CN110079610A

CN110079610A - 一种检测茶卡羊bag4基因cnv标记的方法及其应用

Info

Publication number: CN110079610A
Application number: CN201910379625.6A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 杨兆鑫; 胡林勇; 蓝贤勇; 黄永震; 胡沈荣
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-05-08
Also published as: CN110079610B

Abstract

本发明公开了一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以茶卡羊血样全基因组DNA为模板，扩增茶卡羊BAG4基因的拷贝数变异区域，并以扩增的茶卡羊ANKDR1基因片段作为内参，利用2^‑ΔCt的方法计算个体的拷贝数，通过对拷贝数变异与生长性状进行关联分析，该拷贝数变异区域的不同基因型显著影响茶卡羊的生长性状，本发明在DNA水平上检测与茶卡羊生长性状密切相关的分子遗传标记，可用于茶卡羊生长性状的标记辅助选择，从而快速建立优良的茶卡羊种群，该方法具有简单、快速，便于推广应用的特点。

Description

一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因拷贝数变异(CNV)的检测，特别涉及一种检测茶卡羊BAG4基因拷贝数变异的方法，该方法以基因组DNA为模板，以ANKRD1基因为参照，根据2*2^-ΔCt值从而确定个体的拷贝数是否插入或缺失。

背景技术

青海高原毛肉兼用半细毛羊，最早是在茶卡地区进行改良繁殖的，又名茶卡羊。茶卡羊是由新疆细毛羊和茨盖羊与当地的藏羊和蒙古羊杂交，后又引入罗姆尼羊进行横交固定培育而成，对严酷的高寒环境条件具有良好的适应性，对饲养管理条件的改善反应明显。

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，揭开了动物生长发育的各种生物学机制。动物的体尺性状和产肉及产毛的质量是由多种基因共同调控的。现在认为分子标记辅助选择中通过提高优秀的分子标记频率对于动物基因的发展是有效的。随着对基因组研究的深入，有证据证明拷贝数变异(copy number variations,CNVs)可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型的可变性，因此优化与体尺性状相关的候选CNVs等DNA标记，可以加速羊的遗传育种进程。

拷贝数变异一般是指在全基因组范围大于50bp的缺失、复制和插入的结构变异，是基因组内发生重排导致的，可以通过剂量效应影响改变对剂量效应敏感基因的表达水平；通过产生融合基因，还有基因功能阻断、位置效应、隐性等位基因的去除效应等影响基因的功能和个体间的表型。

目前，人和动物全基因组范围内的CNVs筛查方法主要有三种：微阵列比较基因组杂交芯片(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)和SNP芯片技术。在比较基因组杂交芯片中寡核苷酸探针芯片被广泛使用，具有高灵敏度、高精度和样本量小的特点，此外，现有的芯片平台对新的拷贝数变异的检测效率很低。随着二代测序技术的发展，当前最有效的检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。

对基因组己知的CNV检测主要有两种方法：基于PCR的检测技术和基于杂交的检测技术。PCR的检测技术主要包括实时荧光定量PCR(qPCR)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification,MLPA)和短片段多重定量技术(Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments,QMPSF)。目前使用最广泛的是qPCR技术，该方法敏感性高、操作方法简单、速度快、重复性好且污染少，但不适用于大样本的高通量检测。杂交技术主要包括Southern blotting杂交、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(MultiplexAmplifiable Probe Hybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。

BAG4(Bcl-2-associated athanogene4)又称死亡结构域沉默子(scilencer ofdeath domain,SODD)，属于BAG(Bcl-2-associated anthanogene)家族成员之一。BAG4可以特异性地结合于Bcl-2，DR3，TNF-R1胞浆内的死亡结构域，进而阻止凋亡信号的进一步传导，尤其在TNF-R1介导的凋亡途径中BAG4是最关键的负调控因子。研究表明BAG4蛋白广泛分布于细胞质及细胞核中，参与癌细胞的存活，若BAG4持续高表达可以抑制TNFR1介导的凋亡，细胞则会出现永生化或者癌变。BAG4基因的异常表达和肿瘤的发生密切相关，并与乳腺癌、胃癌和胰腺癌的侵袭性有关。目前关于BAG4基因的拷贝数变异在动物上尤其是与绵羊个体生长性状差异关系的研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法及其应用，加快建立遗传资源优良的茶卡羊种群。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法，包括以下步骤：

以待测茶卡羊血样全基因组DNA为模板，以引物对BAG4-CNV以及引物对ANKRD1-REF为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增BAG4基因的拷贝数变异区域以及作为内参序列的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊个体BAG4基因的拷贝数变异类型；所述的BAG4基因拷贝数变异区域位于绵羊BAG4基因参考基因组序列NC_019483.2的31982401至31984000bp，共1600bp。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔCt≤2.5(例如，2*2^-ΔCt≈2)。

优选的，所述的引物对BAG4-CNV为：

上游引物F1：5’-TGGATGAAGACACAAAGACCA-3’

下游引物R1：5’-TCAAAGGAAACCCCATACCCT-3’；

所述的引物对ANKRD1-REF为：

上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系为：25ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物对BAG4-CNV或引物对ANKRD1-REF所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×SYBR Green qPCR Mix6.25μL和ddH₂O4.25μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；(3)绘制溶解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。

优选的，基于引物对BAG4-CNV扩增的PCR产物片段大小为150bp，基于引物对ANKRD1-REF扩增的PCR产物片段大小为143bp。

上述检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，在茶卡羊中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，体高)上优于正常型拷贝数变异类型和插入型拷贝数变异类型的个体。

一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括上述引物对BAG4-CNV或引物对ANKRD1-REF。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据所发现的位于绵羊BAG4基因(GenBank Accession NC_019483.2)31982401至31984000bp区域的拷贝数变异(CNV)位点，建立了通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在茶卡羊群体中的拷贝数变异的方法，检测方法操作简便，可以快速、准确、可靠的获得茶卡羊个体BAG4基因在对应CNV位点的拷贝数变异类型；通过对茶卡羊BAG4基因拷贝数变异与体高、体长、胸围、体重等重要经济性状进行关联分析，发现茶卡羊BAG4基因的这一拷贝数变异位点可以作为CNV标记，其检测不受年龄和性别的限制，可用于早期选育，为绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，从而加快优势绵羊种群的建立及育种进程。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR(BAG4)绘制的扩增曲线。

图2是本发明实施例中进行qPCR(BAG4)绘制的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明利用实时荧光定量PCR对茶卡羊BAG4基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库的绵羊BAG4基因序列，再用Primer5.0软件进行引物设计和验证；

(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用SPSS17.0软件将拷贝数变异类型与茶卡羊生长性状进行关联分析，筛选到一个与茶卡羊生长性状相关的CNV标记；该CNV标记位于BAG4基因(GenBank AccessionNC_019483.2)31982401至31984000bp区域内；

(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的茶卡羊优势种群选育。

本发明具体包括以下步骤：

1、茶卡羊样本采集

本发明具体以297头茶卡羊作为检测对象，采集茶卡羊个体静脉血样本，采集地点为青海省海西州乌兰县茶卡镇(2018年5月采集)。

2、血样基因组DNA的提取

1)冰冻的血样在室温水浴中融化后将2mL全血转入一个无菌的2mL离心管中；

2)4℃12000r/min离心10min，弃掉液体，保留沉淀；

3)加入1.5mL的PBS缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮，冰上温和摇动15min，4℃12000r/min离心10min，弃掉液体，保留沉淀；

4)重复步骤3一次；

5)用蓝枪头将沉淀捣碎，呈絮状后在离心管中加DNA提取液500μL和蛋白酶K6μL(终浓度为60μg/mL)；

6)在恒温水浴箱中37℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；

7)加入1mL的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，4℃12000r/min离心10min；

8)将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中，加入0.5mL的饱和酚和0.5mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃12000r/min离心10min；

9)将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中，加入1mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃12000r/min离心10min；

10)将上层水相用移液器移到1.5mL离心管中，加入1mL预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min，4℃12000r/min离心10min，弃去乙醇；

11)加入70％乙醇1mL，冰上温和摇动10min，4℃12000r/min离心10min，弃乙醇(用移液枪将管底剩余酒精吸出)，重复漂洗一次；

12)室温放置30min，60℃烘箱30s，使乙醇挥发干净；

13)加入超纯水50μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

3、目标序列及内参序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的绵羊BAG4基因序列(GenBank Accession NC_019483.2)为参考序列，利用Primer5.0设计扩增茶卡羊BAG4基因对应拷贝数变异区域(目标序列)的实时荧光定量PCR引物对。内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即ANKRD1基因中的一段143bp的序列。目标序列和内参序列的扩增引物信息如表1所示(引物设计时间为2018年7月)。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

进行实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：25ng/μL模板DNA(提取自血样的基因组DNA)1μL，10pmol/L的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix6.25μL，ddH₂O4.25μL。

进行实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；(3)绘制溶解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。

通过绘制扩增曲线(图1)和熔解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝Ct_目标序列–Ct_内参序列。2^-ΔCt表示的是拷贝数。根据2*2^-ΔCt将定量结果分为三类：插入型(Gain)，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型(Loss)，2*2^-ΔCt<1.5；正常型(Normal)，2*2^-ΔCt≈2。C_t即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

5、BAG4基因CNV位点与生长性状的关联分析

生产数据：体高、体长、胸围、体重。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS17.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Yijk＝μ+Ai+CNVj+eijk

其中：Yijk为性状观察值，μ为总体均值，Ai为第i头个体的年龄，CNVj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示，参见表2。

表2.茶卡羊BAG4基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05；括号里面的值表示拷贝数类型的频率。

关联分析结果表明(见表2)：具有缺失型拷贝数变异类型的茶卡羊个体在生长性状体高上优于正常型和插入型拷贝数变异类型的茶卡羊个体。说明BAG4基因上的CNV位点(NC_019483.2的31982401至31984000bp)可以作为一个提高茶卡羊生长性状体高的候选分子遗传标记。

6、CNV标记在茶卡羊选育中的应用

以上的CNV位点(NC_019483.2的31982401至31984000bp)可作为候选分子遗传标记，以对茶卡羊进行分子标记辅助选择，从而加快茶卡羊品种改良的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tggatgaaga cacaaagacc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcaaaggaaa ccccataccc t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgggcaccac gaaattctca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tggcagaaat gtgcgaacg 19

Claims

1.一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

利用实时荧光定量PCR，以待测茶卡羊基因组DNA为模板，分别扩增BAG4基因拷贝数变异区域，以及作为内参序列的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊BAG4基因的拷贝数变异类型；所述的BAG4基因拷贝数变异区域位于BAG4基因参考基因组序列NC_019483.2的31982401至31984000bp。

2.如权利要求1所述一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔCt≤2.5。

3.如权利要求1所述一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的BAG4基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5’-TGGATGAAGACACAAAGACCA-3’

下游引物R1：5’-TCAAAGGAAACCCCATACCCT-3’；

所述的ANKRD1基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。

4.如权利要求1所述一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

5.一种如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有正常型和插入型拷贝数变异类型的个体。

7.一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增茶卡羊BAG4基因拷贝数变异区域的引物对；所述的BAG4基因拷贝数变异区域位于BAG4基因参考基因组序列NC_019483.2的31982401至31984000bp。

8.如权利要求7所述一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的BAG4基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5’-TGGATGAAGACACAAAGACCA-3’

下游引物R1：5’-TCAAAGGAAACCCCATACCCT-3’。

9.如权利要求7所述一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参序列的引物对，内参序列选自ANKDR1基因的部分片段。

10.如权利要求9所述一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的ANKRD1基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。