CN112662673B - 一种人klf7基因启动子及其构建方法与应用 - Google Patents

一种人klf7基因启动子及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人KLF7基因启动子及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。所述人KLF7基因启动子核苷酸序列选自如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：18所示任一条序列；以人体精液中提取DNA作为模板，利用引物进行PCR扩增和限制性酶切的方法获取了18种人KLF7启动子，通过试验验证，发现18种启动子在鸡前脂肪细胞中都具有启动子活性，这为揭示多种人KLF7转录剪接体表达的调控机制和开发靶向KLF7表达的药物具有重要意义，并且为研究人类多种与KLF7基因调控的疾病治疗奠定基础。

Description

一种人KLF7基因启动子及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种人KLF7基因启动子及其构建方法与应用。
背景技术
Krüppel样因子(Kruppel-like factors，KLFs)是一类存在于动物体内的转录因子，它们参与细胞增殖、分化和凋亡等多个生命过程的调控。目前，人体内共发现了17种KLF因子，它们的蛋白质结构特征是羧基端(carboxyl terminus，C端)具有三个典型的C2H2锌指结构作为DNA结合结构域，氨基端(amino terminus，N端)序列作为转录调控结构域在家族成员间保守性差。1998年，Matsumoto等通过简并PCR技术从人血管内皮细胞中克隆得到一个之前从未报道过的KLF因子，根据其广泛表达于成人多种组织的特性，将其命名为普遍存在的Krüppel样因子(Ubiquitous KLF，UKLF)。根据系统命名法，UKLF又被命名为KLF7。
人KLF7(human KLF7，hKLF7)基因位于2号染色体2q33.3区域的反义链，数量遗传学报道显示人2q33.3与早发性关节炎(early-onset osteoarthritis，FOA)和早发性肥胖(肥胖反弹的年龄)相关。KLF7单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)研究表明，KLF7是人类肥胖和2型糖尿病发生的相关基因。日本人群体研究表明，hKLF7第二内含子的一个SNP(rs2302870，chr2:207953406A/C)与2型糖尿病(type2diabetes)的发生相关。丹麦人群体研究显示rs2302870位点与2型糖尿病和肥胖没有显著相关，但是位于hKLF75’UTR的另一个SNP(rs7568369，chr2:208031315C/A)与肥胖相关。
采用SNP基因芯片与DNA池相结合(SNP Microarrays and Pooling，SNP-MAP)的研究显示位于人KLF7和cAMP反应元件结合蛋白1(cAMP responsive element bindingprotein 1，CREB1)之间的一个SNP位点(rs991684)与人轻度智力障碍(Mild mentalimpairment，MMI)相关，该位点可能与KLF7和(或)CREB1处于连锁不平衡状态。一个瘢痕疙瘩家系5个个体(4例瘢痕疙瘩患者，1例健康人)的全基因组重测序结果显示，KLF7基因拷贝数变异(copy number variation,CNV)可能与瘢痕疙瘩的形成有关。
转录因子KLF7是一个核蛋白，具有核定位序列(Nuclear localizationsequence，NLS)，主要定位于细胞核中。NCBI Gene数据库检索显示，hKLF7至少能够转录5种不同转录本，编码4种不同的蛋白质和1种长链非编码RNA。
目前被广泛研究的是编码最长链蛋白质的KLF7转录本，该转录本翻译的蛋白在脊椎动物间高度保守，各个结构域在高等动物(哺乳动物和鸟类)间的序列相似性大于85％。人编码最长KLF7蛋白质的转录本，编码302个氨基酸(amino acid，aa)，N端为转录调控域，C端是由3个高度保守的C2H2锌指结构组成的DNA结合结构域。KLF7蛋白质表达水平受到N端序列调控，缺失N端1-76aa的序列明显提高KLF7的蛋白质表达水平。另外，多种药物在发挥作用的同时调控KLF7的表达。例如：吗啡可以提高人淋巴细胞中的KLF7转录和翻译水平，并且这种促进作用是纳洛酮可逆的(naloxone-reversible)，提示了KLF7在吗啡介导的生理反应中具有重要作用。绿茶中的多酚-儿茶素[(-)-catechin]在抑制KLF7表达的同时，能明显促进3T3-L1脂肪细胞脂联素的表达和分泌水平以及对葡萄糖的摄取能力，调控KLF7的表达水平有助改善脂肪细胞的内分泌功能和胰岛素敏感性。
KLF7表达量增加是小儿急性淋巴细胞白血病(pediatric acute lymphoblasticleukemia)预后不良的独立预测因子。虽然动物水平研究显示，KLF7-/-小鼠和KLF7+/+小鼠胚肝中HSPCs的活性相似，并且连续移植实验显示，KLF7-/-细胞的长期多谱系植入能力(long-term multilineage engraftment)和自我更新能力与KLF7+/+细胞相比没有明显差别。但是，体外研究显示过表达KLF7抑制髓系祖细胞生长，并且造成短期和长期再植活性的丢失；过表达KLF7抑制从造血干细胞到普通淋巴系祖细胞的多谱系生长，但不影响T细胞生长相反增强早期胸腺细胞的存活。这些结果提示，虽然KLF7不是正常的造血干细胞和祖细胞发挥功能必需的，但是增加KLF7表达能抑制骨髓细胞的增殖并促进早期胸腺细胞存活。此外，RNA表达分析显示，KLF7抑制髓系祖细胞生长不通过调控Cdkn1a(p21Cip1/Waf1)表达实现，缺失Cdkn1a不能拯救再植缺陷。
综上所述，KLF7是多种人类疾病发生的调控基因，揭示KLF7的表达调控机制对于治疗人类多种疾病具有重要意义。但是目前还没针对多种人KLF7多种转录本表达的启动子报道，确认人KLF7基因启动子，对于揭示多种人KLF7转录剪接体表达的调控机制和开发靶向KLF7表达的药物具有应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种人KLF7基因启动子及其构建方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，可用于检测多种人KLF7基因转录本剪接体表达调控机制。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种人KLF7基因启动子，所述人KLF7基因启动子核苷酸序列选自如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示任一条序列。
进一步地，所述人KLF7基因启动子在真核细胞中具有启动子活性。
本发明还提供一种引物组，所述引物组包含上游引物如SEQ ID NO：21-SEQ IDNO：31所示，下游引物如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：32所示；
利用如下表所示的引物组合，经PCR扩增获得所述的人KLF7基因启动子,
Figure GDA0003585296070000031
本发明还提供一种重组载体，包含所述的人KLF7基因启动子。
本发明还提供一种重组菌，包含所述的重组载体。
本发明还提供一种所述的人KLF7基因启动子的构建方法，包括利用所述的引物组PCR扩增获取人KLF7基因启动子核苷酸序列的步骤。
本发明还提供一种试剂盒，包括所述的引物组。
本发明还提供一种所述的KLF7基因启动子的应用，应用于启动萤火虫荧光素酶在真核细胞中表达。
优选的是，所述真核细胞来源于人或者鸡细胞。
进一步地，所述鸡细胞为鸡前脂肪细胞。
本发明还提供一种所述的KLF7基因启动子的应用，应用于制备靶向KLF7基因表达的药物中。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的人KLF7基因启动子，是以人体精液中提取DNA作为模板，利用引物进行PCR扩增获取了16种人KLF7启动子序列，分别命名为A1-A7和B1-B9，利用重组技术将其构建的pGL4.10载体，构建相应的重组质粒A1-A7和B1-B9。再利用限制性酶XhoI或Hind III分别单酶切B1获得另外2种人KLF7启动子，命名为C和D，利用T4DNA连接酶环化回收的相应DNA片段，获得重组质粒C和D。通过试验验证，发现18种启动子在鸡前脂肪细胞中都具有启动子活性，说明每种启动子都能直接调控人KLF7转录表达，并且这18种启动子序列分别位于三种人KLF7转录剪接体的转录起始位点上游不同位置，这对于揭示多种人KLF7转录剪接体表达的调控机制和开发靶向KLF7表达的药物具有重要意义，并且为研究人类多种与KLF7基因调控的疾病治疗奠定基础。
附图说明
图1为PCR扩增人KLF7基因启动子序列(A1-A7和B1-B9)的琼脂糖凝胶电泳图；M为DL5000 DNA marker，1-16分别为KLF7启动子序列A1-A7和B1-B9的PCR扩增结果，每一电泳图中最亮的条带为目的带，其余为PCR非特异带，在后续胶回收时会弃掉，不用于后续载体构建；
图2为18种人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因载体构建示意图和相关序列定位的物理图谱；其中，LUC指的萤火虫荧光素基因；图中注明了人KLF7基因的染色体定位和不同转录剪接体的转录起始位点；
图3为用于构建KLF7基因启动子荧光素酶报告基因的空载体pGL4.10结构图；
图4为人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因载体的酶切鉴定图；其中，泳道1为利用Xho I单酶切的空载体pGL4.10；泳道2-8为利用Xho I单酶切的重组质粒A1-A7、泳道9为DL5000 DNA marker；泳道10-17依次为利用Xho I单酶切的重组质粒B9、B6、B5、B8、B4、B7、B3和B2；泳道18和19分别为Kpn1和Hind III双酶切的重组质粒D和Kpn1和Xho I双酶切的重组质粒C；泳道20为Bgl 1单酶切的重组质粒B1。
图5为人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因载体B1的单酶切电泳图；其中，泳道1为Xho1单酶切人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因载体B1；泳道2为Hind III单酶切人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因载体B1；泳道M为DL5000 DNA marker。
图6为人KLF7基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因活性分析图；其中，不含有启动子序列的pGL4.10为阴性对照，pGL3-promoter为阳性对照，“**”表示与pGL4.10具有显著差异(P<0.01)；
图7为人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因相对活性图；其中，不含有启动子序列的pGL4.10为阴性对照组，pGL3-promoter为阳性对照组，“**”表示与pGL4.10具有显著差异(P<0.01)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
实施例1人KLF7基因启动子的制备
1、人精子基因组DNA提取
1.1试剂配置
1)酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(按照体积比配制)
2)氯仿：异戊醇＝24：1(按照体积比配制)
3)20mg/mL蛋白酶K(proteinase K)：将200mg的蛋白酶K加入到9.5mL双蒸水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，定容至10ml，然后分装储存于-20℃。
4)10％SDS(十二烷基硫酸钠)：称取100g SDS慢慢转移到0.9L双蒸水的烧杯中，加热至68℃并用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。若需要，用1mol/L NaOH调节至PH值7.2，用双蒸水定容至1L，室温保存，无需灭菌。
5)STE配制
10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)
0.1mol/L NaCl
1mmol/L EDTA(PH8.0)
121℃高压灭菌15min，储存于4℃。
6)1mol/L二硫苏糖醇配制标准(DTT)：二硫苏糖醇5g，加32.4mL去离子水，分成小份储存于-20℃。
1.2精子DNA提取
1)取冻存精液50μL放入1.5mL离心管中，用1mL PBS洗涤，10000r/min离心10min，弃上清，重复洗涤一次。
2)弃上清，加0.5mlL STE，50μL 10％SDS，20μL蛋白酶K(20mg/mL)，加入40μL DTT(1mol/L)，55℃消化过夜，摇床上进行。
3)从水浴锅中取出，冷却至室温加入500μL Tris饱和酚，颠倒混10min，再于15000r/min离心10min，用宽口移液管(口径0.3cm)吸水层水相于1.5mL EP管；勿吸入蛋白层；再用Tris饱和酚抽提2次，收集水相。
4)步骤3)收集的水相中加入500μL酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀10min，再于15000r/min离心10min，吸水层水相于1.5mL EP管；
5)步骤4)得到的水相中加入1mL无水乙醇，颠倒洗涤白色沉淀，12000r/min离心5min，弃液体。
6)步骤5)得到的白色沉淀中加1mL 70％乙醇洗涤，12000r/min离心5min，去上清。
7)自然干燥30min，用PH8.0 TE溶解DNA，-20℃保存备用。
2、人KLF7基因启动子区克隆
以提取的人基因组DNA为模板，利用表1所示的引物组合进行PCR扩增人KLF7基因启动子区，获得编号为A1-A7和B1-B9的16种质粒(如图2所示)中所包含的人KLF7启动子基因序列。
表1用于获得KLF7启动子片段A1-A7和B1-B9的引物组合
Figure GDA0003585296070000061
Figure GDA0003585296070000071
PCR反应体系如表2：
表2
Figure GDA0003585296070000072
PCR反应条件如表3：
表3
Figure GDA0003585296070000073
Figure GDA0003585296070000081
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，并用AXYGEN凝胶回收纯化试剂盒回收目的条带备用。
3、人KLF7启动子荧光素酶报告基因载体构建
以pGL4.10载体为酶切底物，利用限制性内切酶进行酶切，酶切体系以Xho I为例如表4：
表4
Figure GDA0003585296070000082
酶切条件为：37℃酶切1h。
Xho I酶切结果如图4第1泳道所示，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并用AXYGEN凝胶回收纯化试剂盒纯化回收，获得可以用于A1-A7和B2-B9重组质粒构建的线性化pGL4.10载体。
用于启动子B1序列重组的pGL4.10载体先利用内切酶SAC I酶切后进行胶回收纯化，之后胶回收产物再利用Nhe I酶切后胶回收纯化，获得可以用于B1重组质粒构建的线性化pGL4.10载体。
采用Vazyme的One Step Cloning Kit试剂盒，按照说明书在冰上配置好体系，体系如表5：
表5
Figure GDA0003585296070000083
Figure GDA0003585296070000091
反应体系在37℃反应30min完成质粒重组连接，构建如附图2所示的含有A1-A7和B1-B9这16种KLF7启动子的荧光素酶报告基因体，这16种重组质粒均以购自PROMEGA公司的pGL4.10载体为骨架(如图3所示)，通过同源重组导入上述A1-A7和B1-B9这16种人KLF7启动子后构建成功，其插入序列详见序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16。重组产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，AMP抗性筛选培养，挑取单克隆后，将单克隆接种于加了1％AMP的LB液体培养基中培养，培养12h后，采用AXYGEN提质粒试剂盒提取质粒，利用Xho I进行酶切鉴定重组质粒A1-A7和B2-B9,采用Bgl I单酶切鉴定重组质粒B1，结果如图4所示，重组质粒A1和A7均切出了4200bp(空载体)和相应大小的插入序列片段；由于B2-B9序列中本身具有一个内源性Xho I酶切位点加上载体构建时引入的2个Xho I酶切位点，所以切出了3条带，分别为4200bp片段和一条比目的片段小200bp的DNA片段，和一条200bp的片段；由于B8目的片段为400左右，所以切出了4200条带和一条较宽的200bp左右条带；B1由于序列内含有3个内源性Bgl 1酶切位点以及2个载体上自带的Bgl 1酶切位点，所以获得了符合预期大小的4条带；以上结果表明上述16种KLF7启动子质粒酶切鉴定正确。
酶切验证正确后，将质粒进行测序验证，将得到的16个阳性重组质粒标记按照插入序列的不同分别命名为重组质粒A1-A7、B1-B9。
将获得的重组质粒B1分别采用Xho I和Hind III单独酶切后，如图5所示回收大于5000bp的较长片段，采用T4 DNA连接酶连接，可以获得含有人KLF7启动子序列荧光素酶报告基因质粒C和D(如图2所示)。重组质粒C和D在空载体pGL4.10的多克隆位点间的插入序列详见序列表SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。T4 DNA连接的体系和反应条件如下。
T4 DNA连接体系如表6：
表6
Figure GDA0003585296070000092
Figure GDA0003585296070000101
反应条件为：16℃过夜。
利用Kpn1和Xho I或Kpn1和Hind III分别进行酶切鉴定重组质粒C和D，电泳结果如图4显示，能切出4200bp条带和预测大小的片段，表明载体构建成功
实施例2
人KLF7基因启动子活性分析
将生长状态良好的鸡前脂肪细胞接种于24孔细胞培养板中，接种密度为2.5×104个/孔，24h之后，按照Fugene HD(promega)转染试剂按照说明书将pGL4.10空质粒、pGL3-promoter和18种人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因质粒(即实施例1中构建的重组质粒A1-A7、B1-B9、C和D)分别转染到细胞中，其中，pGL4.10空质粒(empty vector，EV)为阴性对照组，转染pGL3-promoter质粒作为阳性对照组。每孔细胞转染500ng的萤火虫荧光素酶报告基因质粒，并同时转染45ng的pRL-TK质粒为实验内参，每组重复至少三次，转染48h之后收细胞，按照Promega公司的Dual-
Figure GDA0003585296070000102
Luciferase Assay System说明书进行荧光活性测定。
结果如图6所示，与阴性对照相比，所构建的18种人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因质粒均能够表现出显著的荧光素酶活性(P<0.01，双尾不配对t检验)。
如图7所示，与阴性对照相比，表现出显著活性的18种人KLF7基因启动子荧光素酶报告基因质粒，并不是由于转染效率和细胞状态差异造成的虚假现象。与阴性对照相比，构建的18种人KLF7基因启动子具有显著的相对活性(P<0.01，双尾不配对t检验)。表明构建的所有人KLF7启动子荧光素酶报告基因质粒均具有启动子活性。其中，3个启动子片段，编号分别为A7、B9和D具有较弱的启动子活性(如图7所示)，结合序列结构分析显示的物理图谱(如图2所示)，A7、B9和D分别位于KLF7的3种转录本NM_001270942.1、转录本NM_003709.4和NM_001270943.1的转录起始位点(TSS)的上游，它们不存在序列交叉，并且均具有明显的启动子活性，因此上述三个启动子片段可能分别含有了上述人KLF7的三种不同转录本的核心启动子序列。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种人KLF7基因启动子及其构建方法与应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2024
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccttgctg cataaatctc ttaaaatgaa tctaaaatat tctacaaagc ttggagcaaa 60
gaccataatg aggtttgcag tatttgcttt gtaaaatttt ggttgagtcc ttttgcaagt 120
cagacggctg atagttacat aggaaaagtc tcaatggaag cctcctcctc cggccccacc 180
caagcaattt ttgtaaacac acactgactt aaagctgagg aaccccattt ttcaccatac 240
aaagctcagt acagaacagt gtggggagtc agatgctctt ggatttgaac ccctgcttga 300
ccacttccag gttgtgagac cttgaccaac ttacttagta tttccaagcg tgggtatctt 360
catccataaa gttggggata ctttggggct gtccttaaga ttaaatgaga cattgcatat 420
aaagtgttta tgcgcatacg gcacattcga agtgcttaat aaatgggaac tattatttgt 480
aaaatcttca aactcacgtt aaccgatatg tcctatttta ttcaaaaatt gttataatgt 540
aacacacaca aaataagttc acttgagtct caagtaccaa attatatggt tggtcttgcc 600
tcaccttttg cctctagttt tctataccca agttcctttc cttcccctat tattcatgaa 660
catgtttttt gccctagtgt ttctcaatgg ttcctgccca tccccccagt tgaaatagca 720
tgggggtcag gggagagcat ggagaagggg agaccttgta acaaactagc aaggggtttc 780
tacctttcct ctatctccaa gattctatta atagtatatt ctcctaaagg tcctattagt 840
ttacatagct caagtgggga gacaatgata gctaatattt agtattcacc taatagtgtc 900
agatactatg ctaggtgagt taccaaagat attttgactc ttcataacaa ctagacaacg 960
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tcaaagtcgt gcagctagtt agctggcagc gtccttgcac atctaattgc agatgcatct 1080
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caacagaatt ccagacacta acaagtaaat aaatcaggct ttcctcaatc ccagtaattc 1200
atgtttaata ttccttggca aatactgaat ttcaatctgt gcttatttca tagagtagaa 1260
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accgaattct gcaatcattc caaaagtgga agctcagctc acagcgcatt ttggggaagc 1440
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cctcctcagg cgcttcttct ctgcaccctg gcagcccgtg gggagttcgg gaaggggccc 1980
tggatgcctt ttctgcttgt ttttgagtac gtgaggacct cccc 2024
<210> 2
<211> 1490
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatgtaaca cacacaaaat aagttcactt gagtctcaag taccaaatta tatggttggt 60
cttgcctcac cttttgcctc tagttttcta tacccaagtt cctttccttc ccctattatt 120
catgaacatg ttttttgccc tagtgtttct caatggttcc tgcccatccc cccagttgaa 180
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attagtttac atagctcaag tggggagaca atgatagcta atatttagta ttcacctaat 360
agtgtcagat actatgctag gtgagttacc aaagatattt tgactcttca taacaactag 420
acaacgcgga tcccactatt tctgtttctg agatgggtag atacaagttc tgacccagta 480
attcgctcaa agtcgtgcag ctagttagct ggcagcgtcc ttgcacatct aattgcagat 540
gcatctgcat ctacattaga gtaaatgttc caattatact catacaatga atgctatgaa 600
tctggccaac agaattccag acactaacaa gtaaataaat caggctttcc tcaatcccag 660
taattcatgt ttaatattcc ttggcaaata ctgaatttca atctgtgctt atttcataga 720
gtagaatctt tcaaatgttg tgttatcgag tcctacatag tcaaagggag gggaaagaca 780
aggagggtga ttaaggtgaa gcgtttcttc cattactggt agaacgaagt ttctcatctc 840
ttaagcaccg aattctgcaa tcattccaaa agtggaagct cagctcacag cgcattttgg 900
ggaagcttaa accacactaa ccatttaagg tcaagcaaac aattggccaa ccctaacgtg 960
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<210> 3
<211> 1223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attctattaa tagtatattc tcctaaaggt cctattagtt tacatagctc aagtggggag 60
acaatgatag ctaatattta gtattcacct aatagtgtca gatactatgc taggtgagtt 120
accaaagata ttttgactct tcataacaac tagacaacgc ggatcccact atttctgttt 180
ctgagatggg tagatacaag ttctgaccca gtaattcgct caaagtcgtg cagctagtta 240
gctggcagcg tccttgcaca tctaattgca gatgcatctg catctacatt agagtaaatg 300
ttccaattat actcatacaa tgaatgctat gaatctggcc aacagaattc cagacactaa 360
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtttcttcc attactggta gaacgaagtt tctcatctct taagcaccga attctgcaat 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 8
atttccaagc gtgggtatct tcatccataa agttggggat actttggggc tgtccttaag 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taatgtaaca cacacaaaat aagttcactt gagtctcaag taccaaatta tatggttggt 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catttaaggt caagcaaaca attggccaac cctaacgtga attgtgcagg gttttcatct 180
cagatgtaac agatctctct atgtctacat cccaactcca gaaaacgaga aatcgagttc 240
ctcctctcac catcgaagct ctgcagacac ctcgctggag accccatggt gagcctcatc 300
acgtaaaggc cccctcgcaa gctgccggct ccagcttgcg ccccacgtct acctaggctc 360
cctctagcct ctttaacgca cagtcgagca acaggcccct tgcaatcaac tctagccgcc 420
ggactcccga ccaggtctct cgctcggggt cagaaggagg cgcgggaggg agggcggcgg 480
cggcggcgcc cgcggggcgg ggcggggact gtgcgcaagc ggggggcggg cgcaggccgc 540
ggtctcgctc cgctcccctt tgttctctcc cattgtgtgg cacttcctcc tcaggcgctt 600
cttctctgca ccctggcagc ccgtggggag ttcgggaagg ggccctggat gccttttctg 660
cttgtttttg agtacgtgag gacctccccg gcaccgcctc gcgcgggtcc ctgccccgtg 720
cccaggcgga ggcggggtgg ccactgtcct tccttcccgc tccgcgccct cggcggcttc 780
cccgcggccc cctgcgccgc gccccctcca ggaggcgtcc tgaccccgca ctccggcctt 840
tcacctcccg accgtcagcc tcagggccgc cgcggcgacg cgcgacccct tccctctgag 900
gggcgcgggc tccggacgcg ccgggctctg ccaggcatct agtggagggt cggaggtcgg 960
cgaccagccc gagcccagcc gtcccgggag ctggcgcgag tgtcgccacg accctccctg 1020
tcccttgcgc tcgcgctgcc cggccgccgg gcggccgcct cagccccctt atatagccct 1080
ctaaaaatag ctcgcctcgc accgccttgt aaggcagcag ggagatccgc agcgtgccaa 1140
tccgcgcccg ccgccagggc caagccccgc cccaggctct gctccgggct ccccattggt 1200
cctcagtgac ttcatgagcc ccctgtttac cttacatggt cacacgcggc ctaatggacg 1260
ccctcctcga gatcccacgg ctgcgcggag aaccgaacgg agggagggag tttggggagg 1320
gggaagagca ggaggaggag aaaagggagg gggaagacta caaactagca aggatggggt 1380
ggggggtggg gagggaaggg aagggggggg aagagaagcg atcgcgagag aaaaaaatgc 1440
aacctcccaa aataaagagc aaagattgca ttaggagcga acagcgctgc agaaa 1495
<210> 12
<211> 1228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacctcgctg gagaccccat ggtgagcctc atcacgtaaa ggccccctcg caagctgccg 60
gctccagctt gcgccccacg tctacctagg ctccctctag cctctttaac gcacagtcga 120
gcaacaggcc ccttgcaatc aactctagcc gccggactcc cgaccaggtc tctcgctcgg 180
ggtcagaagg aggcgcggga gggagggcgg cggcggcggc gcccgcgggg cggggcgggg 240
actgtgcgca agcggggggc gggcgcaggc cgcggtctcg ctccgctccc ctttgttctc 300
tcccattgtg tggcacttcc tcctcaggcg cttcttctct gcaccctggc agcccgtggg 360
gagttcggga aggggccctg gatgcctttt ctgcttgttt ttgagtacgt gaggacctcc 420
ccggcaccgc ctcgcgcggg tccctgcccc gtgcccaggc ggaggcgggg tggccactgt 480
ccttccttcc cgctccgcgc cctcggcggc ttccccgcgg ccccctgcgc cgcgccccct 540
ccaggaggcg tcctgacccc gcactccggc ctttcacctc ccgaccgtca gcctcagggc 600
cgccgcggcg acgcgcgacc ccttccctct gaggggcgcg ggctccggac gcgccgggct 660
ctgccaggca tctagtggag ggtcggaggt cggcgaccag cccgagccca gccgtcccgg 720
gagctggcgc gagtgtcgcc acgaccctcc ctgtcccttg cgctcgcgct gcccggccgc 780
cgggcggccg cctcagcccc cttatatagc cctctaaaaa tagctcgcct cgcaccgcct 840
tgtaaggcag cagggagatc cgcagcgtgc caatccgcgc ccgccgccag ggccaagccc 900
cgccccaggc tctgctccgg gctccccatt ggtcctcagt gacttcatga gccccctgtt 960
taccttacat ggtcacacgc ggcctaatgg acgccctcct cgagatccca cggctgcgcg 1020
gagaaccgaa cggagggagg gagtttgggg agggggaaga gcaggaggag gagaaaaggg 1080
agggggaaga ctacaaacta gcaaggatgg ggtggggggt ggggagggaa gggaaggggg 1140
gggaagagaa gcgatcgcga gagaaaaaaa tgcaacctcc caaaataaag agcaaagatt 1200
gcattaggag cgaacagcgc tgcagaaa 1228
<210> 13
<211> 961
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggccgcggtc tcgctccgct cccctttgtt ctctcccatt gtgtggcact tcctcctcag 60
gcgcttcttc tctgcaccct ggcagcccgt ggggagttcg ggaaggggcc ctggatgcct 120
tttctgcttg tttttgagta cgtgaggacc tccccggcac cgcctcgcgc gggtccctgc 180
cccgtgccca ggcggaggcg gggtggccac tgtccttcct tcccgctccg cgccctcggc 240
ggcttccccg cggccccctg cgccgcgccc cctccaggag gcgtcctgac cccgcactcc 300
ggcctttcac ctcccgaccg tcagcctcag ggccgccgcg gcgacgcgcg accccttccc 360
tctgaggggc gcgggctccg gacgcgccgg gctctgccag gcatctagtg gagggtcgga 420
ggtcggcgac cagcccgagc ccagccgtcc cgggagctgg cgcgagtgtc gccacgaccc 480
tccctgtccc ttgcgctcgc gctgcccggc cgccgggcgg ccgcctcagc ccccttatat 540
agccctctaa aaatagctcg cctcgcaccg ccttgtaagg cagcagggag atccgcagcg 600
tgccaatccg cgcccgccgc cagggccaag ccccgcccca ggctctgctc cgggctcccc 660
attggtcctc agtgacttca tgagccccct gtttacctta catggtcaca cgcggcctaa 720
tggacgccct cctcgagatc ccacggctgc gcggagaacc gaacggaggg agggagtttg 780
gggaggggga agagcaggag gaggagaaaa gggaggggga agactacaaa ctagcaagga 840
tggggtgggg ggtggggagg gaagggaagg ggggggaaga gaagcgatcg cgagagaaaa 900
aaatgcaacc tcccaaaata aagagcaaag attgcattag gagcgaacag cgctgcagaa 960
a 961
<210> 14
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtccttcctt cccgctccgc gccctcggcg gcttccccgc ggccccctgc gccgcgcccc 60
ctccaggagg cgtcctgacc ccgcactccg gcctttcacc tcccgaccgt cagcctcagg 120
gccgccgcgg cgacgcgcga ccccttccct ctgaggggcg cgggctccgg acgcgccggg 180
ctctgccagg catctagtgg agggtcggag gtcggcgacc agcccgagcc cagccgtccc 240
gggagctggc gcgagtgtcg ccacgaccct ccctgtccct tgcgctcgcg ctgcccggcc 300
gccgggcggc cgcctcagcc cccttatata gccctctaaa aatagctcgc ctcgcaccgc 360
cttgtaaggc agcagggaga tccgcagcgt gccaatccgc gcccgccgcc agggccaagc 420
cccgccccag gctctgctcc gggctcccca ttggtcctca gtgacttcat gagccccctg 480
tttaccttac atggtcacac gcggcctaat ggacgccctc ctcgagatcc cacggctgcg 540
cggagaaccg aacggaggga gggagtttgg ggagggggaa gagcaggagg aggagaaaag 600
ggagggggaa gactacaaac tagcaaggat ggggtggggg gtggggaggg aagggaaggg 660
gggggaagag aagcgatcgc gagagaaaaa aatgcaacct cccaaaataa agagcaaaga 720
ttgcattagg agcgaacagc gctgcagaaa 750
<210> 15
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctccctgtc ccttgcgctc gcgctgcccg gccgccgggc ggccgcctca gcccccttat 60
atagccctct aaaaatagct cgcctcgcac cgccttgtaa ggcagcaggg agatccgcag 120
cgtgccaatc cgcgcccgcc gccagggcca agccccgccc caggctctgc tccgggctcc 180
ccattggtcc tcagtgactt catgagcccc ctgtttacct tacatggtca cacgcggcct 240
aatggacgcc ctcctcgaga tcccacggct gcgcggagaa ccgaacggag ggagggagtt 300
tggggagggg gaagagcagg aggaggagaa aagggagggg gaagactaca aactagcaag 360
gatggggtgg ggggtgggga gggaagggaa ggggggggaa gagaagcgat cgcgagagaa 420
aaaaatgcaa cctcccaaaa taaagagcaa agattgcatt aggagcgaac agcgctgcag 480
aaa 483
<210> 16
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caaggatggg gtggggggtg gggagggaag ggaagggggg ggaagagaag cgatcgcgag 60
agaaaaaaat gcaacctccc aaaataaaga gcaaagattg cattaggagc gaacagcgct 120
gcagaaa 127
<210> 17
<211> 2267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atttccaagc gtgggtatct tcatccataa agttggggat actttggggc tgtccttaag 60
attaaatgag acattgcata taaagtgttt atgcgcatac ggcacattcg aagtgcttaa 120
taaatgggaa ctattatttg taaaatcttc aaactcacgt taaccgatat gtcctatttt 180
attcaaaaat tgttataatg taacacacac aaaataagtt cacttgagtc tcaagtacca 240
aattatatgg ttggtcttgc ctcacctttt gcctctagtt ttctataccc aagttccttt 300
ccttccccta ttattcatga acatgttttt tgccctagtg tttctcaatg gttcctgccc 360
atccccccag ttgaaatagc atgggggtca ggggagagca tggagaaggg gagaccttgt 420
aacaaactag caaggggttt ctacctttcc tctatctcca agattctatt aatagtatat 480
tctcctaaag gtcctattag tttacatagc tcaagtgggg agacaatgat agctaatatt 540
tagtattcac ctaatagtgt cagatactat gctaggtgag ttaccaaaga tattttgact 600
cttcataaca actagacaac gcggatccca ctatttctgt ttctgagatg ggtagataca 660
agttctgacc cagtaattcg ctcaaagtcg tgcagctagt tagctggcag cgtccttgca 720
catctaattg cagatgcatc tgcatctaca ttagagtaaa tgttccaatt atactcatac 780
aatgaatgct atgaatctgg ccaacagaat tccagacact aacaagtaaa taaatcaggc 840
tttcctcaat cccagtaatt catgtttaat attccttggc aaatactgaa tttcaatctg 900
tgcttatttc atagagtaga atctttcaaa tgttgtgtta tcgagtccta catagtcaaa 960
gggaggggaa agacaaggag ggtgattaag gtgaagcgtt tcttccatta ctggtagaac 1020
gaagtttctc atctcttaag caccgaattc tgcaatcatt ccaaaagtgg aagctcagct 1080
cacagcgcat tttggggaag cttaaaccac actaaccatt taaggtcaag caaacaattg 1140
gccaacccta acgtgaattg tgcagggttt tcatctcaga tgtaacagat ctctctatgt 1200
ctacatccca actccagaaa acgagaaatc gagttcctcc tctcaccatc gaagctctgc 1260
agacacctcg ctggagaccc catggtgagc ctcatcacgt aaaggccccc tcgcaagctg 1320
ccggctccag cttgcgcccc acgtctacct aggctccctc tagcctcttt aacgcacagt 1380
cgagcaacag gccccttgca atcaactcta gccgccggac tcccgaccag gtctctcgct 1440
cggggtcaga aggaggcgcg ggagggaggg cggcggcggc ggcgcccgcg gggcggggcg 1500
gggactgtgc gcaagcgggg ggcgggcgca ggccgcggtc tcgctccgct cccctttgtt 1560
ctctcccatt gtgtggcact tcctcctcag gcgcttcttc tctgcaccct ggcagcccgt 1620
ggggagttcg ggaaggggcc ctggatgcct tttctgcttg tttttgagta cgtgaggacc 1680
tccccggcac cgcctcgcgc gggtccctgc cccgtgccca ggcggaggcg gggtggccac 1740
tgtccttcct tcccgctccg cgccctcggc ggcttccccg cggccccctg cgccgcgccc 1800
cctccaggag gcgtcctgac cccgcactcc ggcctttcac ctcccgaccg tcagcctcag 1860
ggccgccgcg gcgacgcgcg accccttccc tctgaggggc gcgggctccg gacgcgccgg 1920
gctctgccag gcatctagtg gagggtcgga ggtcggcgac cagcccgagc ccagccgtcc 1980
cgggagctgg cgcgagtgtc gccacgaccc tccctgtccc ttgcgctcgc gctgcccggc 2040
cgccgggcgg ccgcctcagc ccccttatat agccctctaa aaatagctcg cctcgcaccg 2100
ccttgtaagg cagcagggag atccgcagcg tgccaatccg cgcccgccgc cagggccaag 2160
ccccgcccca ggctctgctc cgggctcccc attggtcctc agtgacttca tgagccccct 2220
gtttacctta catggtcaca cgcggcctaa tggacgccct cctcgag 2267
<210> 18
<211> 1103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttccaagc gtgggtatct tcatccataa agttggggat actttggggc tgtccttaag 60
attaaatgag acattgcata taaagtgttt atgcgcatac ggcacattcg aagtgcttaa 120
taaatgggaa ctattatttg taaaatcttc aaactcacgt taaccgatat gtcctatttt 180
attcaaaaat tgttataatg taacacacac aaaataagtt cacttgagtc tcaagtacca 240
aattatatgg ttggtcttgc ctcacctttt gcctctagtt ttctataccc aagttccttt 300
ccttccccta ttattcatga acatgttttt tgccctagtg tttctcaatg gttcctgccc 360
atccccccag ttgaaatagc atgggggtca ggggagagca tggagaaggg gagaccttgt 420
aacaaactag caaggggttt ctacctttcc tctatctcca agattctatt aatagtatat 480
tctcctaaag gtcctattag tttacatagc tcaagtgggg agacaatgat agctaatatt 540
tagtattcac ctaatagtgt cagatactat gctaggtgag ttaccaaaga tattttgact 600
cttcataaca actagacaac gcggatccca ctatttctgt ttctgagatg ggtagataca 660
agttctgacc cagtaattcg ctcaaagtcg tgcagctagt tagctggcag cgtccttgca 720
catctaattg cagatgcatc tgcatctaca ttagagtaaa tgttccaatt atactcatac 780
aatgaatgct atgaatctgg ccaacagaat tccagacact aacaagtaaa taaatcaggc 840
tttcctcaat cccagtaatt catgtttaat attccttggc aaatactgaa tttcaatctg 900
tgcttatttc atagagtaga atctttcaaa tgttgtgtta tcgagtccta catagtcaaa 960
gggaggggaa agacaaggag ggtgattaag gtgaagcgtt tcttccatta ctggtagaac 1020
gaagtttctc atctcttaag caccgaattc tgcaatcatt ccaaaagtgg aagctcagct 1080
cacagcgcat tttggggaag ctt 1103
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccagatcttg atatcctcga gggggaggtc ctcacgtact ca 42
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccagatcttg atatcctcga gtttctgcag cgctgttcgc 40
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctgagctcg ctagcctcga gtgccttgct gcataaatct ctta 44
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cctgagctcg ctagcctcga gtaatgtaac acacacaaaa taagttcact t 51
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctgagctcg ctagcctcga gattctatta atagtatatt ctcctaaagg tcct 54
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cctgagctcg ctagcctcga ggcagatgca tctgcatcta catta 45
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctgagctcg ctagcctcga gcgtttcttc cattactggt agaacg 46
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctgagctcg ctagcctcga gcacctcgct ggagacccc 39
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctgagctcg ctagcctcga gggccgcggt ctcgctccg 39
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctgagctcg ctagcctcga ggtccttcct tcccgctccg 40
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctgagctcg ctagcctcga gcctccctgt cccttgcgc 39
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctgagctcg ctagcctcga gcaaggatgg ggtgggggg 39
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aactggccgg tacctgagct catttccaag cgtgggtatc ttc 43
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cttgatatcc tcgaggctag ctttctgcag cgctgttcgc 40

Claims (9)

1.一种人KLF7基因启动子，其特征在于，所述人KLF7基因启动子核苷酸序列选自如SEQID NO：1-SEQ ID NO：18所示任一条序列。
2.一种引物组，其特征在于，所述引物组包含上游引物如SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：31所示，下游引物如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：32所示；
利用如下表所示的引物组合，经PCR扩增获得权利要求1所述的人KLF7基因启动子，
Figure 859524DEST_PATH_IMAGE001
。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的人KLF7基因启动子。
4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。
5.一种如权利要求1所述的人KLF7基因启动子的构建方法，其特征在于，包括利用权利要求2所述的引物组进行PCR扩增获取人KLF7基因启动子核苷酸序列的步骤。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物组。
7.一种如权利要求1所述的KLF7基因启动子的应用，其特征在于，应用于启动萤火虫荧光素酶在真核细胞中表达。
8.如权利要求7所述的KLF7基因启动子的应用，其特征在于，所述真核细胞来源于人细胞或者鸡细胞。
9.一种如权利要求1所述的KLF7基因启动子的应用，其特征在于，应用于制备靶向KLF7基因表达的药物中。
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