CN107400720B - 一种klf3基因cnv标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种KLF3基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒。基于实时荧光定量PCR技术，以黄牛基因组DNA为模板，扩增黄牛KLF3基因的拷贝数变异区域，并扩增牛通用转录因子BTF3基因作为内参，最后利用2^‑ΔΔCt方法计算并判定个体的拷贝数变异类型。本发明提供的方法为建立牛KLF3基因拷贝数变异与生长性状之间的关联奠定了基础，有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作，该方法简单，快速，便于推广应用。

Description

一种KLF3基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专 用试剂盒

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测牛KLF3基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA实时定量PCR，以BTF3基因为参照，根据-ΔΔCt值从而确定个体的拷贝数变异类型，实现黄牛生长性状分子标记辅助检测。

背景技术

基因组DNA作为生物携带遗传信息的载体，在个体表型形成中发挥着至关重要的作用，而基因组变异则是造成个体间或种间差异的主要遗传来源。如何有效而精确地检测并挖掘出这些关键的与表型性状相关的位点，是现代遗传学研究的热点和亟待解决的问题。

分子育种即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

基因组变异(Genomic variation)是指生物的基因组DNA上发生不可逆转的、可遗传的序列突变，主要包括单核苷酸突变(Single-nucleotide variants,SNVs)、多核苷酸突变(Multinucleotide variants,MNVs)、染色体的倒置和易位。多核苷酸突变又分为短的插入或缺失(Indels)和大片段拷贝数变异。拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)，作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。在检测已知CNV的各种方法中，实时定量PCR(qPCR)是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单、敏感性高、速度快。PCR中选取单拷贝的基因，作为内参基因，然后利用2^-ΔΔCt方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

KLF(Kruppe1 1ike factors)家族是真核生物一大类基础转录因子(Basictranscription element-binding protein，BTEB)，最初发现于果蝇胚胎发育调控因子Kruppel，因其与Kruppel锌指转录因子的DNA结合域高度同源而得名。KLF3是转录因子KLF家族成员之一。研究发现，KLF3具有参与脂肪和红细胞生成、B细胞发育及对肌肉基因调节和神经系统多种生物学功能，成为目前研究热点之一。

但目前为止，尚未见到关于检测牛Kruppel样转录因子3(Kruppel-like factors3,KLF3)基因拷贝数变异的基因组DNA实时定量PCR(quantitive Real-Time PCR,qPCR)的方法报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种KLF3基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测牛KLF3基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增KLF3基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛KLF3基因上的拷贝数变异(CNV)标记位点的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-CTTTTTCTCCAGCTTTTCTGCCC-3’

下游引物R1：5’-CCCATGAGCTATTACGAATGCACCG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

所述的拷贝数变异(CNV)标记为位于KLF3基因候选区域Chr 6:59894701-59896100的拷贝数变异。

所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。

所述的实时定量PCR所用的扩增体系包括：10～50ng/μL模板DNAR1μL以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

所述的实时定量PCR所用的反应程序为：1)95℃预变性10min；2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为186bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测牛KLF3基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

所述拷贝数变异类型中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。

所述生长性状为体长、体高或胸围。

一种KLF3基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的专用试剂盒，包括用于实时定量PCR扩增KLF3基因的拷贝数变异区域的引物对P1(即上述引物对P1)以及扩增作为内参的BTF3基因的部分片段的引物对P2(即上述引物对P2)。

本发明的有益效果体现在：

本发明于利用qPCR技术，检测黄牛KLF3基因的拷贝数变异情况，并通过将不同的拷贝数变异类型与生长性状进行关联分析，寻找到具有优势生长性状的拷贝数变异类型，从而为黄牛的分子育种工作提供基础资料，加快中国黄牛的种质资源改良工作。

本发明公开的检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数变异类型。

本发明对黄牛KLF3基因(KLF3基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行了检测和类型频率统计，并将该CNV类型与黄牛的生长性状进行关联分析。结果表明该CNV类型中，Normal类型的频率最高，而如果检测KLF3基因候选位点的拷贝数变异类型为插入型，则个体相应生长性状表型更优异；如果拷贝数变异类型为缺失型，则个体相应生长性状表型较差。

附图说明

图1为KLF3基因CNV检测引物PCR扩增产物电泳图；图1中：最右泳道为DNA markerI，其余泳道为KLF3基因特异性引物(引物对P1)PCR产物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

在前期的黄牛基因组重测序研究当中，发现了定位于KLF3基因参考序列的8201bp-9600bp区域内的拷贝数变异。因此，本发明根据重测序得到的黄牛KLF3基因序列中发生拷贝数变异的区域设计特异性引物，然后以黄牛(秦川、皮南、夏南、南阳、柴达木黄牛)基因组DNA为模板，进行qPCR扩增，并以BTF3基因为内参基因，利用2^-ΔΔCt方法，判定个体的拷贝数变异类型。基于KLF3基因的生理作用以及CNV的调节机制，研究KLF3基因的拷贝数变异与生长性状的关联性，为黄牛分子育种提供理论依据。

1.样品的采集及基因组DNA提取

(1)血样的采集

本发明中采集的秦川牛来自于陕西省宝鸡市秦川牛原种牛保种场(采集时间：2013年12月)，皮南牛来自于河南省南阳市新野县(采集时间：2016年1月)，夏南牛来自河南省驻马店市泌阳县夏南牛科技开发有限公司(采集时间：2015年6月)，南阳牛来自河南省南阳市南阳牛良种繁育场(采集时间：2015年6月)，柴达木黄牛来自青海省海西州都兰县(采集时间：2015年12月)，5个品种共计302头，都为母牛，血液的采集方法为颈静脉采血。并记录它们的生长性状数据，如体高、体长、胸围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。

(2)血样DNA的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃，12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μLTris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。

⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。

2.目的基因及内参基因的扩增用特异性引物的设计(设计完成时间2017年5月)

以NCBI所公布的牛KLF3基因(NC_007304)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即KLF3基因(目的基因)参考序列的8201bp-9600bp区域(即Chr 6:59894701-59896100)，利用Prime 5.0软件设计被包含在此区域的引物，并在NCBI_BLAST中进行比对。引物序列如下(引物对P1)：

上游引物F1：5’-CTTTTTCTCCAGCTTTTCTGCCC-3’(SEQ.ID.NO.1)

下游引物R1：5’-CCCATGAGCTATTACGAATGCACCG-3’(SEQ.ID.NO.2)

同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因(AC_000177.1)为参考序列，设计扩增BTF3基因(内参基因)中特定片段(166bp)的引物，引物序列如下(引物对P2)：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’(SEQ.ID.NO.3)

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’(SEQ.ID.NO.4)

利用普通PCR扩增和1％的琼脂糖凝胶电泳验证了引物对P1和P2扩增产物的特异性，例如，图1显示了不同个体利用引物对P1扩增的片段，片段大小为186bp。

3.实时定量PCR

qPCR反应体系如表1所示。

表1.qPCR的反应体系

PCR反应程序为：

(1)95℃预变性10min，然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

4.个体CNV类型判定

每个个体样本分别用目的序列和内参序列的引物(P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T内参基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T内参基因})_对照组。C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本，对照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组各品种牛个体。

2^-ΔΔCt表示的是实验组目的序列的拷贝数相对与对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。当目的序列为正常型(Normal)序列时，根据2^-ΔΔCt计算出归一化值为0左右(-0.5≤Log₂ 2^-ΔΔCt≤0.5)。当目的序列为缺失型(Loss)序列时，计算出归一化值Log₂2^-ΔΔCt<-0.5。当目的序列为插入型(Gain)序列时，计算出归一化值Log₂ 2^-ΔΔCt>0.5。据此判定检测的黄牛个体的拷贝数变异类型。

5.数据处理

统计检测群体中各种类型(Gain、Normal和Loss)的个体数。

利用SPSS(19.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+A+B+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数变异类型；E_ijk为随机误差。

数据处理的结果如表2所示。

表2.黄牛KLF3基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)，^*P<0.05，括号里面的数值n表示不同拷贝数变异类型个体的频数。

结果表明，黄牛KLF3基因的拷贝数变异与体高、体长以及胸围这三个生长性状具有显著的关联性。其中，Gain类型的个体生长性状显著优于Normal类型个体。因此，黄牛KLF3基因的Gain拷贝数变异类型可以作为黄牛生长性状早期选择的分子标记，以加快黄牛优势种群选育和中国黄牛的种质资源改良工作。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种KLF3基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

ctttttctcc agcttttctg ccc 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

cccatgagct attacgaatg caccg 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (7)

1.一种检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增KLF3基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛KLF3基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-CTTTTTCTCCAGCTTTTCTGCCC-3’

下游引物R1：5’-CCCATGAGCTATTACGAATGCACCG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’；

所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5；

黄牛KLF3基因的拷贝数变异与体高、体长以及胸围这三个生长性状具有显著的关联性，其中，插入型拷贝数变异类型可以作为黄牛生长性状早期选择的分子标记。

2.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异位于KLF3基因候选区域Chr 6:59894701-59896100。

3.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时定量PCR所用的扩增体系包括：10～50ng/μL模板DNA 1μL以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

4.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时定量PCR所用的反应程序为：1)95℃预变性10min；2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

5.如权利要求1所述的检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述拷贝数变异类型中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在体高、体长以及胸围这三个生长性状上较优。

6.如权利要求1所述的检测黄牛KLF3基因拷贝数变异的方法在辅助检测黄牛生长性状中的应用，其特征在于：所述拷贝数变异类型中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在体高、体长以及胸围这三个生长性状上较优。

7.一种KLF3基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的专用试剂盒，其特征在于：包括用于实时定量PCR扩增KLF3基因的拷贝数变异区域的引物对P1以及扩增作为内参的BTF3基因的部分片段的引物对P2；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-CTTTTTCTCCAGCTTTTCTGCCC-3’

下游引物R1：5’-CCCATGAGCTATTACGAATGCACCG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’；

黄牛KLF3基因的拷贝数变异与体高、体长以及胸围这三个生长性状具有显著的关联性，其中，插入型拷贝数变异类型可以作为黄牛生长性状早期选择的分子标记；

所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。

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