CN109943647B - 一种快速检测黄牛mllt10基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用，基于实时荧光定量PCR技术，以黄牛基因组DNA为模板，利用特异性PCR引物扩增黄牛MLLT10基因拷贝数变异区，并扩增黄牛BTF3基因部分片段作为内参，最后利用2^‑ΔΔCt方法计算并判定个体的拷贝数变异类型。本发明提供的方法为建立黄牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状之间的关联奠定了基础，检测方法简单、快速，可用于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作，便于推广应用。

Description

一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法，该方法利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术，以BTF3基因作为参照，根据-ΔΔCt值确定个体MLLT10基因拷贝数变异类型。

背景技术

标记辅助选择(marker-assisted selection)中，要么知道所要评定的性状有某些QTL(主效基因)存在，并且能直接测定它们的基因型(例如通过候选基因分析发现的QTL)，要么虽不能测定它们的基因型，但知道它们与某些标记的连锁关系(例如通过标记-QTL连锁分析发现的QTL)，可以测定这些标记的基因型，这时就可将这些信息用到个体的遗传评定中，提高精确性。

拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是一种常见的遗传多态性，主要表现为亚显微水平的缺失和重复，是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少。CNV常用的检测方法主要分为两类：一类主要用于在全基因组范围内检测未知CNV，包括基因组芯片和高通量测序技术；另一类主要用于定点检测或验证已知CNV。

其中芯片方法主要包括比较基因组杂交芯片(Comparative GenomicHybridization,CGH)和SNP芯片，在比较基因组芯片中寡核苷酸探针芯片因其具有高精度、高灵敏度、样本需要量小等特点，被广泛使用。SNP芯片在检测时不需要对照样本，通过被检测样本内SNP信号强度来进行分析。其主要优点是能同时提供拷贝数和基因型信息，还可以显示杂合性缺失。但是SNP芯片上的探针在基因组分布不均衡，很多复杂区域探针设计困难。因此，SNP芯片在检测CNV时有一定的局限性。随着新一代测序技术的成熟，直接通过重测序来检测基因组结构变异已经成为当前最有效的检测手段。与杂交技术相比，利用测序技术来检测CNV具备很多优势：提高了CNV的分辨率；可以确定CNV的边界；可以检测出个体CNV的绝对拷贝数；对于结构变化复杂的CNV也有较高检测效力。但这种方法成本较高。

在检测已知CNV的各种方法中，qPCR是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单，敏感性高，速度快。PCR中选取单拷贝的基因，作为内参基因，然后利用2^-ΔΔCt的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

截止目前，MLLT家族基因少部分在医学领域得到研究，有研究表明MLLT10基因与皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)具有强烈的相关性。但未见到关于检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的实时定量PCR的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用。

为达到以上目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以待测黄牛血液基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增MLLT10基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛个体MLLT10基因的拷贝数变异类型；所述的拷贝数变异区域位于牛MLLT10基因(GeneID:519864)参考基因组序列Chr 13:23206001-23210800，共4800bp。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt＞0.5；缺失型，-ΔΔCt＜-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-GCCACCCTGACTCGTACTTAG-3’

下游引物R1：5’-CACCCCCTCCGTGAGAATAA-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括：50ng/μL模板DNA 1μL以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为113bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，具有缺失型拷贝数变异类型的秦川牛个体在生长性状(腰角宽)上较优；具有多拷贝型拷贝数变异类型的夏南牛个体在生长性状(管围)上较优；具有正常型拷贝数变异类型的云岭牛个体在生长性状上与具有多拷贝型及缺失型拷贝数变异类型的云岭牛个体差异显著，例如，具有正常型拷贝数变异类型的云岭牛个体在尻长上较优，具有缺失型和多拷贝型拷贝数变异类型的云岭牛个体在坐骨端宽上较优。

一种检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对P1和引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明公开的检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数类型，便于推广应用。本发明在DNA水平上检测与黄牛生长性状密切相关的MLLT10基因拷贝数变异，该拷贝数变异可作为中国黄牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记(CNV标记)，用于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作。

本发明对黄牛MLLT10基因(MLLT10基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行了检测和类型频率统计，并将CNV位点与黄牛的生长性状进行关联分析。结果表明该位点在秦川牛中，Duplication类型(多拷贝型)的频率最高，而且该位点的Duplication类型对秦川牛的腰角宽性状有显著的负效应；在夏南牛中，Duplication类型(多拷贝型)的频率最低，对夏南牛的管围性状有提高作用；在云岭牛中，Normal类型(正常型)的频率最地，在云岭牛的尻长性状中有提高作用，但在坐骨端宽性状中具有负效应。黄牛MLLT10基因拷贝数变异与黄牛重要生长性状的关联分析结果，可以为黄牛分子育种提供理论依据，便于中国黄牛生长性状的分子标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为MLLT10基因CNV检测引物PCR扩增产物电泳图；其中，右侧第一泳道为DNAmarker Ⅰ，其余三个泳道为MLLT10基因PCR扩增产物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述实施例仅是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

在前期的黄牛基因组重测序研究中，发现了定位于牛MLLT10基因非编码区Chr13:23206001-23210800区域内的拷贝数变异。因此，本发明根据重测序得到的黄牛MLLT10基因序列中发生拷贝数变异的区域设计特异性引物，然后以黄牛(秦川牛、夏南牛、郏县牛、云岭牛)基因组DNA为模板，进行qPCR扩增，并以BTF3基因为内参基因，利用2^-△△Ct方法，判定个体的拷贝数变异类型。基于MLLT10基因的生理作用以及CNV的调节机制，研究MLLT10基因的拷贝数变异与腰角宽等性状的关联性，为黄牛分子育种提供资料。2^-△△Ct方法是指实验组拷贝数相对于对照组的倍数，将基因表达丰度指数化(Log₂2^-△△Ct)，进行方差齐性检验，统计各组间差异。

1.样品的采集及基因组DNA提取

(1)血样的采集

本发明中采集的秦川牛(112头)血样来自陕西省宝鸡市扶风县秦川肉牛良种繁育中心(采集时间2013年12月)，夏南牛(192头)血样来自河南省驻马店市泌阳县夏南牛科技有限公司(采集时间2015年6月)，郏县牛(96头)血样采自河南省平顶山市郏县红牛良种繁育中心(采集时间2012年8月)，云岭牛(96头)血样采自云南省昆明市官渡区小哨乡云南省草地动物科学研究院(采集时间2018年9月)，4个品种共496头黄牛个体的血液的采集方法为颈静脉采血。并记录它们的生长性状数据，如体高、体长、胸围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。

(2)血样DNA的提取(酚-氯仿法)

①冰冻的血样在室温水浴融化，将2mL全血转入无菌2mL离心管中。

②4℃、12000r/min离心10min，弃掉液体，保留沉淀，加入1.5mL PBS缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮，冰上温和摇动15min。

③4℃、12000r/min离心10min，弃掉液体，保留沉淀。重复步骤3一次。

④捣碎沉淀，呈絮状，离心管中加DNA提取液500μL和蛋白酶k 6μL，在恒温水浴箱中37℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀被消化，溶液澄清。

⑤加入1mL Trips饱和酚，冰上温和摇动20min，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相移入另一个2mL离心管中。

⑥加入1mL氯仿，冰上温和摇动20min，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入新的1.5mL离心管。

⑦加入1mL预冷无水乙醇(-20℃)，轻摇至DNA析出，-20℃置30min，4℃、12000r/min离心10min，弃去乙醇。

⑧加入70％乙醇1mL，温和摇动10min，4℃、12000r/min离心10min，弃乙醇，重复洗一次。

⑨室温放置30min，60℃烘箱30s，使乙醇蒸发干净。

⑩加入超纯水50μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测浓度后-80℃保存。2.目的基因及内参基因的扩增用特异性引物设计

以NCBI所公布的牛MLLT10基因为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即牛MLLT10基因(GeneID:519864)参考序列(Chr 13:23206001-23210800)，利用Prime 5.0软件设计包含此区域的引物。引物序列(引物对P1)如下(引物设计时间2018年7月)：

上游引物F1：5’-GCCACCCTGACTCGTACTTAG-3’

下游引物R1：5’-CACCCCCTCCGTGAGAATAA-3’

同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因(AC_000177.1)为参考序列，设计扩增内参基因(BTF3基因)中特定片段(166bp)的引物，其引物序列(引物对P2)如下(引物设计时间2018年3月)：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’

利用普通PCR扩增和1％的琼脂糖电泳验证了引物对P1(图1)和P2扩增产物的特异性。

3.实时荧光定量PCR

qPCR的反应体系如表1所示：

表1.qPCR的反应体系

PCR反应程序为：

①95℃预变性10min；

②95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

4.个体CNV类型鉴定

实验结果采用2^-△△Ct方法进行计算，具体的计算方法为：ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)，ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}

公式中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本。参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组黄牛个体。C_t即Cyclethreshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。根据-ΔΔCt将定量结果分为三类：多拷贝型(Duplication)，-ΔΔCt＞0.5；缺失型(Deltion)，-ΔΔCt＜-0.5；正常型(Normal)，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。

5.数据处理

生产数据：体高、十字部高、体长、胸围、胸宽、胸深、尻长、坐骨端宽、腰角宽、体重。

统计检测群体中三中类型(Deltion、Normal、Duplication)个体数。利用SPSS进行关联性分析。在数据处理中，根据影响体尺性状指标的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化，完整模型如下：

Y_ijk＝μ+A+B+G_j+E_ijk

Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数变异类型；E_ijk为随机误差。

秦川牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析结果如表2所示：

表2.秦川牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上字母不同表示差异显著(P＜0.05)，*P＜0.05；括号里的数字表示不同拷贝数变异类型个体的频数，下同。

夏南牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析结果如表3所示：

表3.夏南牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

云岭牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析结果如表4所示：

表4.云岭牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

结果表明，秦川牛MLLT10基因的拷贝数变异类型与腰角宽具有显著的关联性，其中，Deltion类型的个体优于Duplication和Normal类型的个体；夏南牛MLLT10基因的拷贝数变异类型与管围关联性显著，其中，Duplication类型的个体显著优于Deltion和Normal类型的个体；云岭牛MLLT10基因的拷贝数变异类型与尻长、坐骨端宽具有显著的关联性，其中，Normal类型的个体尻长显著优于Deltion和Duplication类型的个体。

实验结果表明MLLT10基因(GeneID:519864)的拷贝数变异区域(位于参考序列Chr13:23206001-23210800)Deltion类型可以作为黄牛(秦川牛、夏南牛、云岭牛)生长性状早期选择的分子标记(CNV标记)，以便加快黄牛分子标记辅助选择育种工作。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210>1

<211>21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

gccaccctga ctcgtactta g 21

<210> 2

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

caccccctcc gtgagaataa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (2)

1.检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以待测黄牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增MLLT10基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛MLLT10基因的拷贝数变异类型；所述的拷贝数变异区域位于牛MLLT10基因参考基因组序列Chr 13:23206001-23210800；

所述的MLLT10基因的拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5’-GCCACCCTGACTCGTACTTAG-3’

下游引物R1：5’-CACCCCCTCCGTGAGAATAA-3’；

所述的BTF3基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’；

所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt＞0.5；缺失型，-ΔΔCt＜-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5；

具有缺失型拷贝数变异类型的秦川牛个体在生长性状腰角宽上优于具有多拷贝型及正常型拷贝数变异类型的秦川牛个体；具有多拷贝型拷贝数变异类型的夏南牛个体在生长性状管围上显著优于具有缺失型及正常型拷贝数变异类型的夏南牛个体；具有正常型拷贝数变异类型的云岭牛个体在生长性状尻长上与具有多拷贝型及缺失型拷贝数变异类型的云岭牛个体差异显著。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。

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