CN103290123B

CN103290123B - 一种黄牛igf2基因单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN103290123B
Application number: CN201310204434.9A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 黄永震; 李明勋; 孙雨佳; 蓝贤勇; 雷初朝; 胡沈荣
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103290123A

Abstract

本发明公开了一种黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒，以包含IGF2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛IGF2基因；通过DNA测序和限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术（PCR-RFLP）进行基因多态性的检测与快速分型，该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记。本发明提供的检测方法可用于黄牛生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。本发明检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对黄牛IGF2基因突变位点的大规模的筛查和诊断。

Description

一种黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒。

背景技术

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

根据基因组中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性（Coding-region SNPs,cSNPs）、基因周边单核苷酸多态性（Perigenic SNPs,pSNPs）以及基因间单核苷酸多态性（Intergenic SNPs,iSNPs）。研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP（Synonymous cSNP），即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP（Non-Synonymous cSNP），即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。

标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点（QTL），使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质（酶）标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择（molecularmark-assist selection,MAS），该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变；另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。我们首先采用DNA直接测序技术进行目的基因是否存在突变进行检测，然后使用PCR-RFLP技术进行突变分型，可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段和突变频率。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

IGFs系统由一组配体、受体和结合蛋白组成。配体包括胰岛素、IGF-1和2，IGF-1和2可促进细胞的有丝分裂和分化，抑制细胞凋亡，刺激DNA合成和细胞复制，诱导G0期静止状态的细胞进入G1期，推动细胞依次经历细胞周期的各个时期。相应受体为胰岛素受体、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)和胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R)，其中，IGF-1R可分别与IGF-1和IGF-2结合，但与IGF1的亲和力大于IGF-2，而IGF-2R则与IGF-2的亲和力高于IGF-1。Laere等研究发现，IGF2基因内含子3的3072位点的一单碱基突变(G→A)正好位于高度保守的调控区域，影响猪骨胳中IGF2的表达，并且对出生后的肌肉形成起重要作用；这一突变的单核苷酸与瘦肉率存在相关性，可增加3％～4％的瘦肉量。这一变异位点的发现引起众多学者的重视。鼠的纤维原细胞体外实验结果表明，在IGFs信号通路中，1GF2的高表达可以刺激下游蛋白激酶B(Akt)丝氨酸(Ser)和IGF-1R跨膜苏氨酸(Tyr)的磷酸化，从而促进成肌因子(MyoD)家族的基因表达，使单核成肌细胞融合成多核肌管，最终形成肌肉；而当IGF2水平较低或抑制时，则阻碍肌肉生成。综上所述，在哺乳动物中，IGF2主要影响肌肉生长(IGF2基因内含子中的QTN位点可以提高猪肉产量提高了3～4%)、心脏增大和脂肪沉积。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种检测黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的方法，以包含IGF2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛IGF2基因，用限制性内切酶Sma I消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛IGF2基因内含子8第17位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TACTTCAGTGAGTAGCTCCCCGG-3’；

下游引物：5’-AACCCGTTTGATTCCATCTC-3’。

所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s，55.5℃退火30s，72℃延伸7s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为4%的琼脂糖凝胶电泳。

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛IGF2基因内含子8第17位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为383bp和21bp条带；GA基因型表现为404bp、383bp和21条带；AA基因型表现为404bp。

黄牛IGF2基因内含子8第17位的单核苷酸多态性在鉴定不同黄牛群体多态性中的应用。

黄牛IGF2基因内含子8第17位的单核苷酸多态性作为分子标记在黄牛肉质性能和生长性状的辅助选择中的应用。

在辅助选择时，将基因型为GG和GA型的个体淘汰；基因型为AA型的个体留种进行扩繁。

一种检测黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的试剂盒，所述试剂盒的内容包括：

（1）特异引物，所述的特异引物包括:

上游引物：5’-TACTTCAGTGAGTAGCTCCCCGG-3’；

下游引物：5’-AACCCGTTTGATTCCATCTC-3’；

（2）生化试剂，所述生化试剂包括：Taq DNA聚合酶，扩增模板，灭菌超纯水，限制性内切酶Sma I，包含Mg²⁺、dNTPs的2×Buffer，以及包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp的DNA Marker I。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据已公布牛IGF2基因（GenBank Accession No.EU518675.1,AC_000186.1）的序列设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛IGF2基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在IGF2基因内含子8第17位存在SNP多态性。

本发明提供的黄牛IGF2基因单核苷酸多态性检测方法，针对内含子8第17位由G突变为A的突变，通过在新设计的上游引物的5’端引入碱基错配，构造出当限制性内切酶Sma I所识别的切割位点。由G变为A时，PCR扩增IGF2基因后在错配位置附近无法形成限制性内切酶Sma I识别位点，而突变没有发生时，PCR扩增IGF2基因后可形成Sma I识别位点；通过电泳检测分型可以准确、快速、方便的检测IGF2基因单核苷酸多态性：GG基因型表现为383bp和21bp条带；GA基因型表现为404bp、383bp和21条带；AA基因型表现为404bp；进而对3个黄牛群体的IGF2基因SNP的等位基因和基因型频率的变化监控。

IGF2基因SNP与黄牛部分生长性状的关联分析表明，IGF2基因不同基因型对秦川牛群体的体高、体斜长、胸宽和体重有显著影响（P<0.05）。IGF2基因该位点能够作为提高黄牛体重和日增重的分子标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

通过秦川牛IGF2基因遗传变异对生长性状影响的研究，能够为秦川牛肉质性能、生长性能的标记辅助选择和新的优良品种的育种提供重要的研究资料，最终为转基因动物的研究及秦川牛生长发育和牛肉品质的改善提供理论依据。

附图说明

图1是本发明的技术流程示意图。

图2-1、图2-2分别为SNP的基因型GG、GA的测序图。

图3是本发明用来检测各样本多态情况的酶切之后的电泳结果（自左至右泳道分别代表DNA Marker I和基因型AA、AA、GA、GA、GG和GG的电泳带型）。

具体实施方式

本发明首先根据NCBI公布的IGF2基因序列（GenBank Accession No.EU518675.1,AC_000186.1）设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-RFLP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。下面结合图1对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

I地方黄牛品种IGF2基因部分DNA序列的克隆

1、黄牛样本采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛（265头），陕西秦川牛（723头），河南郏县红牛（440头）；

表1黄牛样本的采集

2、基因组DNA的提取

参考文献Sambrock et al（2002）方法。

3、扩增引物设计

以NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的牛IGF2基因序列（GenBank Accession No.EU518675.1,AC_000186.1）为参考序列，利用Primer5.0设计PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物：5’-TACTTCAGTGAGTAGCTCCCCGG-3’；

下游引物：5’-AACCCGTTTGATTCCATCTC-3’；

该引物扩增了黄牛IGF2基因第8内含子区域。

4、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

灭菌超纯水（H₂O）	10.8μL
		2×Buffer(内含Mg²⁺、dNTPs等)	12.5μL
引物P上游引物（10pmol/L）	0.5μL
		引物P下游引物（10pmol/L）	0.5μL
Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）	0.25μL

待检测牛的DNA（50ng/μL）	0.45μL
		总体积	25μL

PCR反应程序：

95℃预变性4min；

72℃延伸10 min；

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以上3个品种PCR扩增产物混合送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现既有如图2-1所示的GG单峰，又有如图2-2中的GA双峰，筛查到了黄牛IGF2基因的1个SNP多态性，位于黄牛IGF2基因内含子8第17位。

II、黄牛IGF2基因多态性的PCR-RFLP检测

1、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前所述，PCR扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱可以清晰的看到404 bp的条带。

2、PCR-RFLP检测

当IGF2基因内含子8第17位未发生突变时，引物P进行PCR扩增IGF2基因产物形成了限制性内切酶Sma I(CCC^GGG)的酶切位点；当内含子8第17位点由G突变为A时，PCR扩增IGF2基因产物的序列限制性内切酶SmaI不能识别；从而对该位点SNP多态性进行检测。

当用限制性内切酶Sma I对引物P对应扩增的基因片段酶切消化时，由于扩增序列中只存在上述一处Sma I识别位点，因此，如果能够被只能够被Sma I所识别，则扩增的片段将会被切成2个片段。

由于黄牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过PCR-RFLP进行判别，如图3所示，将三种基因型区分开，根据条带的带型结合测序结果能够将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

III、本发明制备的分子标记在不同黄牛群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对265南阳牛、723份秦川牛、440份郏县红牛DNA样品分别进行琼脂糖凝胶电泳判定基因型。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_CC＝N_CC/N，其中P_CC代表某一位点的CC基因型频率；N_CC表示群体中具有CC基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_CC＋N_CC1＋N_CC2＋…＋N_CCi…＋N_CCn）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_CC表示群体中具有CC基因型的个体数量，N_CCi表示群体中具有CCi基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3三个黄牛品种IGF2基因多态位点基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用SPSS17.0（Statistical Product and Service Solutions,Version17.0Edition）统计软件，对其中主要性状记录比较全面的24月龄秦川牛的不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验。（见表4）。

1）测定的主要性状包括：体重，体高，体斜长，胸围，坐骨端宽，日增重。

2）测定的群体：秦川牛群体，样品和数据资料都来自陕西省秦川牛良种繁育场。

3）关联分析一般线性的模型：调用SPSS17.0软件一般线性模型TLM（General linear models procedure）对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据本实验的其体情况建立如下统计模型：

Y_ijk=μ+A_i+T_j+E_ijk,

其中：Y_ijk：个体表型记录；μ：总体均数；A_i：年龄效应;T_j：基因型效应；E_ijk：随即误差。

结果见表4：该表列出了IGF2基因座秦川牛（24月龄）基因AA个体的体高、体斜长、胸宽和体重显著大于基因型GG和GA（P<0.05），因此，秦川牛IGF2基因多态位点中AA为优势基因型。由此，在今后的育种工作中，应当选择黄牛IGF2基因AA基因型的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

表4秦川牛（24月龄）IGF2基因不同基因型之间最小二乘均值差异显著性检验

注：表中数值为平均值±标准误（Mean±S.E）；在同一行中标有a、b、c为差异显著水平P＜0.05；下面给出基于上述检测的试剂盒及其使用

试剂盒成分：

1.1特异引物，所述的特异引物包括:

上游引物：5’-TACTTCAGTGAGTAGCTCCCCGG-3’；

下游引物：5’-AACCCGTTTGATTCCATCTC-3’；

1.2生化试剂，所述生化试剂包括:

TaqDNA聚合酶；扩增模板；灭菌超纯水；限制性内切酶SmaI；

内含Mg²⁺、dNTPs的2×Buffer；

包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp的DNA Marker I；

试剂盒操作说明：

2.1PCR操作说明

（1）PCR扩增反应体系

PCR反应体系见表2。

（2）PCR扩增反应程序

95℃预变性4min；94℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

2.2电泳检测与基因型判断

对每个个体扩增片段经过限制性内切酶Sma I消化处理后，进行4%的琼脂糖电泳检测，其个体可以出现GG,或GA，或AA带型，见图3所示。

2.3待检个体的选择与淘汰

依据表4的分析结果（秦川牛IGF2基因座基因型AA个体的体高、体斜长、胸宽和体重显著大于基因型GG和GA个体），将GG和GA型个体淘汰；AA型个体留种进行扩繁，将形成一个优良群体。

2.4注意事项

（1）DNA的提取可以按照以上提供的步骤操作，也可以依据不同厂家的全血DNA提取试剂盒的要求来提取，但是要保证DNA的纯度，若提取效果不佳，需要纯化后再进行后续的试验。

（2）反应体系和反应程序可以依据不同的厂家产品的要求来操作，但要保证扩增的特异性和扩增产物的浓度，以免影响后续的试验结果。

Claims

1.一种黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，以包含IGF2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛IGF2基因，用限制性内切酶Sma I消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛IGF2基因内含子8第17位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TACTTCAGTGAGTAGCTCCCCGG-3’；

下游引物：5’-AACCCGTTTGATTCCATCTC-3’；

2.如权利要求1所述的黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s，55.5℃退火30s，72℃延伸7s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为4％的琼脂糖凝胶电泳。

4.一种检测黄牛IGF2基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)特异引物，所述的特异引物包括:

上游引物：5’-TACTTCAGTGAGTAGCTCCCCGG-3’；

下游引物：5’-AACCCGTTTGATTCCATCTC-3’；

(2)生化试剂，所述生化试剂包括：Taq DNA聚合酶，扩增模板，灭菌超纯水，限制性内切酶Sma I，包含Mg²⁺、dNTPs的2×Buffer，以及包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp的DNA Marker I。