CN106701764B

CN106701764B - 15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区与应用

Info

Publication number: CN106701764B
Application number: CN201710039364.4A
Authority: CN
Inventors: 田静; 邹琛; 黄燕妹; 刘琼; 倪嘉缵
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2037-01-19
Also published as: CN106701764A

Abstract

本发明公开了一种15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区与应用。本发明所提供的15kDa硒蛋白基因的启动子核心区为序列表中序列1的第1238‑1808位，启动子序列可为如下DNA片段：至少含有序列表中序列1的第1238‑1808位核苷酸序列，并且从序列1的第1238位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为571bp至1808bp的任意一个DNA片段。本发明所提供的15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区对于预防和/或治疗内质网应激相关疾病具有重要意义。

Description

15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区与应用。

背景技术

Sep15是一种硒蛋白，分子大小为15kDa，在其N端有一个硫氧还蛋白结构域，这个结构域预示着它是一种二硫键还原酶或二硫键异构酶，具有氧化还原功能，与葡糖基糖蛋白(UGGT)结合而定位在内质网腔中，一起参与内质网蛋白质量控制。

在很多报道中，错误折叠蛋白的积累引发的疾病有很多，例如阿尔兹海默症、帕金森疾病以及肌肉萎缩性侧面硬化病等，诱发疾病的一个主要原因之一是体内产生严重的内质网应激，那么预示着Sep15在这些疾病中也扮演着重要的角色，诱导Sep15的表达可能可以缓解这些疾病的进展。

转基因技术的关键在于使外源目的基因在转基因受体内稳定高效的表达，而转基因表达所用的启动子起着非常重要的作用。启动子是一段能使基因进行转录的DNA序列，转录的RNA通过进一步的翻译和修饰形成功能蛋白质。目前，在现有的研究中，只存在对Sep15的基因、结构的研究，并无报道启动子区域。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区。

本发明所提供的15kDa硒蛋白基因的启动子核心区为序列表中序列1的第1238-1808位，所提供的启动子序列可为下述a)或b)或c)的DNA片段：

a)至少含有序列表中序列1的第1238-1808位核苷酸序列，并且从序列1的第1238位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为571bp至1808bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；

b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

在本发明中，所述启动子具体为下述a1)-a4)中任一种：

a1)核苷酸序列为序列表中序列1的第1238-1808位核苷酸所示的DNA分子；

a2)核苷酸序列为序列表中序列1的第626-1265位核苷酸所示DNA分子；

a3)核苷酸序列为序列表中序列1的第626-1808位核苷酸所示DNA分子；

a4)核苷酸序列为序列表中序列1的第1-1808位核苷酸所示DNA分子。

含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体中，由所述启动子启动目的基因的转录。在本发明中，所述重组载体具体为在pGL4.10[LUC2]载体的多克隆位点插入所述启动子得到的重组质粒。所述目的基因具体为荧光素酶基因(luc)。

所述表达盒由所述启动子，由所述启动子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明实施例中，所述目的基因具体为荧光素酶基因(luc)。

所述启动子在如下(A1)或(A2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(A1)启动目的基因在靶细胞中的转录；

(A2)制备启动目的基因在靶细胞中转录的产品。

所述目的基因可为15kDa硒蛋白基因或其他基因。在本发明实施例中，所述目的基因具体为荧光素酶基因(luc)。

所述靶细胞为动物细胞。在本发明实施例中，所述靶细胞具体为HEK293T细胞或Neuro 2a细胞。

本发明的另一个目的是提供一种在靶细胞中增强所述启动子活性的方法。

本发明所提供的在靶细胞中增强所述启动子活性的方法，可包括如下(A)-(C)步骤中的至少一种：

(A)提高所述靶细胞中热休克转录因子1的表达量；

(B)对所述靶细胞进行热激处理；

(C)对所述靶细胞进行衣霉素处理。

在所述(A)中，所述热休克转录因子1(HSF1)的氨基酸序列为序列表中序列2。

在所述(B)中，对所述靶细胞进行热激处理的条件可为42-43℃水浴1-2h，如43℃水浴1h。

在所述(C)中，对所述靶细胞进行衣霉素处理具体可为将所述靶细胞置于浓度为100ng-5μg/ml(具体如100ng/ml或者5μg/ml)的衣霉素溶液中12-24h。

所述靶细胞为动物细胞。在本发明实施例中，所述靶细胞具体为HEK293T细胞。

本发明所提供的启动子、含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述方法在制备用于预防和/或治疗内质网应激相关疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

其中，所述内质网应激相关疾病，具体如阿尔兹海默症、帕金森疾病以及肌肉萎缩性侧面硬化病等。

本发明首次发现Sep15的核心启动子区域，并且发现过表达热休克转录因子1(HSF1)、热激处理或者衣霉素处理可以有效提高Sep15启动子活性。本发明对于预防和/或治疗内质网应激相关疾病具有重要意义。

附图说明

图1为HEK293T基因组DNA提取凝胶电泳。

图2为各个区段在Sep15启动子上对应的位置示意图。

图3为以人基因组DNA为模板PCR扩增人Sep15启动子区的琼脂糖凝胶电泳图。M：分子量标准(DL2000Marker)；1为pGL4-2055/-248PCR片段；2为pGL4-2055/-791PCR片段，3为pGL4-1430/-248PCR片段；4为pGL4-1430/-791PCR片段；5为pGL4-646/-402PCR片段；6为pGL4-2055/-1225PCR片段；7为pGL4-818/-248PCR片段；8为pGL4-818/-166PCR片段；9为pGL4-272/+909PCR片段。

图4为Sep15启动子区重组质粒菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M：分子量标准(DL2000Marker)；1-4为pGL4-2055/-248菌液PCR条带；5-12为pGL4-2055/-791菌液PCR条带，13-16为pGL4-1430/-248菌液PCR条带；17-20为pGL4-272/+909菌液PCR条带。

图5为Sep15启动子区重组质粒菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M：分子量标准(DL2000Marker)；1-4为pGL4-818/-248菌液PCR条带；5-8为pGL4-818/-166菌液PCR条带，9-11为pGL4-1430/-791菌液PCR条带；12-14为pGL4-646/-402菌液PCR条带。

图6为Sep15启动子区重组质粒菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M：分子量标准(DL2000Marker)；1-3为pGL4-2055/-1225菌液PCR条带。

图7为Sep15启动子区重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。M：分子量标准(DL2000Marker)；1为pGL4-2055/-248酶切产物；2为pGL4-2055/-791酶切产物，3为pGL4-1430/-248酶切产物；4为pGL4-1430/-791酶切产物；5为pGL4-646/-402酶切产物；6为pGL4-2055/-1225酶切产物；7为pGL4-818/-248酶切产物；8为pGL4-818/-166酶切产物；9为pGL4-272/+909酶切产物。

图8为Sep15启动子各片段与pGL4.10[LUC2]的重组子转染HEK293T细胞后荧光素酶活性检测。n＝4，t检验。**，p<0.01；***，p<0.001。

图9为Sep15启动子各片段与pGL4.10[LUC2]重组子转染Neuro 2a细胞后荧光素酶活性检测。n＝4，t检验。**，p<0.01；***，p<0.001。

图10为pGL4-818/-248与pcDNA3.1-HSF1共转染HEK293T细胞后荧光素酶活性检测。-，无；+，加。n＝4，t检验。***，p<0.001。

图11为热激后双荧光素酶检测Sep15的核心启动子活性。-，无；+，加。n＝4，t检验。***，p<0.001。

图12为过表达HSF1和过表达HSF1并Tm处理检测Sep15核心启动子活性。-，无；+，加。n＝4，t检验。*，p<0.05；**，p<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

表1下述实施例中所用的大肠杆菌菌株

表2下述实施例中使用的载体质粒

表3下述实施例中所用的细胞株

表4下述实施例中使用的引物

*加粗为保护碱基，斜体下划线表示酶切位点区域，于上海赛百胜生物公司合成以上引物。

表5主要试剂和试剂盒

表6主要的溶液配方

表7实验仪器

表8主要应用的生物学软件及相关网站

实施例1、15kDa硒蛋白基因启动子序列的克隆

一、人基因组DNA提取

通过使用DNA提取试剂盒从HEK293T细胞中提取基因组DNA，通过核酸蛋白检测仪检测DNA的浓度为0.450μg/μl，A260/A280的值为1.818，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳如图1所示。由图可见，DNA虽有小部分降解，但整体质量良好，可以用以进行后续实验。

二、PCR获得Sep15启动子各片段

利用特异性引物分别克隆Sep15基因启动子的10个区段，克隆区段名称、大小及所用引物如表9所示，克隆的区段在启动子上的对应位置如图2所示。以步骤一获得的人基因组DNA为模板，进行PCR反应，并将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示。

表9克隆Sep15基因启动子的10个区段，克隆区段名称、大小及所用引物

注：表中正向引物和反向引物的具体序列详见表4。

三、Sep15启动子各片段酶切

使用相应限制性内切酶在37℃下对pGL4.10[LUC2]载体及步骤二获得的各目的片段酶切3h，酶切后的线性载体比未酶切的环状载体迁移得慢，且条带均一，因此可确定载体及目的片段已被完全酶切，将酶切回收产物进行连接。

四、Sep15启动子活性检测重组子菌液鉴定

将连接产物转化大肠杆菌E.coli Top10，每个平板挑选3～5个单克隆，分别接种至含氨苄抗性的液体培养基中培养过夜，取1μL菌液作为模板，进行菌液PCR鉴定，结果如图4至图6所示，能扩增出的目的条带的单克隆即为带有目的基因的重组质粒的阳性克隆，可用于下一步酶切鉴定。

五、Sep15启动子活性检测重组子酶切鉴定

将重组质粒使用相应的限制性内切酶37℃酶切3h后进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图7所示，出现目的条带即说明酶切鉴定为目的重组质粒构建成功。

六、Sep15启动子活性检测重组子序列比对

将重组质粒进行测序，测定结果使用NCBI数据库BLAST对比后，确定插入的目片段的碱基序列正确率为100％，即说明重组质粒构建成功，可以用于进一步的实验。

实施例2、15kDa硒蛋白基因启动子的活性检测及核心区的确定

分别将上述实施例1构建好的Sep15启动子的不同区段片段的重组质粒与pRL-TK质粒以19:1(如380ng：20ng)的比例，共转至HEK293T和Neuro 2a细胞中，以pGL4.10[LUC2]空载体为对照，转染24h后进行双荧光素酶活性检测，具体操作检测双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒说明书进行。

结果如图8及图9所示。由图可知，pGL4-2055/-791、pGL4-2055/-1225、pGL4-646/-402、pGL4-272/+909的酶活接近空载pGL4.10[LUC2]的背景值，即基本无启动子活性，而其他几个启动子片段重组子相对于空载体对照，酶活有显著升高，说明该几个片段在这HEK293T、Neuro 2a两种细胞中都具有启动子活性，且呈现相同的变化趋势。其中，pGL4-818/-248的结构描述如下：将pGL4.10[LUC2]载体的酶切位点KpnI和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列1的第1238-1808位所示DNA片段的重组质粒。pGL4-1430/-791的结构描述如下：将pGL4.10[LUC2]载体的酶切位点KpnI和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列1的第626-1265位所示DNA片段的重组质粒。pGL4-1430/-248的结构描述如下：将pGL4.10[LUC2]载体的酶切位点KpnI和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列1的第626-1808位所示DNA片段的重组质粒。pGL4-2055/-248的结构描述如下：将pGL4.10[LUC2]载体的酶切位点KpnI和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列1的第1-1808位所示DNA片段的重组质粒。

包含最长启动子片段的pGL4-2055/-248具有一定的启动子活性，但在缺失片段-818/-248后即pGL4-2055/-791活性降为背景值，另外其他几个pGL4-646/-402，pGL4-272/+909不含-818/-248的活性均下降，说明-818/-248在Sep15启动子的启动上起到重要作用，为其核心区。

pGL4-2055/-248活性较pGL4-1430/-248，pGL4-1430/-791下降数倍，显示-2055/-1430区间可能含有一个较强的负调控反式作用因子结合位点，同理pGL4-1430/-248较pGL4-818/-248活性下降约一倍，说明-1430/-818可能也含有一个负调控反式作用因子结合位点；pGL4-818/-166较pGL4-818/-248活性略有下降，说明-248/-166可能也含有一个较弱的负调控反式作用因子结合位点。

实施例3、过表达HSF1真核表达载体检测Sep15核心启动子活性

HEK293T细胞培养到80％-90％密度后，进行细胞计数，将0.5-2×10⁵个细胞铺于24孔板中，第二天将重组子pGL4-818/-248与pcDNA3.1-HSF1以1:1的比例(质量比)和pRL-TK质粒共转HEK293T细胞，以pcDNA3.1/Myc-His A空载体为对照组，转染24h后，裂解细胞，进行双荧光素酶活性检测，具体操作检测双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒说明书进行。

其中，pcDNA3.1-HSF1载体的具体构建过程如下：以人工合成的序列表中序列3所示的HSF1的CDS序列为模板，采用引物HSF1-MYC-F和HSF1-MYC-R(具体序列见表4)进行PCR扩增，将所得PCR产物采用EcoRI和HindⅢ进行双酶切，回收酶切产物，与经过同样双酶切的pcDNA3.1/Myc-His A载体大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明将pcDNA3.1/Myc-HisA载体的酶切位点EcoRI和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列3的第1-1587位所示DNA片段的重组质粒即为pcDNA3.1-HSF1。pcDNA3.1-HSF1载体中，HSF1基因的3’末端连接有标签蛋白MYC的编码序列。

结果如图10所示。由图可见，过表达HSF1后，Sep15基因的核心启动子pGL4-818/-248活性显著上调，提高2倍左右，统计学分析显示，组间具有显著性差异。

实施例4、热激检测Sep15核心启动子活性

HEK293T细胞培养到80％-90％密度后，进行细胞计数，将0.5-2×10⁵个细胞铺于24孔板中，第二天将重组子pGL4-818/-248与pRL-TK质粒以19:2(如190ng：20ng)的比例，共转至HEK293T细胞中，以pGL4.10[LUC2]空载体为对照，转染24h后，于43℃水浴锅进行热激1h，37℃恢复4h，之后裂解细胞进行双荧光素酶检测，具体操作检测双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒说明书进行。

结果如图11所示。由图可见，热激后，相比于没有进行热激的细胞，Sep15的核心启动子活性显著上调，说明热激能够显著提高Sep15的核心启动子活性。

实施例5、衣霉素(Tunicamycin，Tm)处理检测Sep15核心启动子活性

HEK293T细胞培养到80％-90％密度后，进行细胞计数，将0.5-2×10⁵个细胞铺于24孔板中，第二天将重组子pGL4-818/-248与pcDNA3.1-HSF1以1:1的比例(质量比)和pRL-TK质粒共转HEK293T细胞，以pcDNA3.1/Myc-His A载体为对照组，转染24h后进行衣霉素(Tunicamycin，Tm)处理12h，其中Tm的工作浓度维持在100ng/ml。之后裂解细胞进行双荧光素酶检测，具体操作检测双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒说明书进行。

结果如图12所示。由图可见，Tm处理或者过表达HSF1，Sep15启动子活性都有显著提高，当Tm处理同时过表达HSF1，Sep15启动子活性增强。

<110> 深圳大学

<120> 15kDa硒蛋白基因的启动子及其核心区与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1808

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

aactctcgct ctccatgctg agctcttcca aatgccaaag tgccctatta atccgaaagt 60

acctattatc tgtgcttttt tctggcctgt ctttcacaac ttcacaccaa ctttttgtac 120

tttagacccc ctcatccatt aaagcacctg ttaacccttt aaggtattta accatatggt 180

tagctttccg cataatccta cttttccttt aacaaacaca aacttcacta cataattccc 240

cttcagcgtt ccctcctctt cgaaattcac atcaacactg ccgtgaagca acatacatag 300

gcatccctat tctcaagccc caattcatca gtttagcgcc actaaagaag aatttaaatc 360

tccggaccct catttccgta ctccgatgaa gctttgcact cgcgttcccg cactacccgg 420

ccagcctccc tcagctggca attacaaggt cctttgctgc ccggagcaca agagtgcaac 480

tcgctacagt gttcacatgt tgctctccgt catcccagca tctcctccca tttctgcgca 540

cctatccctt catgagcccc caaaagaatt cgtatccaga tgcccatagc tcaaattaga 600

atacccctca tctgacattg ccagggcttc ctgtacgact tccaagagaa cacgcgatgc 660

taagcgcttc tgtctccgga gaccagcaac acacgctccc cactgagttc ggtcttctct 720

ctcgctctct ctccgcggaa tgcctacttc ggggctaccc tttggctagg gaagcccaac 780

cttgcaacct ctgccccgtg acctcgcgag cccagcacgc cgctcaagct taattcaacc 840

cattcttgga gctcgtgctc tcgctgcccc ttgttcccgg ttctctttga aaccgctttc 900

agcccccgag ccagacccca ggttagatga acgcccactt gctccggcgg cagcgcctcc 960

tcggcccctt ccacagcact cagcccgggg cagttcagtt cctcacctag cttcgagcgg 1020

gactcctcca gtttctggat ctggttttcc aagaagagca tcgccaccgc gaaggccacc 1080

accgccagca gctgcaactt gggcggcatc ataatcctga ggagccccat gaaacccgct 1140

gctcgggatc aagacatacc gcggggggcg gggagcggga ccccggaggc gagagagacg 1200

ccgggaggag cccgccgagc cgggagcgag gcaaagagag agcgacagcg agagaaccac 1260

cgcagcgacc ccccttctcg cctctccagt ccccctcccc caggcgctat caccaacgcc 1320

gctggtgtcc gcttctcctc agccgactaa acggccgccc cctccaaaag cccgcgcagc 1380

aaacagcgcg aagcggctgc cgggctctcg cctccctcta ctgcctcagt ccccgacccc 1440

cgcgcccgcc tgcttgcccg cctccctctc ttccttcctt ccctccctcc tttgctcgcg 1500

gccgcgcgcc cctccaccgg cgctgcggct gcgccgccct catccccgcc cccgcccatc 1560

cccctccgcc accacgcgca cgcatccgcg tacgctgctc ggcaaccaga agccccgccc 1620

ctccccccgt tcgggtccgc ttattggacg gaagagcccc tgcgcttcgc tcttggttcg 1680

gtttacggtt ggtttcctct gccacagagc tcaatcaaga cgacattcaa ttgggtaaac 1740

ttggagaaga aggcggggct aaaactggcg aaggcgtggc ttcttggctg cttgacgaag 1800

tgtcgtga 1808

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Asp Leu Pro Val Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ser Asn Val Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Thr Lys Leu Trp Thr Leu Val Ser Asp Pro Asp Thr Asp

20 25 30

Ala Leu Ile Cys Trp Ser Pro Ser Gly Asn Ser Phe His Val Phe Asp

35 40 45

Gln Gly Gln Phe Ala Lys Glu Val Leu Pro Lys Tyr Phe Lys His Asn

50 55 60

Asn Met Ala Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr Gly Phe Arg Lys

65 70 75 80

Val Val His Ile Glu Gln Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Arg Asp Asp

85 90 95

Thr Glu Phe Gln His Pro Cys Phe Leu Arg Gly Gln Glu Gln Leu Leu

100 105 110

Glu Asn Ile Lys Arg Lys Val Thr Ser Val Ser Thr Leu Lys Ser Glu

115 120 125

Asp Ile Lys Ile Arg Gln Asp Ser Val Thr Lys Leu Leu Thr Asp Val

130 135 140

Gln Leu Met Lys Gly Lys Gln Glu Cys Met Asp Ser Lys Leu Leu Ala

145 150 155 160

Met Lys His Glu Asn Glu Ala Leu Trp Arg Glu Val Ala Ser Leu Arg

165 170 175

Gln Lys His Ala Gln Gln Gln Lys Val Val Asn Lys Leu Ile Gln Phe

180 185 190

Leu Ile Ser Leu Val Gln Ser Asn Arg Ile Leu Gly Val Lys Arg Lys

195 200 205

Ile Pro Leu Met Leu Asn Asp Ser Gly Ser Ala His Ser Met Pro Lys

210 215 220

Tyr Ser Arg Gln Phe Ser Leu Glu His Val His Gly Ser Gly Pro Tyr

225 230 235 240

Ser Ala Pro Ser Pro Ala Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Tyr Ala Pro Asp

245 250 255

Ala Val Ala Ser Ser Gly Pro Ile Ile Ser Asp Ile Thr Glu Leu Ala

260 265 270

Pro Ala Ser Pro Met Ala Ser Pro Gly Gly Ser Ile Asp Glu Arg Pro

275 280 285

Leu Ser Ser Ser Pro Leu Val Arg Val Lys Glu Glu Pro Pro Ser Pro

290 295 300

Pro Gln Ser Pro Arg Val Glu Glu Ala Ser Pro Gly Arg Pro Ser Ser

305 310 315 320

Val Asp Thr Leu Leu Ser Pro Thr Ala Leu Ile Asp Ser Ile Leu Arg

325 330 335

Glu Ser Glu Pro Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala Leu Thr Asp Ala Arg

340 345 350

Gly His Thr Asp Thr Glu Gly Arg Pro Pro Ser Pro Pro Pro Thr Ser

355 360 365

Thr Pro Glu Lys Cys Leu Ser Val Ala Cys Leu Asp Lys Asn Glu Leu

370 375 380

Ser Asp His Leu Asp Ala Met Asp Ser Asn Leu Asp Asn Leu Gln Thr

385 390 395 400

Met Leu Ser Ser His Gly Phe Ser Val Asp Thr Ser Ala Leu Leu Asp

405 410 415

Leu Phe Ser Pro Ser Val Thr Val Pro Asp Met Ser Leu Pro Asp Leu

420 425 430

Asp Ser Ser Leu Ala Ser Ile Gln Glu Leu Leu Ser Pro Gln Glu Pro

435 440 445

Pro Arg Pro Pro Glu Ala Glu Asn Ser Ser Pro Asp Ser Gly Lys Gln

450 455 460

Leu Val His Tyr Thr Ala Gln Pro Leu Phe Leu Leu Asp Pro Gly Ser

465 470 475 480

Val Asp Thr Gly Ser Asn Asp Leu Pro Val Leu Phe Glu Leu Gly Glu

485 490 495

Gly Ser Tyr Phe Ser Glu Gly Asp Gly Phe Ala Glu Asp Pro Thr Ile

500 505 510

Ser Leu Leu Thr Gly Ser Glu Pro Pro Lys Ala Lys Asp Pro Thr Val

515 520 525

Ser

<210> 3

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

atggatctgc ccgtgggccc cggcgcggcg gggcccagca acgtcccggc cttcctgacc 60

aagctgtgga ccctcgtgag cgacccggac accgacgcgc tcatctgctg gagcccgagc 120

gggaacagct tccacgtgtt cgaccagggc cagtttgcca aggaggtgct gcccaagtac 180

ttcaagcaca acaacatggc cagcttcgtg cggcagctca acatgtatgg cttccggaaa 240

gtggtccaca tcgagcaggg cggcctggtc aagccagaga gagacgacac ggagttccag 300

cacccatgct tcctgcgtgg ccaggagcag ctccttgaga acatcaagag gaaagtgacc 360

agtgtgtcca ccctgaagag tgaagacata aagatccgcc aggacagcgt caccaagctg 420

ctgacggacg tgcagctgat gaaggggaag caggagtgca tggactccaa gctcctggcc 480

atgaagcatg agaatgaggc tctgtggcgg gaggtggcca gccttcggca gaagcatgcc 540

cagcaacaga aagtcgtcaa caagctcatt cagttcctga tctcactggt gcagtcaaac 600

cggatcctgg gggtgaagag aaagatcccc ctgatgctga acgacagtgg ctcagcacat 660

tccatgccca agtatagccg gcagttctcc ctggagcacg tccacggctc gggcccctac 720

tcggccccct ccccagccta cagcagctcc agcctctacg cccctgatgc tgtggccagc 780

tctggaccca tcatctccga catcaccgag ctggctcctg ccagccccat ggcctccccc 840

ggcgggagca tagacgagag gcccctatcc agcagccccc tggtgcgtgt caaggaggag 900

ccccccagcc cgcctcagag cccccgggta gaggaggcga gtcccgggcg cccatcttcc 960

gtggacaccc tcttgtcccc gaccgccctc attgactcca tcctgcggga gagtgaacct 1020

gcccccgcct ccgtcacagc cctcacggac gccaggggcc acacggacac cgagggccgg 1080

cctccctccc ccccgcccac ctccacccct gaaaagtgcc tcagcgtagc ctgcctggac 1140

aagaatgagc tcagtgacca cttggatgct atggactcca acctggataa cctgcagacc 1200

atgctgagca gccacggctt cagcgtggac accagtgccc tgctggacct gttcagcccc 1260

tcggtgaccg tgcccgacat gagcctgcct gaccttgaca gcagcctggc cagtatccaa 1320

gagctcctgt ctccccagga gccccccagg cctcccgagg cagagaacag cagcccggat 1380

tcagggaagc agctggtgca ctacacagcg cagccgctgt tcctgctgga ccccggctcc 1440

gtggacaccg ggagcaacga cctgccggtg ctgtttgagc tgggagaggg ctcctacttc 1500

tccgaagggg acggcttcgc cgaggacccc accatctccc tgctgacagg ctcggagcct 1560

cccaaagcca aggaccccac tgtctcctag 1590

Claims

1.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为下述a1)-a4)中任一种：

a3)核苷酸序列为序列表中序列1的第626-1808位核苷酸所示DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体中，由权利要求1所述DNA分子启动目的基因的转录。

4.权利要求1所述DNA分子在如下(A1)或(A2)中的应用：

(A1)启动目的基因在靶细胞中的转录；

(A2)制备启动目的基因在靶细胞中转录的产品。

5.一种增强权利要求1中a1)所述DNA分子在靶细胞中的Sep15启动子活性的方法，包括如下(A)-(C)步骤中的至少一种：

(A)提高所述靶细胞中热休克转录因子1的表达量；

(B)对所述靶细胞进行热激处理；

(C)对所述靶细胞进行衣霉素处理。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述(B)中，对所述靶细胞进行热激处理的条件是42-43℃水浴1-2h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述(C)中，对所述靶细胞进行衣霉素处理为将所述靶细胞置于浓度为100ng-5μg/ml的衣霉素溶液中12-24h。

8.根据权利要求4所述的应用或权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为动物细胞。