CN101899500A - 一种黄牛klf7基因的单核苷酸多态性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛KLF7基因单核苷酸多态性的方法，以包含KLF7基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3等摩尔比的混合物为引物，PCR扩增黄牛KLF7基因；用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛KLF7基因第41401、42025、42075位的单核苷酸多态性。本发明对KLF7基因的SNPs进行了基因分型和基因频率分析，以及与南阳牛不同生长阶段的生长性状之间进行了性状关联分析；结果表明：KLF7基因尤其是P2检测SNP位点可用作黄牛生长性状早期选择(6月龄和12月龄)的分子标记。

Description

一种黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛KLF7基因外显子2及其侧翼区的单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

脂肪组织在维持能量稳态具有重要的作用，脂肪代谢对于维持正常的生理活动具有重要的作用。脂肪组织分泌的脂肪激酶，在许多生理过程如采食、葡萄糖代谢、繁殖、胰岛素易感性、和血管发生等方面发挥重要功能；而这些都与动物的生长密切相关。

Krupple-like factor(KLF)转录因子家族在C端具有的三个连续的C2H2锌指能特异结合在富含GC的靶基因的启动子上，从而活化或抑制靶基因的表达，具有广泛的生物学作用，包括细胞增殖，分化和发育，并参与脂肪代谢。

KLF7属于KLF家族，广泛表达于脂肪细胞和各种人类组织包括胰脏、骨骼肌和肝脏。在脂肪细胞中过表达KLF7会抑制脂肪形成，尤其抑制adiponectin基因在脂肪细胞中的表达，但绿茶中的多酚-儿茶素能明显增强adiponectin基因的表达和增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取量，并伴随KLF7的表达下调。吗啡被发现能在转录和转录后水平上调KLF7的表达。人类KLF7基因位于染色体2q32，被报道是一个与糖尿病或代谢相关的位点，而且KLF7能调节脂肪细胞、胰脏β细胞和骨骼肌细胞的功能，另外它被确定含有一个可以判定二型糖尿病易感性的等位基因。最近，KLF7基因的A等位基因(rs2302870)在一个日本人群体中被确定与二型糖尿病相关，它的另一个A等位基因(rs7568369)被确定与肥胖有关。以上研究提示KLF7在能量代谢的调控中具有重要作用。

截至2010年1月，国内外尚无黄牛KLF7基因遗传变异及其与经济性状关系的研究报道。由于目前中国黄牛KLF7基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与生长发育等性状关联，以及将其应用于分子遗传标记和分子育种的研究还处于空白状态。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性检测方法，该方法能够检测黄牛KLF7基因外显子2及其侧翼区的单核苷酸多态性，将其多态性分析与性质关联后用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种快速检测黄牛KLF7基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

以包含KLF7基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3等摩尔比的混合物为引物，PCR扩增黄牛KLF7基因；用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛KLF7基因第41401、42025、42075位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：tgcttctgat ggctgtttct c；

下游引物R1：aggaaacagt ccaagtcctc atc；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：acggcacagt gacgttgaa；

下游引物R2：gaacagagag aagcccttcc cccctc；

所述的引物对P3为：

上游引物F3：ctgttccgag aagtggcatc catgccatc；

下游引物R3：actacaccaa ggctggcact。

所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57.0℃退火35s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性为：

第41401位的多态性为：C₁C₁基因型表现为104和24bp条带，C₁T₁基因型表现为128、104和24bp条带，T₁T₁基因型表现为128bp条带；

第42025位的多态性为：T₂T₂基因型表现为337bp条带，T₂C₂基因型表现为337、310和27bp条带，C₂C₂基因型表现为310和27bp条带；

第42075位的多态性为：A₃A₃基因型表现为182bp条带，A₃G₃基因型表现为182、154和28bp条带，G₃G₃基因型表现为154和28bp条带。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与黄牛生长性状相关的功能基因KLF7外显子2及其侧翼区的3个位点的单核苷酸多态性，这3个单核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

针对上述位点的SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对KLF7基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与南阳牛不同生长阶段的生长性状之间进行了性状关联分析；结果表明：KLF7基因尤其是P2检测SNP位点可用作黄牛生长性状早期选择(6月龄和12月龄)的分子标记。

本发明提供的检测方法为KLF7基因的SNP与黄牛的生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1黄牛KLF7基因第二外显子及其侧翼区扩增电泳图；

图2黄牛KLF7基因P1检测SNP位点扩增序列图；

图3黄牛KLF7基因P1检测SNP位点酶切结果电泳图；

图4黄牛KLF7基因P2检测SNP位点扩增序列图；

图5黄牛KLF7基因P2检测SNP位点酶切结果电泳图；

图6黄牛KLF7基因P3检测SNP位点扩增序列图；

图7黄牛KLF7基因P3检测SNP位点酶切结果电泳图；

图8黄牛KLF7基因P1、P2和P3检测SNP位点酶切结果电泳图；

图9黄牛KLF7基因P1、P2和P3检测SNP位点测序图。

具体实施方式

以下通过对黄牛样本采集及基因组DNA提取、检测、纯化与浓度分析、黄牛KLF7基因外显子2及其侧翼区的PCR扩增、黄牛KLF7基因外显子2及其侧翼区DNA片段的TaqI CRS-PCR-RFLP分析实施例来进一步说明本发明技术及其效果。所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛KLF7基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、黄牛血样的采集及处理

取黄牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了4个黄牛品种共计1002个无血缘关系的母牛血样，具体为：

(1)南阳牛血样：分别从251头6～24月龄的纯种南阳牛采集，采自河南省南阳市；

(2)秦川牛血样：分别从228头4月龄的纯种秦川牛采集，采自陕西大荔县；

(3)郏县红牛血样：分别从439头成年郏县红牛采集，采自河南省郏县；

(4)中国荷斯坦奶牛血样：分别从84头成年中国荷斯坦奶牛采集，采自陕西草滩农场奶牛场。

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌，调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

(11)5℃保温10h左右。

(12)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次。

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

(15)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(μg/mL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从秦川牛品种100个个体、浓度为50ng/μL DNA的样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建南阳牛、郏县红牛和中国荷斯坦奶牛DNA池。

4、PCR扩增引物设计

根据GenBank公开的牛基因组序列为参考，具体根据No.NC_007300序列设计引物扩增KLF7基因的外显子2及其侧翼区的序列，其引物对序列P如下：

上游引物F1：tgcttctgat ggctgtttct c    21；

下游引物R3：actacaccaa ggctggcact      20；

该对引物能够扩增KLF7基因第41297bp到第42227bp的931bp的基因片段。

5、PCR克隆黄牛KLF7基因

分别以4个黄牛品种的DNA池为模版，以引物对P为引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。

表1PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		10×PCR缓冲液(MBI)	2.50
MgCl2(25mmol/L)	1.50
		dNTPs(2.5mmol/L)	2.50
上游引物(10pmol/L)	0.25
		下游引物(10pmol/L)	0.25
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	2.00

DNA模板(50ng/μL)	1.00
		灭菌超纯水(H2O)	15.00
总体积	25.00

表2  PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，可以清楚看到931bp的条带，说明目的基因克隆成功；

然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上四个黄牛品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序；黄牛KLF7基因的外显子2及其侧翼区931bp长度的片段的测序结果如SEQ ID NO.1所示，序列当中第1位的碱基相当于KLF7基因第41297位。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰是发生了单核苷酸突变；位于黄牛的KLF7基因第41401、42025、42075位(分别相当于SEQ IDNO.1第105、729、779位)出现单核苷酸突变，其多态性分别为C/T、T/C、A/G；即筛查到黄牛KLF7基因的3个SNP多态性。

b、黄牛KLF7基因的外显子2及其侧翼区单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测

(1)上述的3个SNP多态性的序列变化为：

当第41401位点发生C＞T突变时，即C突变为T，使原来的序列TCGG也相应的突变成TTGG；

当第42025位点发生T＞C突变时，即T突变为C，使原来的序列TTGT也相应的突变成TCGT；

当第42075位点发生A＞G突变时，即A突变为G，使原来的序列ACAA也相应的突变成ACGA；

(2)本发明对于上述3处SNP的检测，通过PCR-RFLP检测方法实现SNP的检测，通过定点错配使得在3处SNP位点周围的序列形成特定的序列TCGA，这样就能够通过限制性内切酶TaqI进行识别，具体为：

利用PCR克隆定点错配技术，在PCR扩增KLF7基因序列时，使得第41403位由G定点错配为A，使原来的序列TCGG克隆为TCGA，成为限制性内切酶TaqI能够识别的序列，当第41401位点发生C＞T突变时，克隆序列为TTGA，此时限制性内切酶TaqI不能识别该序列；如图2所示，左向箭头、右向箭头分别表示上游引物、下游引物，通过下游引物的错配实现包含SNP位点的特定序列的克隆，方框显示的tCgA为TaqI识别序列；

本发明通过设计的引物对P1来实现41403位的定点错配，引物对P1为：

上游引物F1：tgcttctgat ggctgtttct c    21；

下游引物R1：aggaaacagt ccaagtcctc atc  23；

以引物对P1为引物，以黄牛基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物扩增体系和反应条件分别如同表1和表2所述；将PCR扩增的目的片段用TaqI消化，将酶切后的扩增片段进行3.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压为100V，时间为0.5～1h；电泳完成后EB染色，待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Gel Doc XR+凝胶成像系统成像，结果如图3所示：泳道C₁C₁表示未突变的纯合子，错配克隆后的两条染色体都能够能被酶切识别，而切除的24bp片段太小，电泳没有显示，所以表现为104bp的条带；泳道C₁T₁表示发生突变的杂合子，即错配克隆后的其中的一条染色体发生了突变，不能够被酶切识别，同样由于24bp片段太小，所以表现为128bp、104bp的条带；泳道T₁T₁表示发生突变的纯合子，错配克隆后的两条染色体都不能够能被酶切识别，所以表现为128bp的条带。

(3)利用PCR克隆定点错配技术，在PCR扩增KLF7基因序列时，使得第42027位由T定点错配为A，使原来的序列TTGT克隆为TTGA，此时限制性内切酶TaqI不能识别该序列，而当42025位点发生T＞C突变时，克隆序列为TCGA，限制性内切酶TaqI就能识别发生突变的序列；如图4所示，左向箭头、右向箭头分别表示上游引物、下游引物，通过下游引物的错配实现包含SNP位点的特定序列的克隆，方框显示的tTgA存在tCgA的多态性，当发生突变时，成为TaqI识别的序列；

本发明通过设计的引物对P2来实现42027位的定点错配，引物对P2为：

上游引物F2：acggcacagt gacgttgaa         19；

下游引物R2：gaacagagag aagcccttcc cccctc 26；

以引物对P2为引物，以黄牛基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物扩增体系和反应条件分别如同表1和表2所述；将PCR扩增的目的片段用TaqI消化，将酶切后的扩增片段进行3.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压为100V，时间为0.5～1h；电泳完成后EB染色，待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Gel Doc XR+凝胶成像系统成像，结果如图5所示：

泳道C₂C₂表示突变的纯合子，错配克隆后的两条染色体都不能够能被酶切识别，而切除的27bp片段太小，电泳没有显示，所以表现为310bp的条带；泳道C₂T₂表示发生突变的杂合子，即错配克隆后的其中的一条染色体发生了突变，不能够被酶切识别，同样由于27bp片段太小，所以表现为337bp、310bp的条带；泳道T₂T₂表示未发生突变的纯合子，错配克隆后的两条染色体都不能够能被酶切识别，所以表现为337bp的条带。

(4)利用PCR克隆定点错配技术，在PCR扩增KLF7基因序列时，使得第42073位由A定点错配为T，使原来的序列ACAA克隆为TCAA，此时限制性内切酶TaqI不能识别该序列，当第42075位点发生A＞G突变时，克隆序列为TCGA，限制性内切酶TaqI就能识别发生突变的序列；如图6所示，左向箭头、右向箭头分别表示上游引物、下游引物，通过上游引物的错配实现包含SNP位点的特定序列的克隆，方框显示的TcAa为错配的序列，存在TcGa的多态性，当发生突变时，成为TaqI识别的序列；

本发明通过设计的引物对P3来实现42027位的定点错配，引物对P3为：

上游引物F3：ctgttccgag aagtggcatc catgccatc 29；

下游引物R3：actacaccaa ggctggcact           20。

以引物对P3为引物，以黄牛基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物扩增体系和反应条件分别如同表1和表2所述；将PCR扩增的目的片段用TaqI消化，将酶切后的扩增片段进行3.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压为100V，时间为0.5～1h；电泳完成后EB染色，待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Gel Doc XR+凝胶成像系统成像，结果如图7所示：

泳道G₃G₃表示突变的纯合子，错配克隆后的两条染色体都不能够能被酶切识别，而切除的28bp片段太小，电泳没有显示，所以表现为154bp的条带。泳道A₃G₃表示发生突变的杂合子，即错配克隆后的其中的一条染色体发生了突变，不能够被酶切识别，同样由于28bp片段太小，所以表现为182bp、154bp的条带；泳道A₃A₃表示未发生突变的纯合子，错配克隆后的两条染色体都不能够能被酶切识别，所以表现为182bp的条带。

(5)虽然931bp的克隆片段当中在SEQ ID NO.1的第151-154bp还存在一个TaqI识别序列(TCGA)，但经过对照试验(同时检测3个SNPs与分别检测每个SNP之间对比分析)，发现对照组与试验组在SNP位点酶切后的电泳检测片段大小结果完全一致。这样就能够通过限制性内切酶TaqI同时对3个SNPs进行识别，提高检测效率；具体为：

以引物对P1、P2、P3等比例的混合物为引物，以黄牛基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物扩增体系和反应条件分别如同表1和表2所述；将PCR扩增的目的片段用TaqI消化，将酶切后的扩增片段进行3.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压为100V，时间为0.5～1h；电泳完成后EB染色，待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Gel Doc XR+凝胶成像系统成像，显示结果如图8所示，根据电泳条带的分布判定其基因型如表3所示：

表3  根据电泳结果判定基因型

其中切除的24、27和28bp片段太小，电泳没有显示，所以泳道I表现为P1检测SNP位点154bp(C₁C₁)的条带，P2检测SNP位点337bp(T₂T₂)的条带，P3检测SNP位点337bp(A₃A₃)的条带；泳道II表现为P1检测SNP位点128和104bp(C₁T₁)的条带，P2检测SNP位点337和310bp(T₂C₂)的条带，P3检测SNP位点182和154bp(A₃G₃)的条带；泳道III表现为P1检测SNP位点128bp(T₁T₁)的条带，P2检测SNP位点310bp(C₂C₂)的条带，P3检测SNP位点154bp(G₃G₃)的条带；

根据条带的数目和条带的大小，图8所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将3个SNP位点的三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(6)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，进行SNP位置分析；结果如图9所示，在SNP位点处存在多态性，尤其是发生突变的杂合子更为明显，C₁T₁基因型P1检测SNP位点处、T₂C₂基因型P2检测SNP处、A₃G₃基因型P3检测SNP位点处均为双峰。

c、黄牛KLF7基因的SNP作为分子标记在不同黄牛群体中的应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对秦川牛228份DNA样品、南阳牛251份DNA样品、郏县红牛439份DNA样品和中国荷斯坦奶牛84份DNA样品分别进行SNP多态性的鉴定，统计其SNP位点的基因型分布及其等位基因频率，并对南阳牛的SNPs与生长性状的进行关联分析。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；4个牛群体不同多态位点的基因型分布、等位基因频率的统计分析结果如表4所示。

3、群体平衡性检验

某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性检测采用皮尔逊χ²统计量，其公式为：

${\mathrm{\χ}}^2=\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(f_i-n{p}_i)}^2}{{\mathrm{np}}_i},..........$

其中，m为某一遗传位点基因型应有个数；i为基因型序号；f_i代表第i个基因型的实际个体数量；n为样本数量；p_i代表第i个基因型的理论频率。

等位基因在不同黄牛品种KLF7基因SNPs的基因型分布、等位基因频率和连锁不平衡分析如表4所示，其中，除中国荷斯坦牛在P1检测SNP位点达到纯合外，其它SNP位点的等位基因频率均大于1％，满足SNP的要求。

表4  四个牛群体不同多态位点的基因型分布、等位基因频率利哈代温伯格平衡检验

由表4可以看出，在P1检测SNP位点只有中国荷斯坦奶牛处于哈代温伯格不平衡状态，且只有C等位基因，说明中国荷斯坦奶牛在该位点已经达到纯合；在P2和P3位点，4个牛群体均没有偏离哈代温伯格平衡状态。这些结果表明也许由于长期对产奶性状的选择，中国荷斯坦奶牛在一些位点(如P1位点)已经达到纯合状态，而中国地方牛品种(如秦川牛、南阳牛和郏县红牛)由于选育的程度低，杂合程度还比较高，也进一步说明中国地方牛品种具有巨大的选种潜力。

4、南阳牛基因效应的关联分析

生产数据：南阳牛在不同生长阶段(6、12、18和24月龄)的生长性状：初生重、体重、日增重、体高、体长、胸围和坐骨端宽

关联分析样本：有完整生长性状记录的南阳牛251个。

关联分析模型：

利用SPSS(13.0)软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。

在数据处理中，根据影响初生重、成年体重等生长发育指标的因素不同，考虑到场效应(Farm)、品种效应(Breed)、种公畜效应(S)、种公畜内母畜间效应(SD)、年龄(Age)和性别效应(Sex)、基因型效应(Genotype)及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：

y_ijklmnpq＝μ+Farm_i+Breed_j+S_p+SD_q+Age_k+Sex_l+Genotype_m+X_n+e_ijklmnpq

其中：y_ijklmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farm_i：场别效应；Breed_j：品种效应；S_p：种公畜效应；SD_q：种公畜内母畜间效应；Age_k：年龄效应；Sex_l：性别效应；Genotype_m：标记基因型效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应，如：Farm×Breed，Farm×Age，Farm×Sex，Farm×Genotype，Breed×Age，Breed×Sex，Breed×Genotype，Age×Sex，Age×Genotype，Sex×Genotype，Breed×Age×Genogype等；e_ijklmnpq：随机误差；运用SPSS(13.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生产性状指标进行差异显著性检验。分析结果如表5所示：

表5  KLF7基因3个位点基因型与南阳牛生长性状的相关分析

注：BW＝体重(kg)；ADG＝日增重(kg)；BL＝体长(cm)；HG＝胸围(cm)；HW＝坐骨端宽(cm)。同一行的肩标代表显著水平P＜0.01(A，B)。

统计结果显示，KLF7基因与南阳牛早期生长性状(6月龄和12月龄)显著相关。特别是在6月龄，携带基因型T₂T₂的牛比基因型T₂C₂的牛具有更大的日增重(P＝0.009)和胸围(P＝0.009)。在12月龄，基因型C₂C₂的牛比基因型T₂C₂的牛具有更大的体重(P＝0.008)、体长(P＝0.001)和胸围(P＝0.003)；基因型A₃A₃的牛比基因型A₃G₃的牛具有更大的体长(P＝0.006)。其它生长性状数据与基因型间无显著相关。这表明所检测的KLF7基因SNPs中，杂合子(T₂C₂和A₃G₃)的生长性状较纯合子(T₂T₂、C₂C₂和A₃A₃)差，P2和P3尤其是P2检测SNP位点可用作黄牛生长性状早期选择(6月龄和12月龄)的分子标记。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性检测方法

<210>1

<211>931

<212>DNA

<213>黄牛(Bos taurus，cattle)

<220>

<221>y

<222>(105，729)

<220>

<221>r

<222>(779)

<400>1

tgcttctgat ggctgtttct ctccctccct ccttgccctc tgcagacatg ccttgaattg     60

gaacgctacc tgcagacgga gcccaggagg atctcggaga ccttyggtga ggacttggac    120

tgtttcctcc gtgcttctcc tcccccgtgc atcgaggaaa gcttccggcg cttagacccc    180

ctgctgctcc ccgtggaagc gaccatctgc gagaagagct cggccgtgga cattctgctc    240

tctcgggaca agttgctatc tgagacctgc ctcagcctcc agccaaccag ctcttctcta    300

gacagctaca cagccgtcaa ccaggcccag ctcaacgcag tgacctcatt aacgccccca    360

tcgtcccctg agctcagccg ccatctggtg aaaacctcac agactctctc agccgtggac    420

ggcacagtga cgttgaaact ggtggccaag aaggctgcgc tcggctcagt caaggtggga    480

ggggtggcaa cagcagcggc agccgtggcg gcagctggga cagttaagag tggacacagc    540

gacagtgagc aaggaggggt aggggctgag gcgtgccccg aaaacaagaa gagggttcat    600

cgctgtcagt ttaacgggtg ccggaaagtt tatacaaaaa gctcccactt aaaggcccac    660

cagaggactc acacaggtag tggtacaagt tggccgcacg tggtttcttc tttttcgtcc    720

tttagcctyg tggggggaag ggcttctctc tgttccgaga agtggcatcc atgccaacra    780

ggaggtatag agaggcaggc aggcctggga gggaagccga gtgactcacc cattaacctt    840

aggatctcca ggtgtcctgg gcaccagaca tgggtttgtc actcgctggc ttggagattc    900

tttcagaggg cagtgccagc cttggtgtag t                                   931

Claims (4)

1.一种快速检测黄牛KLF7基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含KLF7基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3等摩尔比的混合物为引物，PCR扩增黄牛KLF7基因；用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛KLF7基因第41401、42025、42075位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：tgcttctgat ggctgtttct c；

下游引物R1：aggaaacagt ccaagtcctc atc；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：acggcacagt gacgttgaa；

下游引物R2：gaacagagag aagcccttcc cccctc；

所述的引物对P3为：

上游引物F3：ctgttccgag aagtggcatc catgccatc；

下游引物R3：actacaccaa ggctggcact。

2.如权利要求1所述的一种黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57.0℃退火35s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的一种黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛KLF7基因的单核苷酸多态性为：

第41401位的多态性为：C₁C₁基因型表现为104和24bp条带，C₁T₁基因型表现为128、104和24bp条带，T₁T₁基因型表现为128bp条带；

第42025位的多态性为：T₂T₂基因型表现为337bp条带，T₂C₂基因型表现为337、310和27bp条带，C₂C₂基因型表现为310和27bp条带；

第42075位的多态性为：A₃A₃基因型表现为182bp条带，A₃G₃基因型表现为182、154和28bp条带，G₃G₃基因型表现为154和28bp条带。

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