CN105624314A

CN105624314A - 利用pcr技术检测山羊tmem95基因微小拷贝数变异的方法及其应用

Info

Publication number: CN105624314A
Application number: CN201610149981.5A
Authority: CN
Inventors: 蓝贤勇; 张思欢; 吴贤锋; 杨青; 许晗; 陈宏�; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: CN105624314B

Abstract

本发明公开了一种利用PCR技术检测山羊TMEM？95基因微小拷贝数变异的方法及其应用，该方法以包含TMEM？95基因的中国地方山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增山羊TMEM？95基因部分序列，再对PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊TMEM？95基因非编码区58bp微小拷贝数变异；由于TMEM？95基因对生长性状、泌乳性状具有重要调控作用，故本发明提供的检测方法为TMEM？95基因的微小拷贝数变异与生产性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国山羊生产性状的标记辅助选择，利于建立遗传资源优良的山羊种群。

Description

利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法及其应用

技术领域

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及微小拷贝数变异(CNV)的检测，特别涉及一种快速、准确检测山羊跨膜蛋白95(TMEM95)基因58bp微小拷贝数变异(CNV)的方法。

背景技术

拷贝数变异(Copynumbervariation,CNV)是指由基因组发生重排而导致的与基因组参考序列相比，基因组中出现DNA片段拷贝数的增加、减少、倒位或易位。从狭义的角度来看，拷贝数变化的DNA片段长度一般大于1kb，但从广义的角度来看，拷贝数变化的DNA片段长度一般大于50bp，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。拷贝数变异(CNV)是基因组结构变异(Structuralvariation,SV)的重要组成部分，具有分布范围广、可遗传、相对稳定和高度异质性等特点。在基因组中拷贝数变异(CNV)位点的突变率远高于SNP(Singlenucleotidepolymorphism)，其变异引起的基因剂量改变可以导致表型改变。基于以上特点，拷贝数变异(CNV)可以作为一种新的可以预测生产性状的基因组DNA多态性标志。

近几年，拷贝数变异(CNV)全基因组关联分析开始出现，使从基因组结构变异的角度解析复杂性状的分子机制和遗传基础成为可能。在生物医学和动物生产实践中，拷贝数变异的检测及其应用具有重要意义。例如：研究某些重要功能基因拷贝数变异多态性，可阐明机体对疾病、毒物和应激的易感性，为临床医学、遗传病学、预防医学的发展开拓新的研究领域(Balaratnasingametal.,2015；Riggsetal.,2014；Leeetal.,2012)；研究动物基因组水平的拷贝数变异多态性，并将其与生长性状、泌乳性状、繁殖性状等生产性状进行关联分析，将有利于发现影响生产性状的重要变异，为以标记辅助选择(MAS)技术为基础的分子育种提供基础资料。

2004年，美国冷泉港实验室Sebat等利用代表性寡核苷酸微阵列ROMA(Representationaloligonucleotidemicroarrayanalysis)技术，分析了20个正常个体的基因组DNA片段的拷贝数情况，结果在76个位点上发现了221个大于100kb的拷贝数变异(CNV)(Sebatetal.2004)。瑞士洛桑大学研究小组Iafrate等使用基于细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)探针的比较基因组杂交微阵列，分析了55例个体的大片段拷贝数变异(CNV)情况，鉴定了255个重复和缺失(Iafrateetal.2004)。这两项拷贝数变异(CNV)领域的开创性研究拓展了人们对人类遗传变异的认识。

随后，大量拷贝数变异(CNV)图谱以及CNVRs(Copynumbervariationregions)被发现。由于CNVRs包含成百上千的基因，疾病位点，数量性状遗传位点等重要区域，比SNP有更多的核苷酸含量，覆盖的区域更大。因此，在对生物性状的影响上，拷贝数变异(CNV)作为一种重要的新的遗传变异形式，可能具有比SNP更重要的作用。《NatureGenetics》，《GenomeResearch》等杂志从不同的方面对拷贝数变异(CNV)的研究进行了报告，研究发现在人类基因组上，有至少12％的区域会发生DNA大片段的增多或者丢失，这充分的说明了拷贝数变异(CNV)在基因组中的重要作用。拷贝数变异(CNV)作为一种和SNP互补的重要的基因组遗传变异形式，联合使用SNP和拷贝数变异(CNV)这两种遗传标记在标记辅助育种中有着广阔的应用前景。

大量研究表明，拷贝数变异(CNV)不仅与多种疾病及发育异常有关，还会影响许多重要经济性状。因此，对全基因组的拷贝数变异(CNV)研究至关重要。目前，研究全基因组范围内拷贝数变异(CNV)的技术主要有比较基因组杂交芯片(CGH)、高密度SNP、分型芯片及基于近年来正在兴起的新一代测序技术的全基因组重测序。对于已经检测出的拷贝数变异(CNV)，根据序列特点可以采用基于PCR和杂交的技术方法对其基因型进行判定。

目前，具体检测已知拷贝数变异(CNV)的方法有以下五种。(1)Southern杂交和荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)。这是两种基于杂交技术的经典实验方法。Southern杂交操作比较烦琐、费时。FISH具有安全、快速、灵敏度高等优点，但成本高、技术要求高、通量小、时间长，对于邻位重复的拷贝数变异(CNV)不能精确定量，且对样本要求较高。(2)荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，qPCR)。qPCR技术是基于PCR技术的检测方法。该方法简单、易于操作、敏感性高、重复性好、速度快和污染少，但是不适合大样本的高通量检测。(3)短片段多重定量技术(quantitativemultiplexPCRofshortfluorescentfragment，QMPSFQ)。该方法可以同时进行多重PCR，故在检测通量上有所提高。但是对于拷贝数增加很多的情况下不可能确定拷贝数的绝对值。(4)多重扩增探针杂交技术(multiplexamplifiableprobehybridization，MAPH)。MAPH可同时快速、可靠的检测多个位点的拷贝数变异，应用范围增大；(5)PCR直接检测法。这种方法使用方便，简单、快速、准确，在动物科学领域的DNA分子标记应用中具有非常强的可操作性。即直接利用DNA样本进行PCR扩增，扩增之后琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据电泳结果即可区分不同的拷贝数个体。实验原理如下：对于某段DNA序列2个拷贝和4个拷贝的纯合型个体，由于PCR扩增产物长度相等，因此，在缓慢复性后，由同样长度单链DNA片段形成的同源双链分子长度相等，电泳结果只有一条条带。而对于某段DNA序列3个拷贝的个体(在同一个体中，基因组某段DNA序列同时存在2个拷贝和4个拷贝，因为它们分别来源于父本和木本基因组DNA)，PCR产物经加热变性后再缓慢复性时，由1个拷贝和2个拷贝的单链DNA复性形成的异源双链分子具有某些不同于同源双链分子的特征。异源双链可以形成四种不同的二级结构，导致在琼脂糖凝胶电泳的过程中，电泳迁移率、PCR产物与基质的结合能力均存在差异。因此，对于3个拷贝的杂合型个体，由于异源双链的存在，导致琼脂糖凝胶电泳产物出现两条条带、三条条带，甚至四条条带。

在这种情况下，PCR扩增后直接检测的方法就成为检测微小拷贝数变异的理想技术，在发现微小拷贝数变异区域后，设计包含所有拷贝的引物对，以DNA为模板，利用PCR技术扩增目的序列，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别不同拷贝数的个体。该方法不仅具有准确快速的特点，又克服了费用昂贵、繁琐操作的缺点。但该方法只适用于小片段DNA拷贝数的变异检测。

分子育种，即分子标记辅助育种(MolecularMark-AssistSelection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在羊育种中，人们期望通过对生产性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，加速育种进程。

跨膜蛋白95(Transmembraneprotein95，TMEM95)基因编码了一个高度保守的单次跨膜蛋白。目前，关于TMEM95基因功能的研究鲜见报道。2014年Pausch等研究发现，在弗莱维赫牛群体中，TMEM95基因的一个无义突变导致雄性生育能力下降，同时，该基因在精子顶体部位表达，因此推测，该基因可能与雄性繁殖能力密切相关(Pauschetal.,2014)。Teves等研究发现，SPAG17基因不仅与繁殖性状相关，还会影响骨骼的形成(Tevesetal.,2015)。因此，TMEM95基因可能类似于SPAG17基因，在影响繁殖性状的同时影响生长性状。

与此同时，很多育种实践发现，在不断提高牛羊等经济动物产奶产肉等性能的同时，往往会伴随着繁殖性能的下降。因此可以推测，繁殖性能与产奶、产肉等生产性状具有一定的负相关的关系。而某些基因也可能在影响繁殖性状的同时影响产奶等生产性状。

本实验室前期研究发现，在秦川牛群体中，TMEM95基因存在不同的剪接体，并且该基因在睾丸和脑中特异性表达，在睾丸中的表达量显著高于在脑中的表达量。由此推测，该基因在影响繁殖性状的同时还有可能影响激素的生成或者脑的发育(Zhangetal.,2016)。

综上所述，TMEM95基因的变异可能会对经济动物的生产性状产生重要的影响。同时，牛和羊基因组之间具有较高的相似性，且羊在我国农业经济发展中占有重要位置，因此，研究中国地方山羊TMEM95基因的遗传变异和微小拷贝数变异(CNV)遗传特征具有重要的理论和实践意义。

目前，对中国地方山羊TMEM95基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与生产性状(如体重、体高、体长、胸宽、胸围、体长指数等生长性状，乳中蛋白含量、总固形物含量、非脂乳固体含量、脂蛋白密度、乳酸度等泌乳性状，以及产单胎或多胎等繁殖性状)关联的研究更是空白。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的方法及其应用,从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的方法，包括以下步骤：以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增山羊TMEM95基因部分片段，再对PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)。

所述引物对P1为：

上游引物：5’-AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3’；

下游引物：5’-GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3’。

所述PCR的扩增反应程序为：

1)94.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94.0℃变性30s，60.0℃复性30s，72.0℃延伸30s，共40个循环；

3)经过步骤2)后，72.0℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳采用质量分数为2.5％的琼脂糖凝胶。

所述山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)为：2个拷贝表现为一条253bp条带；3个拷贝表现为253bp和311bp两条条带、或者还同时存在由于异源双链结合而形成的不同结构的第三条或者第四条条带；4个拷贝表现为一条311bp条带。

一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的试剂盒，包括用于PCR扩增山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)位点的引物对P1，所述引物对P1为：

上游引物：5’-AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3’；

下游引物：5’-GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3’。

上述利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异(CNV)的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明通过特定引物经PCR扩增特定的片段，再经过琼脂糖凝胶电泳进行分型，能够简单、快速、低成本、精确的检测山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异的多态性。由于TMEM95基因的功能可能涉及众多生产性状，本发明提供的检测方法为TMEM95基因的微小CNV与生长性状、泌乳性状等性状之间关系的建立奠定了基础，以便用于中国地方山羊生产性状的标记辅助选择(MAS)，利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。

本发明对6个山羊品种的TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)基因型进行了检测和基因频率分析，对上述拷贝数变异位点与山羊部分生产性状(如体重、体高、体长、胸宽、胸围、体长指数等生长性状，乳中蛋白含量、总固形物含量、非脂乳固体含量、脂蛋白密度、乳酸度等泌乳性状)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高山羊生长性状、泌乳性状的微小拷贝数变异(CNV)标记。

附图说明

图1为山羊TMEM95基因扩增包含目的片段不同拷贝数的PCR产物电泳结果。

图2为山羊TMEM95基因DNA单链包含目的片段1个拷贝的测序图。带下划线部分为拷贝数变异的序列：NC_022311.1。

图3为山羊TMEM95基因DNA单链包含目的片段2个拷贝的测序图。带下划线部分为拷贝数变异重复的序列：NC_022311.1。

图4为山羊TMEM95基因58bp重复序列分析图。图中，黑色方框中的序列为上、下游引物序列，阴影部分序列为拷贝数变异重复的序列。参考序列代表NCBI上公布的山羊TMEM95基因序列(NC_022311.1)；插入序列代表山羊TMEM95基因DNA单链包含目的片段2个拷贝的序列。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用PCR技术对山羊TMEM95基因非编码区chr19：26355471-26355528的58bp的拷贝数变异进行检测，并将其与生产性状(如体重、体高、体长、胸宽、胸围、体长指数等生长性状，乳中蛋白含量、总固形物含量、非脂乳固体含量、脂蛋白密度、乳酸度等泌乳性状)进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的微小拷贝数变异(CNV)标记。

(一)实验药品与试剂

1.生化试剂与生物学试剂：①TaqDNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③MarkerI(购自天根生化科技(北京)有限公司)；

2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。具体溶液与缓冲液如下：(1)样品采样所用溶液：抗凝剂ACD：柠檬酸0.48g；柠檬酸钠1.32g；葡萄糖1.47g。把它们定容于100mL水中，高压灭菌。每6mL新鲜血液中加入1mL的ACD液。这一抗凝剂优于EDTA，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-70℃长期保存。(2)血样基因组DNA分离所用溶液：①PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存。②10％SDS：10gSDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL。③0.5mol/LEDTANa2：EDTANa2186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。④1mol/LTris·Cl：121.14gTris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存。⑤5mol/LNaCl：NaCl292.2g溶于1000mL超纯水中。⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mol/LEDTANa24mL，1mol/LTris·Cl10mL，5mol/LNaCl4mL，10％SDS20mL定容至100mL。实际浓度为20mmol/LEDTANa2，pH8.0；100mmol/LTris·HCl，pH8.0；200mmol/LNaCl，2％SDS。RNase20μg/mL。⑦NaAc缓冲液：NaAc·3H₂O20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL。⑧TE缓冲液：Tris·Cl缓冲液(pH8.0)10mmol/L，EDTA缓冲液(pH8.0)0.1mmol/L，高压灭菌，4℃保存。⑨蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存。(3)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/LNaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：lmol/LTris-Cl(pH8.0)lmL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，2mol/LNaCl5mL，定容至100mL。(4)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液：①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

(二)山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异(CNV)检测的PCR引物的设计

在NCBI上检索山羊TMEM95基因的序列，并利用Primer5.0设计能够扩增包含山羊TMEM95基因58bp拷贝数变异区域的PCR引物-引物对P1(图4)，引物对P1序列如下：

上游引物：5’-AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3’(28bp)；

下游引物：5’-GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3’(21bp)。

以上述引物对P1对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊TMEM95基因(NC_022311.1序列)非编码区58bp微小拷贝数变异(CNV)区域；扩增后片段的电泳检测如图1所示，第1泳道为MarkerI(由大到小依次为600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)。2～10泳道为检测片段，N为正常基因型(Normal，2个拷贝-DD，253bp)，H为杂合基因型(Heterozygous，3个拷贝-ID)，I为插入基因型(Insert，4个拷贝-II)。对扩增的片段进行测序鉴定后，发现在NC_022311.1序列的第1434位开始存在58bp拷贝数变异，测序峰图如图2、图3所示。经过分析发现，当该位置58bp片段在基因组中为2个拷贝时，测序峰图为图2所示，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中的2、5、6、10泳道所示；当该位置58bp片段在基因组中为4个拷贝时，测序峰图为图3所示，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中的7、9泳道所示；当该位置58bp片段在基因组中为3个拷贝时，测序峰图为图2、图3所示，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中的3、4、8泳道所示。由于3个拷贝时，PCR产物可能形成四种不同的二级结构(由于二级结构的形成可能具有偏向性，因此检测时多数杂合型的检测结果为三条条带)。所以可以通过琼脂糖凝胶电泳的方法对该58bp微小拷贝数变异(CNV)进行检测，参见图4。

(三)以引物对P1进行PCR扩增待测山羊的TMEM95基因片段

1、山羊样本的采集

实验所用的动物为6个山羊品种共计2973个样本。采样时均采用随机采样方式采取育种场个体的血样或耳组织样。采取血样时，利用ACD抗凝，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。采个体耳组织样品后，将样品于70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。6个山羊品种的样品信息如下：(1)西农萨能奶山羊(XNSN)血样共383份，采用群体随机采样方式在陕西省千阳县萨能奶山羊保种场于2001年7月至2001年9月收集；(2)关中奶山羊(GZMG)耳组织样共235份，采用群体随机采样方式在陕西三原奶山羊场于2010年11月9日收集；(3)内蒙古绒山羊(IMCG)耳组织样共1740份，采用群体随机采样方式在内蒙古自治区鄂尔多斯市鄂托克旗内蒙古白绒山羊种羊场经三次采样收集，第一次收集399份样品(2006年4月25日～5月3日期间)，第二次收集395份样品(2006年10月20日～11月5日期间)，第三次收集946份样品(2014年9月)；(4)陕北绒山羊(SBCG)耳组织样品共212份，采用群体随机采样方式在陕西省榆林市衡山县陕北白绒山羊种羊场，采集时间为2006年11月20日至2006年12月5日；(5)新疆绒山羊(XJCG)耳组织样品共119份，采用群体随机采样方式在新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市周边地区于2007年4月10日收集；(6)海南黑山羊(HNBG)耳组织样共284份，采用群体随机采样方式在海南省詹州海南黑山羊育种场于2009年2月2日-2010年4月25日收集。

表1山羊样本的采集

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加3μL(20mg/mL)蛋白酶K至上述混合液中并混匀，55℃过夜孵育至澄清；尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀后继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24：1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE缓冲液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3、组织样品DNA的提取与分离

1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)加入600μL组织DNA提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织DNA提取液中。

3)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入与上清等体积的酚和氯仿(酚：氯仿＝1：1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇(氯仿：异戊醇＝24：1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入上清液2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。

7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

8)再一次向离心管中加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

4、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将制琼脂糖凝胶的胶盒洗干净，用纸擦干，将洗干净的制胶用的底板放入胶盒中，插上梳子。

2)称取0.24g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE30mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB。轻微摇动，防止出现气泡。

3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液倒入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。

4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中。

5)向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。

6)取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后对应)，并将DNAMarker加在一边。

7)80V电压电泳2h。

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。

5、DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL；55℃保温10h左右。

2)与1)溶液等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次。

3)12000r/min离心5min分相，吸上层水相至另一离心管中。

4)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

5)倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

6、分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。其中，DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

7、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×TaqPCRSuperMix(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)6.25μL；上游引物0.25μL；下游引物0.25μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL基因组DNA)1.0μL；去离子水4.75μL；共12.5μL体积的PCR扩增体系。

8.PCR反应的程序

94.0℃，预变性5min；94.0℃，变性30s；60.0℃复性30s；72.0℃延伸30s，40个循环之后72.0℃延伸10min，4.0℃保存扩增产物。

9.琼脂糖凝胶电泳检测

1)琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作浓度为2.5％琼脂糖凝胶，120V电压电泳25～30min，EB染色；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Bio-Rad凝胶成像系统成像；3)根据图像判断效果。

2)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析不同拷贝数多态性；

用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统照相分析，判断拷贝数变异的多态性：由于山羊为2倍体，所以山羊基因组的TMEM95基因的非编码区(第1434bp位开始的)58bp微小拷贝数变异(CNV)琼脂糖凝胶电泳结果为：2个拷贝表现为253bp，一条条带；3个拷贝表现为253bp和311bp两条条带，或者同时表现三条条带或者四条条带；4个拷贝表现为311bp，一条条带。

(四)山羊TMEM95基因拷贝数变异位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

因该微小拷贝数变异共分为三种基因型，与SNP数据结果相似，因此，可以利用分析SNP数据结果的方法对该拷贝数变异结果进行数据统计分析。

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_II＝N_II/N，其中P_II代表某一位点的II基因型频率；N_II表示群体中具有II基因型的个体数；N为检测群体的总数量。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_I＝(2N_II+N_Ia1+N_Ia2+N_Ia3+N_Ia4+……+N_Ian)/2N，式中，P_I表示等位基因I频率，N_II表示群体中具有II基因型的个体数量，N_Iai表示群体中具有Iai基因型个体数量，a1－an为等位基因I的n个互不相同的复等位基因。

在不同山羊品种TMEM95基因的58bp拷贝数变异(CNV)位点中的等位基因型频率及等位基因频率如表2所示。XNSN、GZMG、IMCG、SBCG、XJCG、HNBG的等位基因“I”的频率分别为0.4558，0.356、0.7968、0.3808、0.4175，0.7665，相应的等位基因“D”的频率为，0.5442、0.6433、0.2032、0.6192、0.5825、0.2335。因此，不同品种最小等位基因频率(MAF)等位基因“I”或“D”的频率均大于1％，故为稳定存在拷贝数变异(CNV)类型。

表2山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异基因频率分布表

(五)山羊TMEM95基因微小拷贝数变异基因效应的关联分析

基因型数据：2个拷贝-DD、3个拷贝-ID、4个拷贝-II三种基因型

生产数据：西农萨能奶山羊生长性状；关中奶山羊生长性状，泌乳性状；内蒙古绒山羊生长性状、繁殖性状；海南黑山羊生长性状等数据

关联分析模型：利用SPSS(20.0)软件来分析品种，环境与基因位点等因素与生产性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响生产性状的指标的因素的不同，考虑到年龄，环境的效应以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝u+E+Age+G+E，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；E：环境效应；Age：年龄效应；G：标记基因型效应；E：随机误差。

结果表明：山羊TMEM95基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对山羊某些生产性状(如生长性状，泌乳性状等)均有显著影响。

由表3可以看出，在对2973份山羊样品，共计6个品种的研究中，58bp微小拷贝数变异(CNV)对很多生产性状均有显著影响(P<0.05)。对于生长性状，在西农萨能奶山羊、关中奶山羊、内蒙古绒山羊以及海南黑山羊群体中，DD型2个拷贝的个体显著优于II型4个拷贝的个体，生长性状有随着拷贝数增加而下降的趋势；对于泌乳性状，在关中奶山羊群体中，DD型2个拷贝的个体显著优于II型4个拷贝的个体，与生长性状一致，泌乳性状随着拷贝数的增加也有下降的趋势。具体数据如表3所示。

因此，山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异(CNV)是我国山羊生产性状筛选的拷贝数变异(CNV)遗传标记。

表3山羊TMEM95基因58bp微小拷贝数变异对山羊生产性状的影响

注：生产性状不同的上标(a,b)表示有显著性差异。

Claims

1.一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增山羊TMEM95基因部分片段，再对PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异；

所述引物对P1为：

上游引物：5’-AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3’；

下游引物：5’-GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3’。

2.根据权利要求1所述一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法，其特征在于：所述PCR的扩增反应程序为：

1)94.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94.0℃变性30s，60.0℃复性30s，72.0℃延伸30s，共40个循环；

3)经过步骤2)后，72.0℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用质量分数为2.5％的琼脂糖凝胶。

4.根据权利要求1所述一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法，其特征在于：所述山羊TMEM95基因非编码区58bp微小拷贝数变异为：2个拷贝表现为一条253bp条带；3个拷贝表现为253bp和311bp两条条带、或者还同时存在由于异源双链结合而形成的不同结构的第三条或者第四条条带；4个拷贝表现为一条311bp条带。

5.一种利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：包括用于PCR扩增山羊TMEM95基因微小拷贝数变异位点的引物对P1，所述引物对P1为：

上游引物：5’-AAGCTCGGATCCTGCTCCTCTTTGTGTG-3’；

下游引物：5’-GGCTAGGCTCTGTCCTCGTTT-3’。

6.一种如权利要求1所述利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。