CN110079612B - 一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的snp分子标记及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记及其检测方法与应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且SEQ ID NO:1的第534位为A或G。本发明还提供了与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测引物，所述检测引物包括SEQ ID NO:2所示的正向引物，和SEQ ID NO:3所示的反向引物。本发明通过设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，检测待测鸡SNP位点的基因型，能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性，可以节省生产成本并加快遗传发展，更好地服务于优质鸡的育种，具有很大的经济价值和科研价值。

Description

一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记 及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记、检测引物、检测试剂盒及应用。

背景技术

鸡肉由于具有高蛋白、低胆固醇、低脂肪和低热量等特点，已成为世界各地消费者普遍接受的优质动物蛋白质来源。另外，与猪、牛相比，肉鸡具有饲养周期短、饲料转化率高、饲养及加工自动化程度高等优点，因此，鸡肉也是最经济的动物蛋白质来源。目前，鸡肉虽然已成为我国仅次于猪肉的第二大肉类消费品，但鸡肉的人均消费量还远远低于世界发达国家和国际水平，市场增长潜力空间大。随着生活水平的提高和消费观念的转变，色、香、味俱佳且安全的鸡肉越来越受到消费者的青睐。因此，探究骨骼肌生长发育调控机制、保证鸡快速安全生长并保持肉品质的同步改良是当今肉鸡育种工作者面临的重要理论和实践问题。

富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3(Cysteine and glycine richprotein 3, CSRP3)又被称为肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)，是肌细胞分化所必须的正向调节因子，在不同物种中其表达模式保守，主要表达于横纹肌(心肌和骨骼肌)中。Xu等(Xu X et al.,2010)克隆和分析了猪CSRP3 基因，发现猪CSRP3基因的C1924T突变与猪肉系水力、PH值等肉品质紧密关联。He等(He H et al.,2014)研究表明，CSRP3基因有4个单核苷酸变异位点与中国地方品种秦川牛和荷斯坦牛的生长性能和屠宰性状显著相关，荧光定量PCR试验表明CSRP3基因主要在肌肉和心脏中表达，提出 CSRP3基因可作为选育牛生长发育性能和屠宰性状的潜力标记基因。目前尚未有CSRP3基因与鸡肌肉生长和肉品质性状相关的研究报道。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记，具有数量多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。结合PCR技术、电泳、荧光等方法的SNP 检测方法，在动植物遗传育种中起到重要作用。现有技术中尚未发现同时与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记及应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP 分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且SEQ ID NO:1的第534位为A或G。

本发明还提供了一种上述与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的 SNP分子标记的检测引物，所述检测引物包括SEQ ID NO:2所示的正向引物，和SEQ ID NO:3所示的反向引物。

本发明还提供了一种用于鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状检测的试剂盒，所述试剂盒包上述检测引物。

本发明还提供了上述的检测引物或试剂盒在早期选择鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状中的应用。

本发明还提供了上述的检测引物或试剂盒在鸡遗传育种中的应用。

本发明又提供了所述的与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的 SNP分子标记的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增待测鸡的基因组DNA，得到PCR扩增产物。

(2)将所得PCR扩增产物测序后，获得所述SNP分子标记第534 位的基因型。

进一步的，PCR扩增所用的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3 所示。

本发明的有益效果：本发明提供了一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记，针对该分子标记位点的单核苷酸多态性，设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，通过测序分析，检测待测鸡 SNP位点的基因型，能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性，对鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状进行早期选择，可以节省生产成本并加快遗传发展，更好地服务于优质鸡的育种，具有很大的经济价值和科研价值。

附图说明

图1是本发明实施例中的基因分型结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。

本发明的与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记，所述分子标记位于SEQ ID NO:1所示核苷酸的第534位，该位点的核苷酸为A或G，导致该基因位点的单核苷酸多态性。PCR扩增得到与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于鸡 CSRP3基因编码区(GenBank转录本登录号：NM_001199486.1)，为第5外显子的633位碱基处的A/G突变。

本发明还公开了所述的SNP分子标记的检测引物组，包括：

5nmol正向引物：

F Primer：5’-TGGGCACAATTTGACAACAG-3’(SEQ ID NO:2)

5nmol反向引物：

R Primer：5’-TATGGGGAAACTGGCCTAGA-3’(SEQ ID NO:3)

本发明还公开了包括上述引物组的检测试剂盒，所述检测试剂盒中除包含如上引物外，还包括：2×PCR MasterMix，ddH₂O，DNAMarker。

本发明的与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)鸡血液的采集

待测群体花山麻鸡是由江苏省家禽科学研究所联合江苏立华牧业股份有限公司培育的一个适合屠宰加工的黄羽肉鸡配套系，具有中等体型、青脚、黄皮、冠大、肉垂鲜红、早熟、肉质优等特点，在相同的日粮水平下饲喂同日龄鸡群至63日龄(上市日龄)。采用一次性注册器从鸡翅下静脉中抽取 1ml血液，注入经高压灭菌并装有300μlACD抗凝剂的2ml离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。

(2)基因组DNA的提取

参照血液基因组DNA提取试剂盒(天根，DP348)的说明书进行血液 DNA样品的提取。用紫外分光光度计测定提取的DNA浓度，将DNA浓度稀释到100ng/μL，存放于-20℃保存备用。

(3)PCR扩增

扩增包含A534G位点的片段：根据GenBank鸡CSRP3基因 (NC_006092.5)全序列设计包含该位点的上下游向引物组，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以步骤(2)提取的鸡基因组DNA为模板，在包含待测位点序列的上下游引物组、2×PCR Master Mix，ddH₂O存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，PCR产物大小为922bp，PCR扩增产物用于测序。

所述的引物组序列如下：

正向引物序列为：5’-TGGGCACAATTTGACAACAG-3’(SEQ ID NO:2)；

反向引物序列为：5’-TATGGGGAAACTGGCCTAGA-3’(SEQ ID NO:3)。

PCR扩增体系为：100ng/μL DNA模板1μl、2×PCR Master Mix 10μl、10μM上下游引物各0.4μl，加ddH₂O至总体积20μl。

PCR扩增反应程序为：预变性94℃3min；35个循环：94℃30s，58 ℃30s，72℃1min；72℃5min；4℃保温。

(4)基因型判定

将PCR产物送测序公司测序，根据测序的结果判定该位点在检测群体中的基因型。结果如图1所示，如果该样本是纯合子，就只有一个产物峰： A峰或G峰。如果是杂合子，那么就会出现2个峰：G峰和A峰。

(5)CSRP3基因的SNP分子标记与63日龄花山麻鸡体重及腿肌重的关联分析。

表1

注：()内数字表示个体数；同行数据，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

对CSRP3基因的SNP分子标记的不同基因型与63日龄花山麻鸡体重及腿肌重进行了关联分析的检测应用，关联分析结果如表1所示，CSRP3基因的SNP分子标记位点与63日龄花山麻鸡体重呈极显著相关(P<0.01)，与腿肌重呈显著相关(P<0.05)；其中基因型AA的体重、腿肌重均高于基因型AG和GG，且与基因型GG差异显著(P<0.05)；比较基因型AG和GG，基因型AG的体重、腿肌重均高于GG，且体重差异显著(P<0.05)。这说明AA基因型对63日龄花山麻鸡的体重、腿肌重是有利基因型，等位基因A 是有利等位基因。因此，选取鸡CSRP3基因编码区的SNP分子标记第633 位中的AA基因型作为提高鸡体重、腿肌重速度的辅助选择和分子遗传育种标记。

(6)CSRP3基因的SNP分子标记与63日龄花山麻鸡腿肌肌纤维特性的关联分析。

表2

注：()内数字表示个体数；同行数据，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

对CSRP3基因的SNP分子标记的不同基因型与63日龄花山麻鸡腿肌肌纤维特性进行了关联分析的检测应用，关联分析结果如表2所示，CSRP3 基因的SNP分子标记位点与63日龄花山麻鸡腿肌肌纤维平均面积极显著相关(P<0.01)，与腿肌肌纤维平均直径、肌纤维平均密度显著相关(P<0.05)；其中基因型AA的肌纤维平均面积极显著高于基因型AG和GG(P<0.01)，肌纤维平均直径显著高于基因型AG和GG(P<0.05)，肌纤维平均密度显著低于基因型AG和GG(P<0.05)；比较基因型AG和GG，基因型AG的肌纤维平均面积、平均直径均高于GG，肌纤维平均密度低于GG，但差异均不显著。这表明该位点与63日龄花山麻鸡肌纤维性状存在显著的相关性。因此，选取鸡CSRP3基因编码区的SNP分子标记第633位中的AA基因型作为鸡腿肌肌纤维性状的辅助选择和分子遗传育种标记。

检测所述SNP分子标记的引物组或检测试剂盒在早期选择鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状或鸡遗传育种中的应用，选择所述SNP分子标记的基因型为AA的个体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记及其检测方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 922

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<400> 1

tgggcacaat ttgacaacag caagagatca aacagacgta tttggagaaa aatgttgacc 60

actactaata tagaggagtt gtgacaaata aggatgagcg tacttggcaa cgaagggtca 120

cactggattg cccaaacaac caccaaaagt tggctggacc acactcttgt tcttccaacc 180

tcctttaaaa atctctgata ttcagtctgc atgggcagaa aagcatcttt aaaggaagcg 240

ttactaagat tttaaatata tacttttcca atttcttttt gagaaactca gatgcaacac 300

ttgtttaatt caaatatttt ccattactag aatctgtcga cacttctgag aaagaccatc 360

ccagatttcc ttctttgtat taacttacct ttggaattag taccaaaccc aagaaccact 420

taggcaaacg ttcagaacac tctttaccct tttctttctt ttgcagtttg ctacgcaaag 480

aattttggtc ccaaaggaat tggttttggc ggcctcactc aagtggaaaa gaaagaataa 540

gattgaaaag aagtggatgc aacagagtca atctgctgcg gatgtcagca gataacagtt 600

gtcaagtaaa gcaaaaacat cacctacagc ttataaccca gggcatttgt taaatatttt 660

ccatcttgca ggaaaaaggt tgtaccttca gaaattctta gaacagctta aagaaggtac 720

agcgatcaag ccaggttcat gtttactata caagtgaatg gagacaagaa cttctgttca 780

tggaacattg ttgcttctta tactaatatt tagcacagtt caggctctag atttaaagag 840

tcagcatact gtcccattca gacagagata ccctacaaaa cacaagggtc agagtcttct 900

gatctaggcc agtttcccca ta 922

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

tgggcacaat ttgacaacag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

tatggggaaa ctggcctaga 20

Claims (5)

1.一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测引物的应用，其特征在于，

所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且SEQ ID NO:1的第534位为A或G；

所述与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测引物包括SEQ IDNO:2所示的正向引物，和SEQ ID NO:3所示的反向引物；

所述与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测引物具有在早期选择花山麻鸡的鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状中的应用。

2.一种用于鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状检测的试剂盒在早期选择花山麻鸡的鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测引物。

3.权利要求1所述的检测引物或权利要求2所述的试剂盒在花山麻鸡的鸡遗传育种中的应用。

4.权利要求1所述的与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增待测鸡的基因组DNA，得到PCR扩增产物；

(2)将所得PCR扩增产物测序后，获得所述SNP分子标记第534位的基因型。

5.根据权利要求4所述的与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，PCR扩增所用的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

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