CN111926086B - 一种影响鸡体斜长的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种影响鸡体斜长的分子标记及其应用，属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域。本发明所述的分子标记是通过对大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡组建的F2代资源群体741只试验鸡进行全基因组关联(GWAS)分析得到，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本5号染色体上的第16402009bp处有一个T>C的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.5 16402009T>C)，定位在其附近的基因为赖氨酸甲基转移酶5B（lysine methyltransferase 5B，KMT5B）基因，突变显著影响了鸡的体斜长。本发明公开了该分子标记的获得及应用。本发明还提供了一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型检测方法，利用该方法可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡生长发育遗传改良中，从而提高鸡的生长发育。

Description

一种影响鸡体斜长的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域，特别涉及一种影响鸡体斜长的分子标记及其应用。

背景技术

鸡肉是世界第一大肉类产品，占所有肉类的39％。鸡肉是中国第二大肉类产品，占肉类总产量的15.2％。随着全球人口持续增长，可耕地面积逐渐减少，鸡肉和鸡蛋是除牛奶外单位货币可购买的动物蛋白克数最高的两类蛋白，在生产成本方面具有较大的竞争力，将成为全球肉类生产增长最快的产品。我国是世界第二大肉鸡生产和消费国，尤其是在非洲猪瘟导致猪肉紧缺的情况下，鸡肉可快速增补空缺，预计2020年猪肉产量将减少1500万吨，缺口较大，鸡肉是唯一可在短时间内快速增补的肉类。面对巨大的鸡肉需求量和不断增加的现状，虽然我国家鸡企业满足了部分优质鸡肉内需，但整体上市场缺口依旧极大，种源及产量严重不足，亟需开展培植家鸡种业、做强家鸡种业、培育新品种(配套系)等方面的工作。

随着高通量测序技术的快速发展，测序成本降低，使得GWAS用于畜禽相关经济性状研究成为可能，尤其是各种商用畜禽基因芯片的成功研发极大推动了GWAS的发展。在全基因组选择育种时代，GWAS是预测畜禽生产性能和评价畜禽遗传资源的有力工具，并推动畜禽育种进入全基因组选择(GS)时代。利用基因组信息和大数据及人工智能直接进行GS，可对家鸡目标性状进行高效、快速、定向及模块化选育，颠覆了大群体遗传评估、后裔验证的传统育种技术路线，加速新品种培育。因此，采用GS进行新品种培育，突破传统育种瓶颈，成为种业革命的新引擎。

地方鸡生产作为动物蛋白和收入的主要来源，在我国畜牧生产中发挥着重要作用。体尺性状是体型外貌的量化指标，是动物遗传选育中重要的表型性状，与一些重要的经济性状＝有着密切的联系，如家鸡体斜长与体重呈极显著的正相关，可反映家鸡的生长发育情况。因此，采用全基因组关联分析的方法找到与家鸡体斜长相关的SNP分子标记，对我国家鸡育种有着重要的意义。

发明内容

鉴于以上研究背景，本发明的首要目的在于提供一个与鸡体斜长相关的SNP分子标记及其应用。本发明基于云南地方鸡种与隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，运用全基因组关联分析的方法寻找与鸡体斜长相关的SNP分子标记，以此作为鸡体斜长相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述影响鸡体斜长的分子标记在鉴定鸡生长发育和遗传育种中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型检测方法。

本发明的第四个目的在于提供一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种影响鸡体斜长的SNP分子标记的获得方法，其在于下列步骤：

1)组建大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，获得741只试验鸡，均于90日龄时测定体斜长；

2)提取F2代群体鸡基因组DNA；

3)构建DNA文库，进行全基因组重测序；

4)对测序原始数据质控、过滤后，利用BWA、Samtools等软件进行SNP检测；

5)结合体斜长表型数据，采用GEMMA软件进行表型和基因型以及协变量的关联分析，确定与鸡体斜长相关联的SNP。利用ANNOVAR软件对目标区域内的基因进行功能注释；

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与鸡体斜长相关联的SNP分子标记，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本5号染色体上的第16402009bp处有一个T>C的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.5 16402009T>C)，定位在其附近的基因为赖氨酸甲基转移酶5B(lysine methyltransferase 5B，KMT5B)基因，突变显著影响了鸡的体斜长。

所述的影响鸡体斜长的分子标记在鉴定鸡生长发育和遗传育种中应用。

一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型检测方法：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；若Chr.5 16402009T>C为T碱基，则为TC基因型；若Chr.5 16402009T>C为C碱基，则为CC基因型。

采用的特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GAAGGTCCTCAGGGTACGTC-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCCTCACGCAACAGATGAA-3’。

一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型在鉴定鸡生长发育中的应用，所述的基因分型是利用上述影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型检测方法获得的。

一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用，所述的基因分型是利用影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型检测方法获得的，淘汰CC基因型，保留TC基因型，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而提高后代鸡的生长速度。

所述的种鸡优选为大围山微型鸡。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明研究并确定影响体斜长相关的分子标记，验证其对体斜长的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡生长速度的遗传改良中，从而提高选择强度，降低育种周期，进而提高育种效率，降低育种成本。

附图说明

图1为在鸡5号染色体上关于体斜长的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2为有关鸡体斜长主效突变位点Chr.5 16402009T>C不同基因型的测序结果峰图；

其中(a)表示基因型为TC型的测序结果峰图，(b)表示基因型为CC型的测序结果峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实验例1实验鸡群饲养与体斜长测定

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群体是由大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡杂交而来的F2代资源群体。

F0代是从大围山微型鸡(来源于云南农业大学实习鸡场)和隐性白洛克肉鸡(来源于昆明云岭广大种禽饲料有限公司)分别选取种鸡，所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正。大围山微型鸡一个未经选育的小型鸡种，其个体小(平均体重0.7-1.2kg)、耗料少、基础代谢低等优点，是培育优质、节粮型家鸡新品种(系)的优良素材。隐性白洛克肉鸡属于快大白羽肉鸡，是从白洛克中选育而成，其羽毛的白色为隐性性状。

大围山微型鸡-隐性白洛克肉鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建正交系和反交系各4个，正交系：大围山微型鸡♂×隐性白洛克肉鸡♀；反交系：隐性白洛克肉鸡♂×大围山微型鸡♀。正交系和反交系均按照公母鸡1：3比例配组而成。F0代采用人工授精共产生F1后代数为正交80只，反交146只。正交系挑选公母鸡各20只(1:1配对)进行F1代的横交，反交系挑选公母鸡各30只(1:1配对)进行F1代的横交，得到F2代资源群741只鸡，其中正交259只，反交482只。

(2)饲养实验

试验鸡于云南农业大学实习鸡场进行饲养，饲养至12周龄。日粮饲喂分为两个阶段：0-4周龄为雏鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.00MJ/Kg，粗蛋白为19.80％；5-12周龄为生长鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.10MJ/Kg，粗蛋白为18.00％。

(3)体斜长测定

试验鸡于12周龄早晨测定体斜长，测定前12小时停止提供日粮和饮水。

实验例2影响鸡体斜长的分子标记的获得

(1)血液样品采集

采用含有EDTA-二钾的真空采血管进行试验鸡翅静脉采血。

(2)基因组DNA的提取及鉴定

采用Gentra Puregene Blood Kit(Qiagen)柱式离心法试剂盒提取血液基因组DNA，待DNA完全溶解后用NannoDrop核酸分析仪检测其浓度，并在1％琼脂糖凝胶电泳条件下检测DNA条带的完整性。

(3)DNA文库构建与测序

文库的构建利用NEBNext DNA library kit(NewEnglandBiolabs)完成，具体操作步骤为：首先将基因组DNA随机打断成小片段，然后在长度为500bp左右的片段上连接上Illumina双末端接头，经过PCR扩增和纯化后得到DNA文库，使用Illumina Hiseq 2500高通量测序仪对试验样本进行测序。

(4)基因组内变异检测

1)数据质控

对测序得到的原始reads，首先利用FastQC软件对数据的质量进行质量分析。根据数据的质量，接下来利用NGSQC Toolkit对原始reads进行质控，主要剔除在建库和测序中残留的引物和接头和质量较低的reads。

2)测序reads比对和变异检测

采用Ensembl数据库中原鸡基因组Gallus_gallus.GRCg6a，利用BWA软件对参考基因组构建索引。将质控之后的高质量reads利用BWA-MEM比对到鸡的参考基因组上，利用Picard软件将比对后的SAM文件转换成二进制的BAM文件，再利用Samtools软件按照参考基因组的物理位置信息对比对好的BAM文件进行排序，并进行SNP分析，得到SNP数据集。

3)全基因组关联分析

GEMMA(http://www.xzlab.org/software.html)是一款专门用于GWAS分析的软件，利用该软件采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)同时对群体结构和个体亲缘关系进行校正，性别作为固定效应，同时减少计算时间。使用GEMMA对群体的体斜长进行关联分析，筛选出潜在的符合哈迪-温伯格平衡检验P＜1×10^-6(卡方检验)和最小等位基因频率(MAF)≥0.05的SNP。

4)基因组变异的功能注释

基于Ensembl数据库中的鸡基因组注释信息，利用ANNOVAR软件对所检测到的所有SNP变异进行注释。

(5)不同基因型与体斜长的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点Chr.5 16402009T>C与体斜长极显著相关(P<0.001)，在其附近区域的基因是赖氨酸甲基转移酶5B(lysine methyltransferase5B，KMT5B)基因，说明此分子标记显著影响鸡的生长发育，可以通过对此SNP位点的辅助选择，促进鸡的生长发育，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，TC型比CC型的平均体斜长高，说明纯合子CC对平均体斜长是最不利的。通过表2进一步得知，杂合子TC与纯合子CC基因型体斜长显著差异，这进一步说明杂合子TC对体斜长最有利，可促进鸡的生长发育。因此，CC基因型的鸡的生长性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种鸡，保留TC型的种鸡，以逐代提高该杂合基因型的频率。

表1分子标记的SNP位点Chr.5 16402009T>C与体斜长的相关性

表2分子标记的SNP位点Chr.5 16402009T>C不同基因型组间差异性

实验例3一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型检测方法

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群群体为云南农业大学的150日龄大围山微型鸡种鸡300只(公母各150只)，为种鸡核心群。测定体斜长。

(2)目的DNA序列扩增及测序

1)引物设计

通过NCBI网站下载鸡的5号染色体的DNA序列，并利用引物设计软件primerpremier 6.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-GAAGGTCCTCAGGGTACGTC-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCCTCACGCAACAGATGAA-3’。

2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1.0μL，双蒸水10.5uL，2×TSINGKE^TM Master Mix12.5μL，引物primer-F和primer-R各0.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50-68℃退火30s，72℃延伸30s，经35个循环，72℃延伸7min，4℃保温。

3)DNA序列测定

最后对PCR扩增后的产物进行测序，基因片段测序要求为双向测通。

测序结果如SEQ ID NO:1所示。

注：序列表中N为突变位点。

(3)分子标记的SNP位点g.284T>C基因型分析

根据表3可知，大围山微型鸡种鸡中分子标记的SNP位点g.284T>C基因型TC型比CC的平均体斜长高(TT基因型个体数占比太少，故不作对比)，说明杂合子TC对平均体斜长是最有利的。这进一步说明杂合子TC可促进鸡的生长发育。

表3分子标记的SNP位点g.284T>C不同基因型体斜长差异

实验例4分子标记的SNP位点g.284T>C效应分析

本发明提供一个能显著提高鸡生长发育SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快鸡生长发育育种进程。若本发明将影响鸡生长发育的分子标记的CC型个体全部选育成TC型个体，则大围山微型鸡种鸡群体平均体斜长可以提高11.82mm，可显著提高种鸡的生长速度。

本SNP分子标记个体中，通过优选云南地方鸡该SNP的优势等位基因(T)，可最终实现提高商品鸡的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种影响鸡体斜长的分子标记及其应用

<130> 2020-7-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<220>

<221> misc_feature

<222> (284)..(284)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gaaggtcctc agggtacgtc cctctatttt cttcctctcg ttttaactgt atttttagtt 60

ttgttgaact attgcctgat cctgagttaa acccattatt tagctttgct acatataaat 120

tattatcctt ttcatggtct ttacttaatt tgatgcttat ttttgaagaa ttcattccat 180

cagattcttg gtcattcgcc ttgctactgc tatcatgacg cctacgaaga gtcagtttag 240

ggatcccaga gctattttca aggattagtt gtgcatcata cctngtgatt cgtcttttct 300

ttttagtttt tgcagttctg aagctgtcct ttgttttgaa actgtcagag gttacaacag 360

aacagctacc agatccagag atacagtctt gatagctaac aggtatatct accacattat 420

tcctctctcc attttctgag tgagaactga tcaagtctgg tacttcatct tttacaggtg 480

tgttgtgcgt attatctgtt tcatctaatt ttgcaggtgg tttcactagc tttccttgtc 540

gagacttctt ttttgacgtg cctgcgtcat ttttttgaca cctggcctcc cctttatgtg 600

acgttccatg agccaggttg ttttcatctg ttgcgtgagg ct 642

Claims (2)

1.一种影响鸡体斜长的SNP分子标记在鉴定大围山微型鸡体斜长或大围山微型鸡体斜长调控相关的遗传育种中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus .GRCg6a版本5号染色体上的第16402009bp处有一个T>C 的核苷酸单碱基突变，命名为：Chr .5 16402009T>C，定位在其附近的基因为KMT5B/赖氨酸甲基转移酶5B基因，突变显著影响了鸡的体斜长。

2.一种影响鸡体斜长的SNP分子标记基因分型在鉴定大围山微型鸡体斜长或大围山微型鸡体斜长调控相关的遗传育种中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus .GRCg6a版本5号染色体上的第16402009bp处有一个T>C 的核苷酸单碱基突变，命名为：Chr .5 16402009T>C；所述的基因分型通过如下方法获得：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：上游引物primer-F：5’-GAAGGTCCTCAGGGTACGTC-3’；下游引物primer-R：5’-AGCCTCACGCAACAGATGAA-3’；若Chr .5 16402009T>C为T碱基，则为TC基因型；若Chr .5 16402009T>C为C碱基，则为CC基因型；TC基因型的体斜长优于CC基因型；育种时，淘汰CC基因型，保留TC基因型。

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