CN110964838B - 一种快速检测绵羊lrrfip1基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents

一种快速检测绵羊lrrfip1基因cnv标记的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测绵羊LRRFIP1基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以绵羊血样全基因组DNA为模板，利用一对特异引物扩增绵羊LRRFIP1基因的拷贝数变异区域的部分片段，利用另外一对特异性引物扩增绵羊ANKRD1基因部分片段作为对照，然后利用2*2‑ΔCt的方法计算并判定个体的拷贝数变异类型，基于绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联，本发明提供的方法可用于快速建立茶卡羊等地方绵羊品种的遗传资源优势种群，有利于加快茶卡羊等的分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种快速检测绵羊LRRFIP1基因CNV标记的方法及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一种检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法，该方法利用实时定量PCR技术，以基因组DNA为模板，以ANKRD1基因为参照，根据2*2-ΔCt值从而确定个体的拷贝数变异类型。
背景技术
DNA分子标记(DNAmolecular marker)是反映个体和种群间基因组特异性的DNA片段。分子标记包括限制性片段长度多态性标记(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增基因组DNA多态性标记(Random Amplified PolymorphicDNA，RAPD、扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、微卫星DNA(Microsatellite，MS)、单核苷酸多态性标记(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)、插入/缺失多态性(Indels)等。而拷贝数变异(CNVs)是指长度为1kb至数Mb的有关DNA片段拷贝数突变，包括DNA单一片段的扩增、缺失、插入、倒置等，也包括复杂的染色体扩增、缺失和插入的各种组合，由于CNVs比SNPs和Indels覆盖范围更广，因此，遗传效应更大，可用作分子育种标记。
富亮氨酸重复序列(Fli-1)相互作用蛋白-1(leucine-rich repeat(inflightless I)interacting protein-1,LRRFIP1)蛋白是一种转录抑制因子，能够作为Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路的一个调节器发挥重要的作用，参与调节炎症反应。LRRFIP1基因还参与调节肥胖患者血浆CRP、IL-6表达水平，但相关变异在家畜中的影响还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测绵羊LRRFIP1基因CNV标记的方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以待测绵羊(例如，茶卡羊等地方绵羊品种)个体血样全基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增LRRFIP1基因的拷贝数变异区域及作为内参的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定待测绵羊个体LRRFIP1基因的拷贝数变异类型。
优选的，所述的LRRFIP1基因的拷贝数变异区域位于绵羊LRRFIP1基因参考基因组序列NC_019458.2的3239601位至3242400位，共2800bp。
优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2-ΔCt>2；缺失型，2*2-ΔCt<2；正常型，2*2-ΔCt＝2。
优选的，所述的引物对P1为：
上游引物F1：5’-CGCTGAGCTGTCCCAATACA-3’
下游引物R1：5’-GGGAAAGACTCCCTGTAAACACT-3’；
所述的引物对P2为：
上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’
下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。
优选的，所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括：10ng/μL模板DNA 1μL及10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。
优选的，所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。
优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为127bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为143bp。
上述检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，所述的待测绵羊(例如，茶卡羊)群体中，具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，胸围、体重)上优于具有正常型、缺失型拷贝数变异类型的个体。
本发明的有益效果体现在：
本发明以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用实时荧光定量PCR准确、可靠的检测个体的基因组中LRRFIP1基因的拷贝数变异类型，根据检测结果，以及绵羊群体中的拷贝数变异情况与其体重、胸围、体高、体长等重要经济性状关联分析的结果，本发明提出的检测LRRFIP1基因CNV标记的方法可以用于快速建立生长性状(例如，体重、胸围)优势绵羊种群(例如，茶卡羊种群)，从而加快绵羊优良性能的选育进程。该方法简单、快速、便于推广应用。
附图说明
图1为本发明中进行qPCR(LRRFIP1基因)绘制的扩增曲线。
图2是本发明中进行qPCR(LRRFIP1基因)绘制的溶解曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
本发明利用实时荧光定量PCR对LRRFIP1基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：
(1)利用NCBI数据库查找LRRFIP1基因序列，再用Primer 5.0软件进行引物设计。
(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；
(3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与绵羊生长性状进行关联分析，筛选到与绵羊生长性状相关的CNV标记；
(4)根据拷贝数变异类型获得生长性状优异的绵羊种群，进行选育。
1、茶卡羊样本采集
本发明具体以221头茶卡羊作为检测对象，茶卡羊血样采集自青海省乌兰县茶卡镇，采样时间是2018年5月。
2、血样基因组DNA的提取
1)冰冻的血样在室温水浴中融化，将1mL全血转入一个无菌的2mL离心管中。
2)加入等体积的PBS缓冲液，温和摇动10min，室温3500g离心10min。
3)用移液器吸弃上清，重复步骤2至上清液透明，沉淀无色。
4)离心管中加DNA提取液1mL，温和摇动使细胞沉淀悬浮，加入蛋白酶K 3μL(终浓度为60μg/mL)，混匀。
5)在恒温水浴箱中55℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清。
6)反应液冷却至室温，加入1倍体积(1mL)的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，4℃、12000g离心10min。
7)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。
8)加入0.5倍体积(0.5mL)的酚和0.5倍体积(0.5mL)的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃、12000g离心10min。
9)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。
10)加入1倍体积(1mL)的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃、12000g离心10min。
11)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。
12)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min。
13)用玻璃钩将DNA团钩出转入一新的灭菌离心管中，或4℃、12000g离心10min，弃去乙醇。
14)加入70％乙醇1mL，温和摇动10min，4℃、12000g离心10min，弃乙醇；重复漂洗一次。
15)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净，根据DNA的量，加入超纯水100～300μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。
3、目标序列及内参序列的扩增
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的绵羊LRRFIP1基因序列(GenBank Accession No.NC_019458.2)为参考序列，利用Primer 5.0设计CNV区域(NC_019458.2的3239601位至3242400位)中一段127bp的序列(目标序列)的引物(引物对P1)，内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即ANKRD1基因中的一段143bp的序列，采用相同方法设计扩增内参序列的引物(引物对P2)。引物对序列信息如表1所示(引物合成时间2018年10月)。
表1.实时荧光定量PCR的引物信息
Figure BDA0002355311100000041
实时荧光定量PCR所用的扩增体系以10μL计为：10ng/μL模板DNA(血样基因组DNA)1μL，10pmol/L的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix 5μL，及ddH2O 3μL。
PCR扩增的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。绘制溶解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。
通过绘制扩增曲线(图1)和溶解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。
4、拷贝数变异的推断
每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2-ΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝Ct目的基因–Ct内参基因。2*2-ΔCt表示的是拷贝数。Ct即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。根据2*2-ΔCt将定量结果分为三类：多拷贝型(Gain)，2*2-ΔCt>2；缺失型(Loss)，2*2-ΔCt<2；正常型(Median)，2*2-ΔCt＝2。
5、LRRFIP1基因CNV位点与生长性状的关联分析
生产数据：体高、体长、胸围、体重。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：Yijk＝μ+Ai+CNVj+eijk。其中：Yijk为性状观察值，μ为总体均值，Ai为第i头个体的年龄，CNVj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。数据处理结果见表2。
表2.茶卡羊LRRFIP1基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
Figure BDA0002355311100000051
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。
关联分析结果表明(见表2)：在茶卡羊中，具有多拷贝型的个体在胸围和体重上优于正常型和缺失型的个体。说明LRRFIP1基因CNV位点的多拷贝型可以作为一个提高绵羊生长性状(例如，胸围、体重性状)的候选分子遗传标记(CNV标记)。
6、上述CNV标记在绵羊选育中的应用
获得的候选分子遗传标记，可以用于寻找与其相关或紧密连锁的影响绵羊生长性状的数量性状基因座。还可以用于绵羊的分子标记辅助选择，即通过对绵羊LRRFIP1基因CNV位点拷贝数变异类型的检测，选择多拷贝型的个体留种并扩繁，从而能够加快绵羊品种(例如，茶卡羊)改良的选育进程。
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种快速检测绵羊LRRFIP1基因CNV标记的方法及其应用
<160> 4
<210> 1
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<212> DNA
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cgctgagctg tcccaataca 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gggaaagact ccctgtaaac act 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tgggcaccac gaaattctca 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tggcagaaat gtgcgaacg 19

Claims (4)

1.一种检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
以绵羊基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增LRRFIP1基因的拷贝数变异区域和作为内参的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定绵羊LRRFIP1基因的拷贝数变异类型；所述绵羊为茶卡羊；
所述的LRRFIP1基因的拷贝数变异区域位于绵羊LRRFIP1基因参考基因组序列NC_019458.2的3239601bp至3242400bp；
所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2-ΔCt >2；缺失型，2*2-ΔCt <2；正常型，2*2-∆Ct =2；
所述的引物对P1为：
上游引物F1：5’- CGCTGAGCTGTCCCAATACA -3’
下游引物R1：5’- GGGAAAGACTCCCTGTAAACACT-3’ ；
所述的引物对P2为：
上游引物F2：5’- TGGGCACCACGAAATTCTCA -3’
下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG -3’ ；
具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体在胸围和体重上优于具有正常型和缺失型拷贝数变异类型的个体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括：10ng/μL模板DNA 1 μL及10 pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5 μL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为： 95℃预变性10 min； 95℃变性15 s，60℃退火1min，共40个循环。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为127bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为143 bp。
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