bp处有一个T>C的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.1

194652137C>T)，定位在其附近的基因为肌凝蛋白7A(myosin VIIA，MYO7A)基因，突变显著影响了鸡的胸肌肌肉亮度；

所述的影响鸡肌肉亮度的分子标记在鉴定鸡肉品质和遗传育种中应用；

一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型检测方法，以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；若Chr.1 194652137C>T为C碱基，则为CT基因型；若Chr.1 194652137C>T为T碱基，则为TT基因型。

采用的特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GCTCAATCTTGCCTCTGGGT-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCTGGCTGGGGATCAGATA-3’。

一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型在鉴定鸡肌肉亮度中的应用，所述的基因分型利用一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型检测方法获得。

一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用，所述的基因分型利用一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型检测方法获得，淘汰TT基因型，保留CT基因型，以逐代提高1号染色体上的第194652137位点的等位基因C的频率，从而提高后代鸡的肉品质。

所述的种鸡优选为大围山微型鸡；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明研究并确定影响肌肉亮度相关的分子标记，验证其对肌肉亮度的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡肉品质的遗传改良中，从而提高选择强度，降低育种周期，进而提高育种效率，降低育种成本。

附图说明

图1为在鸡1号染色体上关于肌肉亮度的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2为有关鸡肌肉亮度主效突变位点Chr.1 194652137C>T不同基因型的测序结果峰图；

其中(a)表示基因型为CT型的测序结果峰图，(b)表示基因型为TT型的测序结果峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

试验例1试验鸡群饲养与肌肉亮度测定

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群体是由大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡杂交而来的F2代资源群体。

F0代是从大围山微型鸡(来源于云南农业大学实习鸡场)和隐性白洛克肉鸡(来源于昆明云岭广大种禽饲料有限公司)分别选取种鸡，所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正。大围山微型鸡一个未经选育的小型鸡种，其个体小(平均体重0.7-1.2kg)、耗料少、基础代谢低等优点，是培育优质、节粮型家鸡新品种(系)的优良素材。隐性白洛克肉鸡属于快大白羽肉鸡，是从白洛克中选育而成，其羽毛的白色为隐性性状。

大围山微型鸡-隐性白洛克肉鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建正交系和反交系各4个，正交系：大围山微型鸡♂×隐性白洛克肉鸡♀；反交系：隐性白洛克肉鸡♂×大围山微型鸡♀。正交系和反交系均按照公母鸡1：3比例配组而成。F0代采用人工授精共产生F1后代数为正交80只，反交146只。正交系挑选公母鸡各20只(1:1配对)进行F1代的横交，反交系挑选公母鸡各30只(1:1配对)进行F1代的横交，得到F2代资源群741只鸡，其中正交259只，反交482只。

(2)饲养实验

试验鸡于云南农业大学实习鸡场进行饲养，饲养至12周龄。日粮饲喂分为两个阶段：0-4周龄为雏鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.00MJ/Kg，粗蛋白为19.80％；5-12周龄为生长鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.10MJ/Kg，粗蛋白为18.00％。

(3)肌肉亮度测定

试验鸡于12周龄时进行屠宰实验，测定胸肌肌肉亮度，测定前12小时停止提供日粮和饮水。

试验例2影响鸡肌肉亮度的分子标记的获得

(1)血液样品采集

采用含有EDTA-二钾的真空采血管进行试验鸡翅静脉采血。

(2)基因组DNA的提取及鉴定

采用Gentra Puregene Blood Kit(Qiagen)柱式离心法试剂盒提取血液基因组DNA，待DNA完全溶解后用NannoDrop核酸分析仪检测其浓度，并在1％琼脂糖凝胶电泳条件下检测DNA条带的完整性。

(3)DNA文库构建与测序

文库的构建利用NEBNext DNA librarykit(NewEnglandBiolabs)完成，具体操作步骤为：首先将基因组DNA随机打断成小片段，然后在长度为500bp左右的片段上连接上Illumina双末端接头，经过PCR扩增和纯化后得到DNA文库，使用Illumina Hiseq 2500高通量测序仪对试验样本进行测序。

(4)基因组内变异检测

1)数据质控

对测序得到的原始reads，首先利用FastQC软件对数据的质量进行质量分析。根据数据的质量，接下来利用NGSQC Toolkit对原始reads进行质控，主要剔除在建库和测序中残留的引物和接头和质量较低的reads。

2)测序reads比对和变异检测

采用Ensembl数据库中原鸡基因组Gallus_gallus.GRCg6a，利用BWA软件对参考基因组构建索引。将质控之后的高质量reads利用BWA-MEM比对到鸡的参考基因组上，利用Picard软件将比对后的SAM文件转换成二进制的BAM文件，再利用Samtools软件按照参考基因组的物理位置信息对比对好的BAM文件进行排序，并进行SNP分析，得到SNP数据集。

3)全基因组关联分析

GEMMA(http://www.xzlab.org/software.html)是一款专门用于GWAS分析的软件，利用该软件采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)同时对群体结构和个体亲缘关系进行校正，性别作为固定效应，同时减少计算时间。使用GEMMA对群体的肌肉亮度进行关联分析，筛选出潜在的符合哈迪-温伯格平衡检验P＜1×10^-6(卡方检验)和最小等位基因频率(MAF)≤0.05的SNP。

4)基因组变异的功能注释

基于Ensembl数据库中的鸡基因组注释信息，利用ANNOVAR软件对所检测到的所有SNP变异进行注释。

(5)不同基因型与肌肉亮度的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点Chr.1 194652137C>T与胸肌肌肉亮度极显著相关(P<0.001)，在其附近区域的基因是肌凝蛋白7A(myosin VIIA，MYO7A)基因，说明此分子标记显著影响鸡的肉品质，可以通过对此SNP位点的辅助选择，改善鸡的肉品质，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，CT型比TT型的平均肌肉亮度低(未发现CC基因型)，说明纯合子TT可提高平均肌肉亮度，但对肉品质是最不利的。通过表2进一步得知，杂合子CT与纯合子TT基因型肌肉亮度显著差异，这进一步说明杂合子CT对肉品质最有利，可促进鸡的肉品质改善。因此，TT基因型的鸡的肉品质是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰TT型的种鸡，保留CT型的种鸡，以逐代提高该杂合基因型的频率。

表1分子标记的SNP位点Chr.1 194652137C>T与肌肉亮度的相关性

表2分子标记的SNP位点Chr.1 194652137C>T不同基因型组间差异性

基因型	P值
		CC-CT	-
CC-TT	-
		CT-TT	1.15×10<sup>-2</sup>

试验例3一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型检测方法

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群群体为云南农业大学的90日龄大围山微型鸡种鸡200只(公母各100只)，为种鸡核心群。进行屠宰实验，测定胸肌肌肉亮度。

(2)目的DNA序列扩增及测序

1)引物设计

通过NCBI网站下载鸡的1号染色体上肌凝蛋白7A(myosin VIIA，MYO7A)基因的DNA序列，并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-GCTCAATCTTGCCTCTGGGT-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCTGGCTGGGGATCAGATA-3’。

2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1.0μL，双蒸水10.5uL，2×TSINGKE^TM Master Mix12.5μL，引物primer-F和primer-R各0.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50-68℃退火30s，72℃延伸30s，经35个循环，72℃延伸7min，4℃保温。

3)DNA序列测定

最后对PCR扩增后的产物进行测序，基因片段测序要求为双向测通。

测序结果如SEQ ID NO:1所示。

注：序列表中N为突变位点。

(3)分子标记的SNP位点g.422C>T基因型分析

根据表3可知，大围山微型鸡种鸡中分子标记的SNP位点g.422C>T基因型TT型比CT的平均肌肉亮度高，说明杂合子CT对肉品质是最有利的。这进一步说明杂合子CT可促进鸡的肉品质改良。

表3分子标记的SNP位点g.422C>T不同基因型肌肉亮度差异

试验例4分子标记的SNP位点g.422C>T效应分析

本发明提供一个能显著提高鸡肉品质SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快鸡肉品质改良进程。若本发明将影响鸡肉品质的分子标记的TT型个体全部选育成CT型个体，则大围山微型鸡种鸡群体平均肌肉亮度可以降低1.57，可显著改善种鸡的肉品质。

本SNP分子标记个体中，通过优选云南地方鸡该SNP的优势等位基因(C)，可最终实现提高商品鸡的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种影响鸡肌肉亮度的分子标记及其应用

<130> 2020-7-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 607

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<220>

<221> misc_feature

<222> (422)..(422)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gctcaatctt gcctctgggt tagcagctgc cctttgcatt agcacttgtt agcatgactc 60

tgccaaacat cattcattca tgttcataat ctccctggat gcctgtgaat ggcttagtga 120

gggagctcag aggcagagct ttcgtgaagg agaagctttt atctgtgggc aatctgatat 180

tgtacatgtg aaatcttatc caaggacttc tcttcattta gcaaggcaac agacatttgg 240

ctgatggctt agggaccccc aggagagata cacagacacc acttaaaaaa tatccagcac 300

gatcccaaat ttctcacaga gagacgcatg ggatttccct tggtaccact acagggtgtc 360

cacaaacagg agaaaagggt gaacagatat gaacagcctg ttctctgaat gagccaatca 420

cntcaaacta ttggctagct gtagatcttg ggtggcattc aggttgcctg aattcagtta 480

ttcacatgag tatgatatca aattttgaaa ctggacatat gctgagctgg aatttggact 540

gtagatgtcc agccccaact ttccttccaa tgtaatgttt tcaaggatat ctgatcccca 600

gccagct 607

Claims (2)

1.一种影响鸡肌肉亮度的SNP分子标记在鉴定大围山微型鸡鸡肉品质或大围山微型鸡鸡肉品质调控相关的遗传育种中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本1号染色体上的第194652137bp 处有一个C>T的核苷酸单碱基突变，命名为：Chr.1 194652137C>T，定位在其附近的基因为肌凝蛋白7A基因，突变显著影响了鸡的胸肌肌肉亮度。

2.一种影响鸡肌肉亮度的分子标记基因分型在鉴定大围山微型鸡鸡肉品质或大围山微型鸡鸡肉品质调控相关的遗传育种中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本1号染色体上的第194652137bp 处有一个C>T的核苷酸单碱基突变，命名为：Chr.1 194652137C>T；所述的基因分型通过以下方法获得：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GCTCAATCTTGCCTCTGGGT-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCTGGCTGGGGATCAGATA-3’；

若Chr.1 194652137C>T为C碱基，则为CT基因型；若Chr.1 194652137C>T为T碱基，则为TT基因型；TT基因型的肌肉亮度高于CT基因型；育种时，淘汰TT基因型，保留CT基因型。

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