CN104498610B - 检测黄牛 mef2c 基因 snp 位点的 rflp 方法及试剂盒 - Google Patents

检测黄牛 mef2c 基因 snp 位点的 rflp 方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒，该方法是以黄牛基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶Hind Ш消化PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定黄牛NEF2C基因单核苷酸多态性。由于MEF2C基因在肌肉发育过程中起着重要的调节作用，与黄牛生长和肉质性状密切相关，而且该SNP与黄牛多种重要经济性状相关，所以，本发明提供的检测方法可用于黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，而且该方法操作简单、快速，成本低，检测精确度高，在建立遗传资源优良的黄牛种群方面非常有优势。

Description

检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及基于RFLP(限制性片段长度多态性)的MEF2C(肌细胞增强因子2C)基因单核苷酸多态性(SNP)的快速检测。
背景技术
所谓单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP是指在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)和颠换(嘌呤与嘧啶互换)所引起，其中前者引起的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。对于发生在基因编码区的SNPs可以分为同义突变和非同义突变，特别是后者引起的序列改变能使所编码的氨基酸产生变化，进而可能影响合成的蛋白质结构和功能，最终影响个体表型变化。然而，近年来，越来越多的研究表明，分布在非编码区的SNPs可能对基因表达起到重要调控作用，比如内含子一些碱基突变通过改变mRNA剪接位点或存在于内含子中的调节基序来影响转录或翻译。这些SNPs不仅对个体表现型具有重要意义，而且在群体遗传和生物进化研究中也可以作为重要的遗传标记。理论上，在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。
近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判，而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。
MEF2C是肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)转录因子家族一员，最突出的功能是控制肌细胞分化过程中的基因转录，其主要作用是在骨骼肌、心肌和平滑肌的发育过程中介导细胞的分化。在脊椎动物中，MEF2家族由MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D组成，它们在结构上具有同源性，即N端含有高度保守的MADS-box和MEF2结构域，前者提供最小的DNA-binding区域，后者主要功能是有助于提高富含A/T序列的DNA结合的亲和力，并介导MADS—box蛋白质的二聚化，同时也为MEF2与其他辅因子间相互作用提供场所。MEF2C基因位于牛7号染色体上，包括11个外显子和10个内含子，编码367个氨基酸的蛋白质。胚胎发生时期，MEF2C基因在骨骼肌家系和心脏的分化开始时表达，主要作用是维持分化状态，在MEF2家族中第一个表达，后面其它的MEF2基因相继表达。而在成熟组织中，MEF2C基因只在骨骼肌、脾和脑中表达。MEF2C可以激活多种肌肉特异性基因的表达，这些基因对于肌肉组织的分化、维持和再生等有重要作用，因此，MEF2C对于调节肌肉发生和发育具有非常重要的作用。对于黄牛育种来讲，分析MEF2C基因在肌肉发生和发育过程中的调节作用，对于提高黄牛的育肥效率和肉质品质具有重要的理论意义。
目前关于MEF2C基因的研究主要集中在小鼠和人心肌和骨骼肌的发生机制上，在畜禽中的相关研究报道还很少，特别在牛上报道更少，且没有相对深入和系统的探索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒，以加快良种选育速度。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法：包括以下步骤：
以黄牛全基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，以引物对P为引物，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境Buffer、Mg2+和dNTPs存在的情况下，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶Hind Ш酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛MEF2C基因单核苷酸多态性：
电泳后片段为224bp时为CC基因型；电泳后片段为224bp、199bp和25bp时为TC基因型；电泳后片段为199bp和25bp时为TT基因型；
所述的引物对P为：
上游引物F:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′(参见SEQ.ID.NO.1)
下游引物R：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′(参见SEQ.ID.NO.2)
所述的PCR扩增的反应体系为：25μL反应体系包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL(MBI,Fermentas)，10×Buffer 2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/LMgCl21.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，50ng/μL DNA模板1.0μL，10μmol/L的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL。
所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，33个循环；最后72℃延伸10min。
所述的酶切在10μL Hind Ш酶切体系中进行，Hind Ш酶切体系包括1.0μL的10×缓冲液，0.5μL的浓度为10U/μL的限制性内切酶Hind Ш，5μL的PCR扩增产物以及3.5μL的灭菌超纯水，酶切条件为：30℃恒温培养箱中消化5～8h。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
检测黄牛MEF2C基因SNP位点的试剂盒，包括10μmol/L的上、下游引物各0.25μL：
上游引物:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′(参见SEQ.ID.NO.1)
下游引物：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′(参见SEQ.ID.NO.2)
所述试剂盒还包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/L MgCl21.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL和灭菌超纯水15.0μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
MEF2C基因在肌肉发育过程中起着重要的调节作用，与黄牛生长和肉质性状密切相关，本发明提供的检测方法为MEF2C基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，可用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，而且该方法操作简单、快速，成本低，检测精确度高，在建立遗传资源优良的黄牛种群方面非常有优势。
附图说明
图1为黄牛血液样品基因组DNA电泳检测图。
图2为黄牛MEF2C基因内含子4第50位点(IVS4+50T>C)测序图，箭头所示为突变位点。
图3为黄牛MEF2C基因PCR产物电泳图。
图4为PCR扩增产物Hind Ш酶切3.0％琼脂糖凝胶电泳检测图。泳道1、3为TT基因型，表现为199bp和25bp；泳道2为CC基因型，表现为224bp；泳道4为TC基因型，表现为224bp、199bp和25bp；泳道5为Marker(M)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。
本发明根据MEF2C基因序列设计引物，分别以两种黄牛品种的血液基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序后与权威数据库公布序列进行比对，发现内含子4第50位(IVS4+50T>C)存在单核苷酸多态性。针对上述SNP位点，本发明通过引物设计人为的在上游引物3′端引入碱基错配进行检测。当该位点未发生突变时，PCR扩增MEF2C基因后在错配位置形成限制性内切酶Hind Ш识别位点；当该位点发生突变时，PCR扩增MEF2C基因后在错配位置不能形成限制性内切酶Hind Ш识别位点。通过电泳检测分型能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性。本发明对两个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。
本发明利用Forced-PCR-RFLP方法对黄牛MEF2C基因IVS4+50T>C的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明。
1.黄牛血液样本的采集及处理
通过静脉采血取黄牛血样50mL，加入1mL的抗凝剂，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。
本发明采集了两种黄牛品种，包括秦川牛和郏县红牛，具体为：
(1)秦川牛血样382份采自陕西省秦川牛良种繁育中心；
(2)郏县红牛血样193份采自河南省平顶山市郏县红牛育种中心及郏县和宝丰县各村镇。
2.血样基因组DNA的分离、提取、纯化
(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，温和摇动10-15min，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈无色；
(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，温和摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；
(3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，在恒温水浴箱中55℃过夜至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化，直至澄清；
(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
(5)加500μL的Tris饱和酚和500μL的氯仿，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
(6)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
(7)加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，轻轻转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30-60min；
(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
(9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；
(10)干燥后的DNA溶于80-100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量(参见图1)，-80℃保存。
3.设计黄牛MEF2C基因第4外显子及内含子4部分区域的PCR扩增引物
以权威数据库公布的牛MEF2C序列(Ensembl:ENSBTAG00000020701)为参考，利用Primer5.0设计引物扩增MEF2C基因第4外显子及内含子4部分区域595bp片段，引物对P′如下：
上游引物F′:5′-TTCCAAATGCGTTCGT-3′(参见SEQ.ID.NO.3)；
下游引物R′:5′-ACAAGATGCCTGATTCCTA-3′(参见SEQ.ID.NO.4)。
对扩增的片段进行测序鉴定后，发现在内含子4第50位发生T>C转换(IVS4+50T>C)，参见图2，如果在该突变位点前引入错配，由CC错配为AA，即人为的在上游引物3′端引入碱基错配，当该位点未发生突变时，以引物对P PCR扩增MEF2C基因后在错配位置形成限制性内切酶Hind Ш识别位点(A/AGCTT)；当该位点发生突变时，PCR扩增MEF2C基因后在错配位置不能形成限制性内切酶Hind Ш识别位点。通过电泳检测分型能够简单、快速、成本低、精确地检测该位点单核苷酸的多态性。
所述的引物对P为：
上游引物F：5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′；
下游引物R：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′。
4.以引物对P进行PCR扩增待测黄牛MEF2C基因片段
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表1。
PCR反应程序：
对两个黄牛品种575个样本的基因组DNA分别用引物P对(F、R)进行PCR扩增，获得575个包含MEF2C基因224bp片段的DNA序列(图3)。
表1PCR反应体系
5.用限制性内切酶Hind Ш酶切PCR扩增的MEF2C基因内含子4区域224bp基因片段
10μL Hind Ш酶切体系包括：1.0μL的10×缓冲液，0.5μL的浓度为10U/μL的HindШ限制性内切酶，5μL的PCR产物，3.5μL的灭菌超纯水；
酶切条件：30℃恒温培养箱中消化5～8h左右。
6.琼脂糖凝胶电泳分析
(1)制作3.0％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压电泳40min；
(2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
(3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性。
用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断并区分出不同的带型：MEF2C基因IVS4+50T>C碱基未发生突变时，引物对P扩增的MEF2C基因产物中在错配位置形成限制性内切酶Hind Ш识别位点(A/AGCTT)；当该位点发生突变时，引物对P扩增的MEF2C基因产物中在错配位置不能形成限制性内切酶Hind Ш识别位点。由于黄牛为2倍体，所以该位点的单核苷酸多态性经过Hind Ш酶切及3％琼脂糖凝胶电泳后，可显示出不同基因型的条带，结果为(图4)：CC基因型表现为224bp；TC基因型表现为224bp、199bp和25bp；TT基因型表现为199bp和25bp，其中25bp的条带不能检测出来。
7.黄牛MEF2C基因IVS4+50T>C SNP的频率统计分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+……+NAan)/2N，式中PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。
在两种黄牛品种MEF2C基因IVS4+50T>C SNP中，基因型频率及遗传学参数如表2所示。群体遗传分析表明，C等位基因和TC基因型在秦川牛群体中占明显优势，该位点基因型频率在秦川牛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态，秦川牛群体在此位点处于中度遗传多态(0.25<P<0.50)。
表2MEF2C基因IVS4+50T>C基因型频率及遗传学参数
χ20.05(df＝2)＝5.99。
χ2(HWE)*：Hardy-Weinberg平衡χ2值。
8.黄牛MEF2C基因IVS4+50T>C SNP基因效应的关联分析
基因型数据：Hind Ш识别的基因型(CC、TT和TC)。
生产数据：秦川牛24月龄牛的体高、十字部高、体长、胸围、尻长和体重等数据。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘法分析并对数据校正；根据数据特征，应用SPSS18软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用固定模型：
Yijk＝μ++Ai+Gj+eijk，
其中：Yijk为性状观察值，μ为总体均值，Ai为第i个月观测的固定效应，Gj为第j个单SNP标记基因型的固定效应，eijk为随机误差。
表3MEF2C基因IVS4+50T>C SNP与秦川牛生长性状关联分析
注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05或P>0.01)，字母不同表示差异显著(P<0.05或P>0.01)。
结果表明(见表3)：通过关联分析可以得出，在24月龄秦川牛群体中，TT基因型个体的体重、体长、胸围和体高显著高于CC基因型的。说明MEF2C基因IVS4+50T>C位的TT基因型可以作为一个改善黄牛生长性状的候选分子遗传标记。

Claims (7)

1.检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：
以黄牛全基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，以引物对P为引物，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶HindШ酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛MEF2C基因单核苷酸多态性：
电泳后片段为224bp时为CC基因型；电泳后片段为224bp、199bp和25bp时为TC基因型；电泳后片段为199bp和25bp时为TT基因型；
所述的引物对P为：
上游引物:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′
下游引物：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′。
2.根据权利要求1所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应体系包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL，10×Buffer 2.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，50ng/μL DNA模板1.0μL，10μmol/L的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL。
3.根据权利要求1所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，33个循环；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的酶切在10μL HindШ酶切体系中进行，HindШ酶切体系包括1.0μL的10×缓冲液，0.5μL的浓度为10U/μL的限制性内切酶HindШ，5μL的PCR扩增产物以及3.5μL的灭菌超纯水，酶切条件为：30℃恒温培养箱中消化5～8h。
5.根据权利要求1所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
6.检测黄牛MEF2C基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：包括10μmol/L的上、下游引物各0.25μL：
上游引物:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′
下游引物：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′。
7.根据权利要求6所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL，10×Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL和灭菌超纯水15.0μL。
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