CN103789406B

CN103789406B - 一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与应用

Info

Publication number: CN103789406B
Application number: CN201310465936.7A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 徐瑶; 石涛; 周扬; 蔡含芳; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-09-29
Filing date: 2013-09-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-09-29
Also published as: CN103789406A

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR‑RFLP方法。首先，根据DNA池测序结果，检测到的基因多态性包括：在黄牛的Pax3基因序列转录起始位点‑580位T或G的单核苷酸多态性；在Taq DNA聚合酶、Buffer（缓冲环境）、Mg^＋＋、dNTPs存在的情况下，PCR扩增黄牛Pax3基因，分别用HinfI和HaeIII限制性内切酶消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳分型。本发明提供的检测方法为Pax3基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，从而快速高效、精确地培育中国优质、特色的肉牛新品系。

Description

一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及中国地方黄牛单核苷酸多态性（SNP）分子标记的筛查和检测，特别涉及一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术

我国肉牛业生产实力与世界畜牧业发达国家相比还存在相当大的差距。培育中国专门化肉牛品种，建立现代中国肉牛种牛业，是发展我国肉牛业的战略任务。这就需要通过分子育种技术提高肉牛的培育速度和肉牛品质，并通过现代生物技术加快扩繁，从而快速、高效的选育我国特有的优质牛品种。

分子标记是遗传标记的重要组成部分，现已成为家畜分子育种的核心技术。遗传标记大致可分为两类：Ⅰ类是间接反映DNA水平遗传变异的遗传标记，如形态标记、细胞标记和生化标记；Ⅱ类是直接反映DNA水平遗传变异的分子标记。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于点突变、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。如今分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而提高肉牛的生长速度和改善肉品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后，分析突变序列引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

Pax3基因属于Pax基因家族的成员，该基因定位于人染色体2号染色体（2q36.1），鼠1号染色体，全长99110bp，含有8个外显子，mRNA全长3112bp，CDS在mRNA的382bp-1593bp区域。Pax3属于Pax基因家族的第一类，分布于细胞核，是一类重要的转录调控因子，在胚胎发育过程中对组织和器官的分化起着重要的调控作用，是强有力的生肌性诱导物，能使多能干细胞转变为生肌性细胞，在骨骼的发育和再生过程中起着至关重要的作用。尤其对脊椎动物四肢的形成起重要作用。除此之外，Pax3基因突变也与某些疾病有关，Pax3基因表达发生在神经管细胞开始分化之前，在整个神经管轴的侧翼板、神经嵴细胞及顶板均有表达，Pax3突变或表达失调会引起某些神经系统相关的出生缺陷和遗传综合征。例如人的神经管畸形（NTDs）（Lu W,Zhu H,Wen S,et al.Screening for novel Pax3polymorphisms andrisks of spina bifida[J].Birth Defects Research Part A:Clinicaland MolecularTeratology,2007,79(1):45-49）、Waardenburg综合症1型、2型和3型(Tassabehji M,ReadA P,Newton V E,et al.Mutations in the Pax3gene causing Waardenburg syndrometype1and type2[J].NatGenet,1993,3(1):26-30；Hoth C F,Milunsky A,Lipsky N,etal.Mutations in the paired domainof the human Pax3gene cause Klein-Waardenburg syndrome(WS-III)as well as Waardenburg syndrome type I(WS-I)[J].Am J HumGenet,1993,52(3):455-462)。

目前，国内外对黄牛的Pax3基因研究甚少，主要集中在人和小鼠等方面，而且大都集中于基因功能方面，关于家畜Pax3基因遗传变异或者SNP研究的研究国内外尚未见报道。因此，对中国地方黄牛Pax3基因遗传变异领域的研究至关重要，并且将该基因位点的遗传变异与黄牛生长性状（如：体重、体高、体长、日增重等性状）关联分析，可以为我国黄牛分子育种提供理论依据。

发明内容

本发明解决的问题在于利用DNA池测序的方法筛查中国地方黄牛Pa3基因的目的DNA序列的多态性，寻找与黄牛生长性状相关的SNP作为分子标记，提供一种黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性及其检测方法，以此作为黄牛分子育种和标记辅助选择的分子遗传标记，加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，以包含Pax3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P₁和P₂为引物，PCR扩增黄牛Pax3基因，然后分别用限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Pax3基因编码区多态性。所述的引物对P₁为：

上游引物P₁-F：5’-CCCTTCTTTCCCCAGGTTAGAGAC-3’24nt

下游引物P₁-R：5’-GGGCTCGGGAGCATTTATT-3’19nt

用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第-580位的碱基多态性；

所述的引物对P₂为：

上游引物P₂-F：5’-GCGAAGAGGAGGAGACCGA-3’19nt

下游引物P₂-R：5’-AGATTCCGAGGGACTGTGAG-3’20nt

用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第4617位的碱基多态性。

所述的PCR-RFLP方法，所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括0.625U TaqDNA聚合酶，2×Buffer12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>，0.45μL黄牛基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL。

所述P₁引物所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述P₂引物所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸40s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的用于电泳检测的琼脂糖凝胶浓度为3.0%。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第-580位的碱基多态性为：GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为210、188和22bp条带；TT基因型表现为188和22bp条带。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第4617位的碱基多态性为：AA基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为222、127、91和36bp条带；CC基因型表现为222、91和36bp条带。

与现有技术相比，本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP结合起来解决了SSCP的繁琐和不稳定性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，可用于黄牛的分子育种。

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛Pax3基因第4617位的一处同义密码子突变可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当碱基由A突变为C时，原有的编码Ala的密码子GCA发生突变为GCC，导致在转录的mRNA在翻译过程由于携带该氨基酸的tRNA丰度不同而影响翻译的效率，从而影响该蛋白的表达量。

本发明对上述SNP进行了群体遗传学分析，统计了5个中国地方黄牛品种中该位点的基因型和等位基因频率，结果表明该位点在不同品种间的分布存在差异。

Pax3基因对早期肌肉发育具有重要的作用，将黄牛Pax3基因的这两个SNPs位点与黄牛不同月龄的体重体尺性状进行方差分析表明，黄牛6、12月龄的体尺性状受到显著影响，因此，Pax3基因第-580位和4617位的多态位点均可以作为早期标记辅助选育（MAS）的分子标记。

附图说明

图1为本发明中PCR克隆筛选到的黄牛Pax3基因的-580位T>G突变的SNP多态性测序结果图；

图2为本发明中PCR克隆筛选到的黄牛Pax3基因的4617位A>C突变的SNP多态性测序结果图；

图3为黄牛Pax3基因包含第-580位突变位点的HinfI酶切电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.0%，图中出现的三种条带型为：GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为210、188和22bp条带；TT基因型表现为188和22bp条带。其中，22bp片段太小在图中无法显示；

图4为黄牛Pax3基因包含第4617位突变位点的HaeIII酶切电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.0%，图中出现的三种条带型为：AA基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为222,217，91和36bp条带；CC基因型表现为222、91和36bp条带。其中，36bp片段太小在图中无法显示。

具体实施方式

本发明根据Pax3基因组序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到黄牛Pax3基因的部分序列。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛Pax3基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、样本采集及基因组DNA提取

（1）血液样本的采集

本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群的1241头黄牛作为检测对象，具体采集样本见表1：南阳牛（220），郏县红牛（398），秦川牛（224），鲁西牛（166）和草原红牛（233）。

表1样品来源

（2）血样基因组DNA的提取

1）将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0。4℃保存备用。

3）加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

6）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

7）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

9）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

2、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度（μg/mL）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从南阳牛品种30个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建郏县红牛、秦川牛、鲁西牛和草原红牛品种DNA池。

3、扩增引物设计

从NCBI数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得海福特牛的GenBank登录号为AC_000159的Pax3基因DNA序列，利用Primer5.0设计扩增黄牛Pax3基因的两对引物，其引物对序列如下：

所述扩增引物对1：

上游引物1-F：5’-GGCTCCAATGCCTTCTTC-3’18nt

下游引物1-R：5’-AAAGGACGCTTCGTTTACCC-3’20nt

所述扩增引物对2：

上游引物2-F：5’-CAAGTTGAGTGGGAGGGTGAG-3’21nt

下游引物2-R：5’-AGATTCCGAGGGACTGTGAG-3’20nt

4、PCR克隆黄牛Pax3基因

分别以5个黄牛品种的DNA池为模版，用上述设计的引物对其进行PCR扩增，PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系为：25μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>，0.45μL黄牛基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL。

所述引物对1所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，61.0℃退火30s，72℃延伸1min30s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述引物对2所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63.1℃退火30s，72℃延伸50s，30～35个循环；72℃延伸10min。

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以五个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送南京金斯瑞测序有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图1左起第7个位点出现了T、G两种检测结果、图2所左起第7个位点出现了A、C两种检测结果，即本发明筛查到了黄牛Pax3基因的2个SNPs位点，分别为：在黄牛Pax3基因基因第-580位为T或G的碱基多态性，可以表示为g.-580T>G；在第4617位为A或C的碱基多态性，可以表示为g.4617A>C。

b、黄牛Pax3基因g.-580T>G突变和g.4617A>C突变多态性的PCR-RFLP检测

1、多态位点分析

当Pax3基因第-580位点发生T>G突变时，即T突变为G，周围的其他序列不能形成内切酶识别序列，这时需要通过引物引入错配，使得引物3端和此处的野生型“T”在PCR扩增后形成一个HinfI限制性内切酶识别序列GANTC，这样当第-580位点发生T>G突变时，即T突变为G，内切酶识别序列GANTC相应变成GANGC，从而破坏了HinfI限制性内切酶识别序列，该处突变可以用HinfI-PCR-RFLP方法检测；当Pax3基因第4617位点发生A>C突变时，原来的序列GGAC也相应的变成了HaeIII限制性内切酶识别序列GGCC。因此，该处突变可以用HaeIII-PCR-RFLP方法检测。

2、PCR-RFLP引物设计

针对Pax3基因的第-580位的T>G突变，利用引入酶切位点在线设计软件（http:// helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）进行引物设计，设计的上游引物序列为：

5’-CCCTTCTTTCCCCAGGTTAGAGAC-3’24nt

A为引入错配的碱基，它与野生型“T”形成HinfI内切酶识别序列；

另外，由于Pax3基因第4617位A>C突变位点所在的扩增序列中共有3个HaeIII的识别位点，通过酶切后电泳检测难以精确分型。因此，本研究中设计了一条上游引物，破坏其中一个天然存在的HaeIII的识别位点，从而实现电泳分型。设计的上游引物序列为：

5’-GCGAAGAGGAGGAGACCGA-3’19nt

A为引入错配的碱基，破坏了原有的HaeIII的识别位点（GGCC）。

3、PCR产物酶切及RFLP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别进行HinfI和HaeIII酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

1）酶切体系为20μL，包括：1μL（10U/μL）限制性内切酶，10μL PCR产物，2μL酶切Buffer，7μL灭菌蒸馏水。

2）酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

3）酶切消化后将样品置于65℃水浴5min终止酶切反应，120V电压进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测酶切结果，用BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。

由于黄牛为二倍体动物，当发生T>G突变时，可形成不同的基因型，分别为TT、TG、GG；可以通过其酶切后的电泳图来进行判别，如图3所示，经3.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析，泳道2同时包含210bp、188bp和22bp条带，表现为TG基因型个体，泳道3同时包含188bp和22bp条带，为纯合子TT基因型个体，泳道4包含210bp条带，为GG基因型个体，泳道1为DNAMarker I（600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）。注：由于胶浓度较大，22bp无法显示。

当发生A>C突变时，可能形成不同的基因型，分别为AA、AC、CC；可以通过其酶切后的电泳图来进行识别，如图4所示，经3.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析，泳道1为DNA Marker I（600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）。泳道2包含222bp、91bp和36bp条带，表现为纯合子CC基因型个体，泳道3同时包含222bp和127bp条带，为AA基因型个体，泳道4同时包含222bp、127bp、91bp和36bp条带，为杂合子AC基因型个体，

注：由于胶浓度较大，36bp无法显示。

c、黄牛Pax3基因SNP位点的频率统计及其与生长性状关联分析

1、基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋N_Aa3＋N_Aa4＋……＋N_Aan）/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。统计结果见表2。

表2五个黄牛品种中Pax3基因两个多态位点的基因型和等位基因频率

从表2中可以看出，在HinfI位点，等位基因型G的频率变化范围为0.43～0.62，等位基因型T的频率变化范围为0.39～0.57，并且在NY、JX、QC和LX品种中G为优势等位基因型，而在CY群体内T为优势等位基因型，这说明该位点的基因型分布可能受到黄牛生长环境的影响；在HaeIII位点，等位基因型A的频率变化范围为0.52～0.93，等位基因型C的频率变化范围为0.07～0.48，且在五个黄牛品种中A均为优势等位基因型。

2、基因效应的关联分析

基因型数据：HinfI识别的基因型（TT、TG和GG）

HaeIII识别的基因型（AA、AC和CC）

生产数据：南阳牛6月龄、12月龄、18月龄和24月龄的各种生长性状（包括体重、日增重、体高、体长和胸围）。

关联分析模型：

利用SPSS（18.0）软件分析基因位点的各种基因型和年龄与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijkl=μ+Genotype_i+Age_j＋Xn_k＋e_ijkl

其中：y_ijkl为个体表型记录；Genotype_i为各个位点的基因型效应；Age_m为年龄效应；Xn为两个因素的互作效应：Age×Genotype，e_ijkl为随机误差；运用SPSS（18.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生长性状进行差异显著性检验，结果见表3。

结果表明，在HinfI检测的g.-580T>G位点，TT型6月龄个体的体高和胸围都明显高于TG型和GG型个体，且表现显著水平（P<0.05）；在HaeIII检测的g.4617A>C位点，AA型6月龄个体的体高和体长都明显高于AC型和CC型个体，且表现显著或极显著水平（P<0.05或P<0.01），而其各种基因型与12，18和24月龄的各种生长性状都无显著相关性。

因此，本发明首次成功利用HinfI-PCR-RFLP和HaeIII-PCR-RFLP方法检测了中国地方黄牛Pax3基因的g.-580T>G和g.4617A>C多态位点。并通过关联分析验证，HinfI位点的TT基因型和HaeIII位点AA基因型可以作为黄牛早期分子育种的分子标记。

表3黄牛Pax3基因两个多态位点不同基因型与生长性状关联分析

注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），具有不同小写字母的表示差异显著（P<0.05），不同大写字母的表示差异极显著（P<0.01）。

Claims

1.一种检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，以中国地方黄牛基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg⁺⁺、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物P₁和P₂，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定黄牛单核苷酸多态性；

所述的聚合酶链式反应引物P₁为：

上游引物P₁-F：5’-CCCTTCTTTCCCCAGGTTAGAGAC-3’ 24nt

下游引物P₁-R：5’-GGGCTCGGGAGCATTTATT-3’ 19nt

所述的聚合酶链式反应引物P₂为：

上游引物P₂-F：5’-GCGAAGAGGAGGAGACCGA-3’ 19nt

下游引物P₂-R：5’-AGATTCCGAGGGACTGTGAG-3’ 20nt

2.如权利要求1所述的检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，内含Mg⁺⁺、dNTPs的2×Buffer 12.5μL，0.45μL黄牛基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL；

所述P₁引物所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min；

3.如权利要求1所述的检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度都为3.0％。

4.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，检测到的中国地方黄牛Pax3基因编码区的多态性为：基因组第-580位的T>G突变；基因组第4617位的A>C突变。

5.如权利要求1所述的检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，通过电泳判定黄牛Pax3基因第-580位的碱基多态性为：GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为210、188和22bp条带；TT基因型表现为188和22bp条带。

6.如权利要求1所述的检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，通过电泳判定黄牛Pax3基因第4617位的碱基多态性为：AA基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为222、127、91和36bp条带；CC基因型表现为222、91和36bp条带。