CN110777166B

CN110777166B - 一种牛klf3基因真核过表达载体的构建与应用

Info

Publication number: CN110777166B
Application number: CN201911167805.4A
Authority: CN
Inventors: 黄永震; 徐嘉威; 王大会; 刘贤; 贺花; 张子敬; 于翔; 吕世杰; 王二耀; 陈宏�; 雷初朝; 胡沈荣
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110777166A

Abstract

本发明公开了一种牛KLF3基因真核过表达载体的构建与应用。针对秦川牛KLF3基因编码区设计引物，并扩增对应的牛KLF3基因；构建pcDNA3.1‑KLF3重组过表达载体，并转染细胞。本发明通过克隆牛KLF3基因并构建真核过表达载体，可应用于牛KLF3基因功能研究、鉴定和调控肌肉生长发育。

Description

一种牛KLF3基因真核过表达载体的构建与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种质粒型重组过表达载体pcDNA3.1-KLF3及其构建方法，该过表达载体可以在改造种子细胞和牛KLF3功能鉴定中应用。

背景技术

目前，基因表达已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主流技术。基因过度表达为基因敲除的“合理逆转”。基因的过表达可以确保产生更多的信使RNA，也就会产生更多的蛋白质或下游产物。其能正调节一个基因的性能，便于研究基因在生物体内的功能。

目前已开发出许多可实现基因过表达的质粒载体。pcDNA3.1(+/-)载体是最常用的哺乳动物表达载体之一，其利用CMV promoter强启动子调控外源基因表达，载体拷贝数、表达量均较高，且无荧光标记，也不携带tag。并具有Amp+原核筛选抗性和Neo+真核筛选抗性，可以利用G418筛选稳定细胞株。pcDNA3.1(+/-)载体质粒大小为5.4Kb，具有多克隆位点区，含多种限制酶酶切位点，可以通过双酶切法整合目的基因以构建实现目的基因表达的重组质粒。

在分子生物学实验中，一般都会使用两种不同的限制酶同时处理目的基因和载体，以防止目的基因和载体出现自连或反向连接的现象。双酶切法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。

KLF家族因子是一类含有锌指结构域，并以此可以结合DNA中的GC-box或相关的CACCC元件的基本转录蛋白，其依靠对于含有特定GC-box启动子的基因的转录调控，及通过与辅助抑制因子羧基端结合蛋白(C-terminal binding protein,CtBP)相关联来抑制基因表达。KLF3又称为碱性KLF因子(Basic Kruppel-like factor,BKLF)，同其他KLF因子一样拥有锌指结构基团、核定位信号以及富含氨基酸的功能区，KLF3转录因子在C端通过Cys2-His2锌指结构域与目的序列结合。

2008年，在研究KLF3基因敲除的实验中发现了KLF3因子对脂肪生成分化过程的作用。在这个研究中，研究人员利用遗传工程小鼠为实验模型，通过对KLF3因子C端结合DNA的锌指结构的靶向性敲除来敲除KLF3基因，结果显示KLF3基因敲除后小鼠的出生率下降，经器官和体重检测，其相比同窝出生的正常小鼠体型更小。经过进一步的检测，发现小鼠体内脂肪垫中白色脂肪组织的体积和细胞的减少。此外，通过称量其他几个器官，然后相对于小鼠体积做校正之后，发现只有脂肪组织受到影响。在对脂肪细胞系3T3-L1的诱导分化研究中，KLF3因子的mRNA、蛋白表达水平化等的上调会抑制该细胞系向脂肪细胞分化。进一步的机制研究显示，KLF3通过抑制C/EBPα基因的表达抑制脂肪细胞分化。

2017年，朱才业利用选择信号检测方法，将每个显著的SNP位点向上下游各扩展50kb作为一个受选择的区域，在阿勒泰羊上检测出与脂肪相关的KLF3基因，为阿勒泰羊的分子育种提供了候选基因。Pértille等通过DNA测序及探针法检测了鸡KLF3基因的多态性，并与生长性状进行了关联分析，发现位于鸡4号染色体的KLF3基因的第一和第二内含子之间存在一个SNP位点T>C，并与内脏重和胴体重等性状显著相关(P<0.05)。

牛KLF3基因位于6号染色体上，有7个外显子，其基因全长为27143bp，编码346个氨基酸。目前KLF3基因在黄牛(例如，秦川牛)生长性能的标记辅助选择和新的优良品种的育种方面有少量研究报道，但KLF3因子对黄牛肉质性能的影响规律尚不清楚，亟需提出可以用于调控黄牛肌肉生长发育性状和牛肉品质的理论依据和实践途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛KLF3基因真核过表达载体的构建与应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种质粒型过表达载体，该表达载体为利用穿梭质粒构建的用于在牛体细胞(例如，牛肌肉细胞及其前体细胞、牛脂肪细胞及其前体细胞)中表达牛KLF3基因的重组载体。

优选的，所述重组载体是通过将穿梭质粒与克隆得到的外源性或内源性牛KLF3基因，利用双酶切法构建得到的。

优选的，所述穿梭质粒选自pcDNA3.1。

优选的，所述重组载体包括牛KLF3基因重组表达盒，牛KLF3基因重组表达盒包括CMV启动子以及位于该启动子下游的牛KLF3基因编码区(例如，序列如SEQ.ID.NO.1所示的秦川牛KLF3基因编码区)。

优选的，所述重组载体还包括原核氨苄抗性基因(可用于后续载体构建中的筛选)。

上述质粒型过表达载体的制备方法，包括以下步骤：

用高保真酶PCR扩增牛KLF3基因编码区序列，对PCR产物进行加A处理，然后连接到pMD-19T载体，然后将连接产物经转化、涂板(抗性筛选)后，挑取单克隆进行鉴定，得到重组载体pMD-19T-KLF3；将重组载体pMD-19T-KLF3和穿梭质粒(例如，pcDNA3.1载体)分别经KpnI和Xba I双酶切，将双酶切获得的牛KLF3基因编码区序列和线性化pcDNA3.1载体利用DNA连接酶进行连接反应，连接产物经转化、涂板(抗性筛选)后，挑取单克隆进行鉴定，得到重组载体pcDNA3.1-KLF3。

上述质粒型过表达载体在秦川牛等黄牛品种的KLF3基因功能鉴定中的应用。

优选的，在秦川牛等黄牛品种的KLF3基因功能鉴定中，将重组载体pcDNA3.1-KLF3转染从对应黄牛品种个体中分离的牛肌肉细胞(例如，牛原代肌肉细胞)，12-24h后检测该牛肌肉细胞中KLF3基因的mRNA和蛋白表达水平；同时，检测过表达KLF3基因后牛肌肉细胞增殖、分化标志基因(PCNA、CDK2、CyllnD1、MyoD、MyoG、MYHC)的表达情况。

上述质粒型过表达载体在细胞改造中的应用。

优选的，除了转染牛肌肉细胞，将重组载体pcDNA3.1-KLF3转染牛脂肪细胞、293细胞、C2C12细胞、3T3L细胞等细胞系。

上述质粒型过表达载体在体内或体外肌肉生长发育调控中的应用。

优选的，将重组载体pcDNA3.1-KLF3转染从对应黄牛品种个体中分离的牛肌肉细胞(例如，牛原代肌肉细胞)，在牛肌肉细胞中检测到KLF3基因过表达后继续对牛肌肉细胞进行培养，发现KLF3基因过表达可以促进肌细胞的分化，从而加快肌肉发育进程和再生。

本发明的有益效果体现在：

本发明构建了能够过表达牛KLF3基因的重组载体，本发明所构建的载体转染原代培养牛肌肉细胞等同源或异源宿主细胞后，可获得KLF3基因mRNA和KLF3蛋白在宿主细胞中的高效表达，为KLF3基因功能鉴定和改造细胞，及调控肌肉代谢和生长发育奠定基础。

进一步的，本发明发现pcDNA3.1在转染宿主细胞、引发过表达水平、标志基因激活能力等方面优于pcDNA3等其他载体骨架，通过选择的酶切位点，解决了载体骨架产生的发卡结构影响插入基因的表达效率的问题。

附图说明

图1为秦川牛KLF3基因PCR扩增产物电泳图；其中，泳道1为扩增产物，泳道M为D2000 Marker，条带分别为100、250、500、750、1000、2000bp。

图2为pMD-19T-KLF3重组质粒Kpn I和Xba I双酶切鉴定电泳图；其中，泳道1为酶切产物；泳道M为D15000 Marker，条带分别为250、1000、2500、5000、7500、10000、15000bp。

图3为pcDNA3.1-KLF3重组质粒Kpn I和Xba I双酶切鉴定电泳图；其中，泳道1为酶切产物，泳道M为D15000 Marker，条带分别为250、1000、2500、5000、7500、10000、15000bp。

图4为pcDNA3.1-KLF3重组质粒mRNA水平过表达效率检测结果(**P<0.01)。

图5为pcDNA3.1-KLF3重组质粒蛋白水平过表达效率检测结果；其中，以ACTB为内参基因。

图6为转染pcDNA3.1-KLF3重组质粒后肌肉细胞增殖(a/b/c)、分化(d/e/f)等肌肉发育过程标志基因mRNA检测结果(*P<0.05；**P<0.01)。

图7为转染pcDNA3.1-KLF3重组质粒后肌肉细胞增殖速率的EdU检测结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)质粒型重组过表达载体pcDNA3.1-KLF3的构建

1、材料和方法：

1.1、仪器：

超净工作台、生化培养箱、基因扩增仪、PTC-200单槽梯度基因扩增仪、Heraeus冷冻高速离心机(德国)、Bio-Rad凝胶成像分析仪(USA)、CO₂培养箱、HZS-H水浴振荡器(哈尔滨)、Eppendorf移液器、DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪(北京六一)、DYY-Ⅲ31A和DYY-Ⅲ28D电泳槽(北京六一)、制冰仪、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋)、Eppendorf台式高速离心机、Sartorious电子天平(德国)、常规冰箱等。

1.2、生化试剂和试剂盒：

Long Taq聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA限制性内切酶(Kpn I、Xba I等)、胶原蛋白、胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、DNA Marker、T4 DNA Ligase、Trizol、反转录试剂盒、表达载体(pMD-19T，Takara；pcDNA3.1(+)，Thermo)、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、胎牛血清等。

1.3、培养基：

1)抗性筛选

LB培养基：胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl，及琼脂粉；950mL去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用5mol/LNaOH调pH至7.0，加15g琼脂粉。

抗性：氨苄青霉素(1:100比例添加)。

2)细胞培养

DMEM完全培养基。

1.4、普通试剂：

肝素钠、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯菁FF、乙酸、蔗糖、去离子甲酰胺、硝酸、盐酸、硝酸银、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、硼酸、琼脂糖、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚(pH＝8.0)、氯仿、异戊醇、甘油、石蜡油。

1.5、秦川牛KLF3基因PCR引物的合成：

参照GenBank公布的KLF3基因mRNA序列(NM_174087.3)，设计扩增KLF3基因编码区的引物：

上游引物:5'>GGGGTACCACCAGAGCACCCTAGAAAGTAT<3'

下游引物:5'>GCTCTAGAGGAGGTGTTCACACGAGCAT<3'

其中，上、下游引物的下划线部分为Kpn I、Xba I酶切位点。

引物于2017年12月由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6、PCR扩增秦川牛的KLF3基因片段：

(1)、秦川牛肌肉组织cDNA获取

采集秦川牛肌肉组织(陕西秦宝牧业有限公司屠宰场，2019年3月)，利用Trizol法提取RNA，使用PrimeScript^TM反向转录RT试剂盒(Clontech,TaKaRa)，依据提取的RNA合成cDNA。

(2)、PCR反应体系为50μL，见表1：

表1.PCR反应体系

(3)、PCR反应程序，见表2：

表2.PCR反应程序

将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收扩增的KLF3基因片段。

1.7、pMD-19T-KLF3重组质粒的构建：

使用高保真酶PrimeSTAR扩增的KLF3基因片段无法进行TA克隆，需做加A处理，才可以连到pMD-19T载体上；因此对PCR扩增的KLF3基因片段进行加A反应(反应条件：72℃水浴，10分钟)，反应体系如表3所示；

表3.加A反应体系

将PCR扩增的KLF3基因片段经加A反应后，与pMD-19T载体经T4 DNA Ligase于16℃过夜连接，转化E.coli DH5α感受态细胞(西安擎科生物)，挑取菌落进行扩增，质粒回收后经Kpn I和Xba I双酶切鉴定(20μL酶切反应体系见表4，酶切消化条件：37℃，3-10h)，测序验证，得到携带KLF3基因的pMD-19T-KLF3质粒(即pMD-19T-KLF3重组质粒)。

表4.酶切反应体系

1.8、携带KLF3基因的pcDNA3.1-KLF3重组质粒的构建：

Kpn I和Xba I双酶切pMD-19T-KLF3重组质粒和pcDNA3.1质粒，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收后将KLF3基因编码区片段与pcDNA3.1质粒骨架，经T4 DNALigase 16℃过夜连接(25μL连接体系见表5)，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取菌落进行扩增，质粒回收后经Kpn I和Xba I双酶切鉴定，测序验证，得到pcDNA3.1-KLF3重组质粒。

表5.连接反应体系

2、结果：

2.1、KLF3基因PCR扩增结果：

以秦川牛肌肉组织cDNA为模板，参考NCBI上公布的牛KLF3基因mRNA序列(NM_174087.3)设计引物，利用PrimeSTAR DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物的电泳分析结果如图1所示，图1泳道1显示KLF3基因扩增产物为1120bp，即KLF3基因编码区(序列如SEQ.ID.NO.1所示)。

2.2、pMD-19T-KLF3重组质粒的酶切鉴定结果：

为了鉴定pMD-19T-KLF3重组质粒(即含有秦川牛KLF3基因编码区序列的阳性质粒)，以Kpn I和Xba I双酶切回收的质粒，经过琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，图2泳道1显示Kpn I和Xba I双酶切得到的KLF3基因编码区片段和pMD-19T骨架(2692bp)。

2.3、pcDNA3.1-KLF3重组质粒酶切鉴定结果：

为了鉴定pcDNA3.1-KLF3重组质粒(即含有秦川牛KLF3基因编码区序列的阳性质粒)，以Kpn I和Xba I双酶切回收的质粒，经过琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示，图3泳道1显示Kpn I和Xba I双酶切得到的KLF3基因编码区片段和pcDNA3.1骨架(5427bp)。

(二)KLF3基因在秦川牛肌肉细胞中的过表达

1、秦川牛肌肉细胞的原代培养

将胎牛置于操作盘中，以含有1％双抗(青霉素-链霉素)的无菌PBS冲洗3遍，沿着胎牛背脊切开表皮组织，剪出背肌，置于含有1％双抗的PBS(6cm培养皿)中，用剪刀尽量剪碎肌肉块，随后收集到50mL离心管中，加入胶原酶Ⅰ，37℃水浴消化1.5h后，用200目尼龙网过滤，收集滤液于离心管中，1000r/min离心10min，去除上清液，沉淀即为肌肉细胞，用含15％FBS及1％双抗的DMEM完全培养基重悬细胞，通过细胞计数，按60％比例接种细胞悬液于6cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中培养2h后，吸取上层培养液于新的6cm培养皿中继续培养，至细胞密度达到80％-90％左右，细胞传代或冻存以备后续实验用。

2、KLF3重组过表达载体转染牛肌肉细胞

当培养的秦川牛原代肌肉细胞密度达到60％，加入脂质体包裹的pcDNA3.1-KLF3重组质粒(按Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent试剂盒说明进行操作)转染细胞，经过实时定量PCR检测KLF3基因的表达情况，以及过表达KLF3基因(OV-KLF3)下肌肉细胞增殖标志基因(PCNA、CDK2、CyllnD1)和肌肉细胞分化标志基因(MyoD、MyoG、MYHC)在牛肌肉细胞中的表达情况；另外，利用Western-blot技术检测KLF3蛋白因子的表达情况。

3、结果

细胞转染后24h时，qRT-PCR检测证明，与阴性对照(Control)相比(阴性对照为pcDNA3.1(+)空载体，没有携带KLF3基因，简称NC)，KLF3基因mRNA及KLF3蛋白的表达量明显增加(图4及图5)。

通过检测增殖、分化相关标志基因的表达，表明在牛原代肌肉细胞中过表达KLF3可抑制肌细胞增殖，并促进其分化进程(图6)。即过表达KLF3基因使得肌肉细胞增殖、分化标志基因(MyoD、MyoG、PCNA、MYHC等)在牛肌肉细胞中差异表达。

(三)EdU试验检测细胞增殖

EdU检测试剂盒购买于广州锐博生物公司，按说明书步骤进行：

(1)细胞培养和转染：将牛肌原代细胞接种于96孔板当中，每孔(约1×10⁴个细胞)加入100μL DMEM完全培养基，当细胞密度达到70％左右，分别用pcDNA3.1-KLF3、pcDNA3.1(+)空载体转染细胞，转染后培养18-24h。

(2)EdU染色：每孔中加入100μL 50μmol/L浓度含EdU的培养基，孵育2h后去除培养基，PBS清洗细胞3次，每次3-5min。

(3)细胞固定：每孔加入50μL 4％多聚甲醛溶液进行固定，脱色摇床室温孵育30min后吸除，加入50μL甘氨酸溶液，同样室温孵育5min后弃除，PBS清洗细胞3次，每次3-5min。

(4)Apollo染色：每孔加入100μL的Apollo染色反应液，室温避光摇床上孵育30min，弃去后，加入100μL含0.5％Triton X-100的PBS溶液孵育3次，10min/次，弃去后，每孔加入100μL甲醛清洗2次，5min/次，再PBS清洗5min。

(5)DNA染色：每孔加入100μL 1×Hoechst33342反应液，室温避光摇床孵育30min后，弃除反应液，PBS清洗3次，5min/次。

(6)EdU成像：染色完立即使用荧光倒置显微镜观察成像，并进行细胞数目的分析。发现过表达KLF3后，DNA复制阳性细胞数目减少(相比于对照，图7)，即牛肌原代细胞增殖速率变缓。

(四)检测过表达KLF3基因对相应细胞结构和功能的影响，如小鼠C2C12细胞系，结果发现过表达KLF3后，可同样抑制细胞增殖，促进细胞分化。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种牛KLF3基因真核过表达载体的构建与应用

<160> 3

<210> 1

<211> 1120

<212> DNA

<213> 秦川牛

<400> 1

ggggtaccac cagagcaccc tagaaagtat aactaaaaga atgctcatgt ttgacccagt 60

ccctgtcaag caagaggcca tggaccctgt ctcggtgtca tacccgtcta attacatgga 120

gtcgatgaag cccaacaagt acggcgtcat ctactccacg ccattgtcgg ataagttctt 180

ccagacgccg gaaggcctgt ctcacgggat gcagatggag ccggtggacc tcacagtcaa 240

caagcggagc tcgccgccct cggccgggaa ctcgccgtcc tccctgaagt tccagtcctc 300

ccacaggcgc gcctcgcccg ggctgagcct gccctcgtcc agcccgccgg ggaagaagta 360

ctcgccgccg ccgccgcccg gcgtgcagcc cttcagcgtg ccgctgtcca tgccgccggt 420

gatggccgcg gccctgtccc gccacggcat ccggagcccg ggcatcctgc ccgtcatcca 480

gcccgtcgtc gtgcagcctg tccccttcat gtacaccagc cacctccagc agccgctcat 540

ggtctccttg tcggaggaga tggaaaattc cagtagtagc atgcaagtac ctgtaattga 600

atcatatgag aagcctatat tgcagaaaaa aattaaaata gaacctggga tcgaaccaca 660

gaggacagat tattatcccg aagaaatgtc acccccttta atgaactcag tgtccccccc 720

gcaagcattg ttgcggtgcc aagcacagtg cctggctcat ggaatcaccc ttcagtcatc 780

gtgcagcccg ggaagagacc tttacctgtg gaatccccag acacgcaaag gaagcggaga 840

atacacagat gtgattatga cggatgcaac aaagtgtaca ctaaaagctc tcacttgaaa 900

gcacacagaa gaacacatac aggagaaaaa ccctacaaat gtacgtggga aggatgcaca 960

tggaaatttg ctcggtctga tgaactcaca agacatttcc ggaaacacac tggaatcaaa 1020

cctttccagt gtccagactg tgaccgcagc ttctcccgct ccgaccacct tgctctgcac 1080

aggaagcgcc acatgctcgt gtgaacacct cctcaatctc 1120

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggtaccac cagagcaccc tagaaagtat 30

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctctagagg aggtgttcac acgagcat 28

Claims

1.一种质粒型过表达载体在细胞改造中的应用，其特征在于：该表达载体为利用穿梭质粒构建的用于在牛体细胞中表达牛KLF3基因的重组载体，所述牛体细胞选自牛肌原代细胞，转染后培养18-24h，进行细胞数目的分析，确定DNA复制阳性细胞数目，随着该数目减少即达到促进牛肌原代细胞分化目的。