CN109988847A

CN109988847A - 一种检测茶卡羊she基因cnv标记的方法及其应用

Info

Publication number: CN109988847A
Application number: CN201910308792.1A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 蒋瑞; 程杰; 胡林勇; 黄永震; 蓝贤勇; 曹修凯
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: CN109988847B

Abstract

本发明公开了一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以茶卡羊的血液全基因组DNA为模板，扩增茶卡羊SHE基因的拷贝数变异区域，并以扩增的茶卡羊ANKRD1基因片段作为内参，然后利用2*2^‑ΔCt的方法计算个体的拷贝数变异类型。通过对拷贝数变异与生长性状进行关联分析，本发明提供的检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法为建立茶卡羊SHE基因拷贝数变异与体长性状之间的关联奠定了基础，可用于加快茶卡羊体长性状的选育进程，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及茶卡羊SHE基因CNV标记的检测。

背景技术

绵羊在世界各地均有饲养，性情温顺，易驯化，可以为人类提供肉和毛皮等产品。体尺性状和羊肉的质量是由多种基因共同调控的。随着对基因组研究的深入，有证据证明拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)可能影响相关基因的转录翻译，从而调控基因网络，进而影响个体表型变化，因此优化与体尺性状相关的候选DNA标记如CNV标记有助于加速绵羊的育种进程。

拷贝数变异一般是指在全基因组范围大于50bp的缺失、复制和插入的结构变异，是基因组内发生重排导致的，可以通过剂量效应改变对剂量效应敏感基因的表达水平；通过产生融合基因、基因功能阻断、位置效应、隐性等位基因的去除效应等影响基因的功能和个体间的表型。

目前，人和动物全基因组范围内的CNVs检测方法主要有三种：微阵列比较基因组杂交芯片(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、单核苷酸多态性芯片(SNP Array)和二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)。在比较基因组杂交芯片中寡核苷酸探针芯片被广泛使用，具有高灵敏度、高精度和样本量小的特点；SNPArray是利用芯片探针的平均信号强度和最小等位基因频率，并结合统计模型进行拷贝数的推断，但其准确性并不比aCGH芯片高，而且不同算法检测的结果差异较大。现有的芯片平台对新的拷贝数变异的检测效率很低，随着二代测序技术的发展，当前最有效的CNVs检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。

目前，对基因组己知的CNV检测主要有两种方法，基于PCR的检测技术和基于杂交的检测技术。PCR检测技术主要包括实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(Multiplex Ligation-Dependent ProbeAmplification,MLPA)和短片段多重定量技术(Quantitative Multiplex PCR of ShortFluorescent Fragments,QMPSF)。目前使用最广泛的是qPCR技术，该方法敏感性高、操作方法简单、速度快、重复性好而且污染少。杂交技术主要包括Southern blotting杂交、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(Multiplex Amplifiable Probe Hybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。

SHE蛋白包含转化蛋白E的Src同源结构域(Src Homology2Domain ContainingE)，是SH2家族的重要成员。SH2是一个结构保守的蛋白域，它的功能是特异性识别磷酸化酪氨酸残基，从而使含有SH2结构域的蛋白质定位于酪氨酸磷酸化位点，该过程是膜信号转导的基本步骤，其中细胞外区室中的信号被受体“感知”并且在细胞内区室中转化成磷酸化酪氨酸的化学形式，最终导致基因表达或其他细胞反应。但SHE基因在绵羊等家畜上的功能研究还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法，包括以下步骤：

以茶卡羊血液全基因组DNA为模板，以引物对SHE-CNV及引物对ANKRD1-REF为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增SHE基因的拷贝数变异区域及作为内参序列的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊SHE基因的拷贝数变异类型；所述的SHE基因拷贝数变异区域位于SHE基因参考基因组序列NC_019458.2的103174001bp至103176000bp，共2000bp。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔCt≤2.5(一般2*2^-ΔCt≈2)。

优选的，所述的引物对SHE-CNV为：

上游引物F1：5’-AACAAAGCGCATTTAGGGCA-3’

下游引物R1：5’-ACGTCATGATCCAGCGATAGT-3’；

所述的引物对ANKRD1-REF为：

上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。

优选的，所述的实时荧光定量PCR的扩增体系为：25ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物对SHE-CNV或引物对ANKRD1-REF所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×SYBR GreenqPCR Mix6.25μL和ddH₂O4.25μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：1)95℃预变性10min；2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；3)绘制熔解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。

优选的，基于引物对SHE-CNV扩增的PCR产物片段大小为174bp，基于引物对ANKRD1-REF扩增的PCR产物片段大小为143bp。

上述检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，茶卡羊群体中具有正常型拷贝数变异类型的个体在体长等生长性状上优于缺失型和插入型拷贝数变异类型的个体。

一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对SHE-CNV及引物对ANKRD1-REF。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据所发现的位于绵羊SHE基因候选区域Chr1:103174001bp-103176000bp的拷贝数变异位点，建立了通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在茶卡羊群体中的拷贝数变异情况的方法，检测方法操作简便，可以快速、准确、可靠的获得茶卡羊个体SHE基因拷贝数变异类型；通过对茶卡羊SHE基因拷贝数变异与体高、体长、体重、胸围等重要经济性状进行关联分析，发现茶卡羊SHE基因的对应拷贝数变异位点可以作为CNV标记，其检测不受个体年龄和性别的限制，可用于早期选育，为绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，从而加快优势绵羊种群的建立及育种进程(例如，可用于加快茶卡羊体长性状的选育进程)。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR绘制的扩增曲线。

图2为本发明实施例中进行qPCR绘制的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

本发明利用实时荧光定量PCR对茶卡羊SHE基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)根据NCBI数据库的绵羊SHE基因序列，用Primer5.0软件进行引物设计；

(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用SPSS23.0软件将拷贝数变异类型与绵羊生长性状进行关联分析，筛选到一个与茶卡羊生长性状相关的CNV标记；该CNV标记位于绵羊SHE基因(GenBank AccessionNo.NC_019458.2)参考序列的103174001-103176000区域内。

(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的绵羊优势种群选育。

1、茶卡羊样本采集

本发明以茶卡羊作为检测对象，302头茶卡羊的血液样本采集自青海省乌兰县茶卡镇(2018年5月采集)。

2、血样DNA的提取

1)冰冻的血样在室温水浴中融化，将1mL全血转入一个无菌的2mL离心管中。

2)加入等体积的PBS缓冲液，温和摇动10min，室温3500g离心10min。

3)用移液器弃上清，重复步骤2至上清液透明，沉淀无色。

4)离心管中加DNA提取液1mL，温和摇动使细胞沉淀悬浮，加入蛋白酶K3μL(终浓度为60μg/mL)，混匀。

5)在恒温水浴箱中55℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清。

6)反应液冷却至室温，加入1倍体积(1mL)的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，4℃，12000g离心10min。

7)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。

8)加入0.5倍体积(0.5mL)的酚和0.5倍体积(0.5mL)的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃12000g离心10min。

9)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。

10)加入1倍体积的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃12000g离心10min。

11)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。

12)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min。

13)用玻璃钩将DNA团转入一新的灭菌离心管中，4℃12000g离心10min，弃去乙醇。

14)加入70％乙醇1mL，温和摇动10min，4℃12000g离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次。

15)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净，根据DNA的量，加入超纯水100～300μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

3、目标序列及内参序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的绵羊SHE基因序列(GenBank Accession No.NC_019458.2)为参考序列，利用Primer5.0设计扩增茶卡羊SHE基因对应拷贝数变异区域(目标序列)的实时荧光定量PCR引物对。通过绘制的扩增曲线(图1)和熔解峰来确定引物是否适用于qPCR分析。内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，具体选择为ANKRD1基因中的一段143bp的序列。目标序列和内参序列的扩增引物对序列信息具体参见表1(2018年7月)。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。

上述实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：25ng/μL模板DNA 1μL，10pmol/L的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix6.25μL，ddH₂O4.25μL。

上述实时荧光定量PCR所用的扩增反应程序为：1)95℃预变性10min；2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；3)绘制熔解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2^-ΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝Ct_目的序列–Ct_内参序列。2*2^-ΔCt表示的是拷贝数。根据2*2^-ΔCt将定量结果分为三类：插入型(Gain)，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型(Loss)，2*2^-ΔCt<1.5；正常型(Normal)，2*2^-ΔCt≈2。C_t即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

5、SHE基因CNV位点与生长性状的关联分析

生产数据：体高、体长、胸围、体重。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS23.0软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+A_i+CNV_j+e_ijk

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。

表2.茶卡羊SHE基因CNV拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；括号里面的数值表示拷贝数类型的频率。

关联分析结果表明(见表2)：具有正常型拷贝数变异类型的茶卡羊个体在体长性状上优于缺失型和插入型拷贝数变异类型的茶卡羊个体。说明SHE基因上的CNV位点(NC_019458.2的103174001bp至103176000bp)可以作为一个提高茶卡羊体长性状的候选分子遗传标记。

6、CNV标记在绵羊选育中的应用

以上的CNV(NC_019458.2的103174001bp至103176000bp)位点可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响绵羊体长性状的数量性状基因座，以对茶卡羊进行分子标记辅助选择，从而加快茶卡羊品种改良的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aacaaagcgc atttagggca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

acgtcatgat ccagcgatag t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<400> 3

tgggcaccac gaaattctca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tgggcaccac gaaattctca 20

Claims

1.一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

利用实时荧光定量PCR，以待测茶卡羊基因组DNA为模板，分别扩增茶卡羊SHE基因拷贝数变异区域，以及作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊个体SHE基因拷贝数变异类型；所述的SHE基因拷贝数变异区域位于SHE基因参考基因组序列NC_019458.2的103174001bp至103176000bp。

2.如权利要求1所述一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔCt≤2.5。

3.如权利要求1所述一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的SHE基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5’-AACAAAGCGCATTTAGGGCA-3’

下游引物R1：5’-ACGTCATGATCCAGCGATAGT-3’；

所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。

4.如权利要求1所述一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于缺失型和插入型拷贝数变异类型的个体。

7.一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增茶卡羊SHE基因拷贝数变异区域的引物对，所述的SHE基因拷贝数变异区域位于SHE基因参考基因组序列NC_019458.2的103174001bp至103176000bp。

8.如权利要求7所述一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的SHE基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5’-AACAAAGCGCATTTAGGGCA-3’

下游引物R1：5’-ACGTCATGATCCAGCGATAGT-3’。

9.如权利要求7所述一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参序列的引物对，内参序列选自ANKRD1基因部分片段。

10.如权利要求9所述一种检测茶卡羊SHE基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。