CN102888451B

CN102888451B - 一种检测黄牛ppargc1a基因单核苷酸多态性的方法

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Publication number: CN102888451B
Application number: CN201210124717.8A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 李密杰; 刘梅; 刘栋; 蓝贤勇; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN102888451A

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法，以包含PPARGC1A基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PPARGC1A基因，再进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小；然后进行SSCP多态性的检测。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，故本发明提供的检测方法可用于中国黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，基因编码区内的SNPs(cSNPs)比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。

标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择(molecularmark-assistselection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90％可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子(peroxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator1alpha，PGC-1α)，编码基因为PPARGC1A，是转录共激活因子家族的一员，可以被冷刺激强烈诱导表达，刺激适应性产热以适应环境，在细胞能量代谢方面起重要作用。PGC-la参与多种代谢过程，包括线粒体的生物合成、葡萄糖的摄取、肝脏糖异生、脂肪酸β氧化、脂肪细胞分化、肌肉类型转换等。

在人类医学研究中，PPARGC1A主要用来研究一些与代谢相关的疾病，如能量代谢障碍疾病、肥胖症、糖尿病等。在动物遗传育种研究中，由于PGC-1α参与机体能量平衡和脂肪代谢调控的整个过程，PPARGC1A基因被作为影响动物生长、疾病发生和生物体内各种物质合成的侯选基因，研究动物的生长发育、肉类品质及产乳特性。然而未见在中国黄牛PPARGC1A基因遗传多态性及其对黄牛生长性状相关效应研究的报道。目前中国黄牛PPARGC1A基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与生长发育性状(如：初生重、体重、日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含PPARGC1A基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PPARGC1A基因；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小；用变性剂处理PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARGC1A基因第64897位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TCCTCTGTTTTACTGTCTTTG-3’

下游引物：5’-GTGCTTGGGGATTATTTTGG-3’。

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性4min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5％。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳质量浓度为10％。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARGC1A基因第64897位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为64897位为核苷酸G纯和；GA基因型表现为64897位为核苷酸G/A杂合；AA基因型表现为64897位为脱氧核苷酸A纯和；其中，单核苷酸多态性AA基因型为突变纯合基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下独特的技术效果：

本发明根据已公布牛PPARGC1A基因(GenBankAccessionNo.NC_007304)的序列设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛PPARGC1A基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在PPARGC1A基因的第64897位存在SNP多态性。

针对上述第64897位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，用变性剂处理扩增产物后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。

由于PPARGC1A基因功能涉及初生重、体重、日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状，本发明提供的检测方法为PPARGC1A基因的SNP与黄牛部分生长性状进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛体重和日增重的分子标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1是本发明的技术流程示意图。

图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛PPARGC1A基因序列64897位G-A突变测序结果图(箭头所指处为单核苷酸突变位置，自上至下分别为GG、GA和AA基因型的测序结果图)。

图3是本发明用来检测PCR产物片段大小的琼脂糖凝胶电泳(泳道1、2、3、4分别代表不同黄牛个体的PCR扩增产物)。

图4是本发明用来检测各样本突变情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳(自左至右泳道分别代表基因型GA、GG、GG和AA的电泳带型)。

具体实施方式

本发明首先根据NCBI公布的PPARGC1A基因序列(GenBankAccessionNo.NC_007304)设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

I地方黄牛品种PPARGC1A基因部分DNA序列的克隆

1、黄牛样本采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(278)，陕西秦川牛(325)，河南郏县红牛(148)；

表1黄牛样本的采集

2、基因组DNA的提取

参考文献Sambrocketal(2002)方法。

3、扩增引物设计

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛PPARGC1A基因序列(GenBankAccessionNo.NC_007304)为参考序列，利用Primer5.0设计PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物：5’-TCCTCTGTTTTACTGTCTTTG-3’

下游引物：5’-GTGCTTGGGGATTATTTTGG-3’。

该引物扩增了黄牛PPARGC1A基因第3外显子区域及一部分内含子区域。

4、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

灭菌超纯水(H2O)	10.8μL
		2×Buffer(内含Mg²⁺、dNTPs等)	12.5μL
引物P上游引物(10pmol/L)	0.5μL
		引物P下游引物(10pmol/L)	0.5μL
Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)	0.25μL
		DNA模板(50ng/μL)	0.45μL
总体积	25μL

PCR反应程序：

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以上3个品种PCR扩增产物混合送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现如图2中的GA双峰，筛查到了黄牛PPARGC1A基因的1个SNP多态性，位于黄牛PPARGC1A基因第64897位。

II、黄牛PPARGC1A基因多态性的PCR-SSCP检测

1、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前所述，PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱如图3所示，可以清晰的看到327bp的条带。

2、PCR-SSCP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性。

300V电压电泳5min，200V电压电泳2.5h，银染检测电泳结果，用Bio-RAD凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。

由于黄牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图来进行判别，如图4所示，将三种基因型区分开，根据条带的带型结合测序结果能够将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

III、本发明制备的分子标记在不同黄牛群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对278南阳牛、325份秦川牛、148份郏县红牛DNA样品分别进行丙烯酰胺凝胶电泳判定基因型。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+...+N_Aai...+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3三个黄牛品种PPARGC1A基因多态位点的基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用SPSS17.0(StatisticalProductandServiceSolutions，Version17.0Edition)统计软件，对其中主要性状记录比较全面的南阳牛的不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验。(见表4)。

1)测定的主要性状包括：体重，体高，体斜长，胸围，坐骨端宽，日增重。

2)测定的群体：南阳牛群体一共101头，样品和数据资料都来自河南省南阳市黄牛良种繁育场。

3)关联分析一般线性的模型：调用SPSS17.0软件一般线性模型GLM(generallinearmodelsprocedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据本实验的其体情况建立如下统计模型：

Y_ijk＝μ+A_i+G_j+E_ijk，

其中：Y_ijk：个体表型记录；μ：总体均数；A_i：年龄效应；G_j：基因型效应；E_ijk：随即误差。

结果见表4：从表4可以看出基因型GG的24月龄体重和日增重显著高于基因型GA(P＜0.05)。

在这几项指标中，GG基因型的值均高于GA型，因此，南阳牛PPARGC1A基因多态位点中GG为优势基因型。由此，在今后的育种工作中，应当选择黄牛PPARGC1A基因GG基因型的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

表4南阳牛PPARGC1A基因多态性与24月龄生长性状的关联分析

注：右上角字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

Claims

1.一种检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，

(1)以包含PPARGC1A基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PPARGC1A基因，

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TCCTCTGTTTTACTGTCTTTG-3’

下游引物：5’-GTGCTTGGGGATTATTTTGG-3’；

(2)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(1)中PCR扩增产物片段大小；

(3)用变性剂处理步骤(1)中PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARGC1A基因第64897位的单核苷酸多态性。

2.如权利要求1所述的检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(1)所述的PCR扩增反应程序为：

3.如权利要求1所述的检测黄牛PPARGC1A基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度1.5％的琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的检测黄牛PPARGC1A基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.如权利要求1所述的检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARGC1A基因第64897位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为64897位为核苷酸G纯合；GA基因型表现为64897位为核苷酸G/A杂合；AA基因型表现为64897位为核苷酸A纯合；其中，单核苷酸多态性AA基因型为突变纯合基因型。

6.权利要求1-5中任意一权利要求所述的检测黄牛PPARGC1A基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的诊断应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于用于中国黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择中的应用。